Método para o isolamento e identificação de mRNAs, microRNAs e componentes proteicos de complexos de ribonucleoproteínas de extratos celulares utilizando RIP-Chip

O objetivo deste vídeo é demonstrar o método para o isolamento e identificação de RNAs e componentes proteicos de complexos ribonucleoproteicos a partir de extratos celulares usando métodos de imunoprecipitação. Olá, meu nome é Garrett Dom e sou estudante de pós-graduação no departamento de Microbiologia e Imunologia Molecular da Universidade de Missouri, estudando com o Dr.Eli sso. A partir do avanço no sequenciamento de alto rendimento e na análise eficiente de microarrays, a expressão e análise gênica global tornou-se uma forma fácil e prontamente disponível de coleta de dados em muitos modelos de pesquisa e doenças.

No entanto, os níveis de estado de estudo do mRNA do gene alvo nem sempre se correlacionam diretamente com os níveis de proteína no estado estacionário. A regulação gênica pós-transcricional é uma explicação provável da divergência entre os dois. Impulsionado pelas interações de proteínas de ligação ao RNA.

A regulação pós-transcricional afeta a localização, estabilidade e tradução do mRNA, formando um complexo de proteínas do núcleo da costela com mRNAs alvo. Identificar esses alvos desconhecidos de mRNA Denovo a partir de extratos celulares neste complexo é fundamental para entender os mecanismos e funções da proteína de ligação ao RNA e seu efeito resultante na produção de proteínas. Este protocolo descreve um método denominado riboproteína, imunoimunoprecipitação imunológica ou rip, que permite a identificação de mRNAs específicos associados ao complexo ribonucleoproteico.

Antes de iniciar o experimento, é fundamental ter todos os reagentes, recipientes e utensílios. Vidraria de tratamento livre de RNAs com inibidor de R nase, como RNA ZAP de ambion, seguido de enxágue com água tratada com dpci, garante que todos os reagentes sejam confirmados como livres de RNAs. O primeiro passo do procedimento é colher o complexo de proteína do núcleo da costela do lisado celular, colher células de tecido em crescimento exponencial para produzir entre dois a cinco miligramas de proteína total para cada amostra usada, geralmente duas placas de cultura P e 50 são suficientes.

Aqui estamos colhendo MB 2 31 e MC sete linhagens celulares de câncer de mama humano e investigando as interações do núcleo de ribon da proteína de ligação ao RNA. Quem são é importante observar que para cada proteína de ligação ao RNA que está sendo investigada, o número celular total e as quantidades de proteínas devem ser otimizados para maximizar as interações apropriadas de mRNA e proteína de ligação ao RNA. Células de pellets por centrifugação a 1000 RPM por aproximadamente oito a 10 minutos a quatro graus Celsius, depois lave três vezes com PBS gelado Após a lavagem final, sacuda suavemente o fundo do tubo e ressuspenda o pellet celular em volumes iguais de tampão de lise polissomal preparado com RNAs e inibidores de protease.

Recomenda-se medir o volume exato do pellet celular pipetar suavemente a mistura para quebrar aglomerados de células e incubar o lisado no gelo por cinco minutos. Centrifugue a 13.000 G por 20 minutos a quatro graus Celsius para limpar o lisado de detritos e transfira imediatamente o sobrenadante limpo para RNAs pré-resfriados. Os tubos de microcentrífuga gratuitos mantêm-se no gelo e armazenam a 80 graus Celsius negativos.

Este lisado pode ser armazenado por até seis meses a 80 graus Celsius negativos. Evite ciclos repetidos de congelamento e descongelamento, pois isso pode levar à degradação de proteínas e/ou mRNA. É melhor fazer o IP imediatamente.

Faça uma quantificação rápida da concentração de proteína e do lisado usando o ensaio de proteína Bradford padrão. Em seguida, precisaremos preparar os materiais para o isolamento de nossa proteína específica de interesse. Primeira proteína pré-inchaço.

Um Sphero grânulos durante a noite em N NT dois tampão suplementado com 5% BSA armazenar a quatro graus Celsius. Use o tampão NT dois em uma proporção de quatro para um com contas PAS. É possível o armazenamento a longo prazo de até vários meses a quatro graus Celsius.

Quando suplementado com 0,1% de azi de sódio antes do uso, remova o excesso de tampão NT dois para que a proporção final de grânulos para tampão seja de um para um. Usando tubos de microcentrífuga sem RNA de 1,5 mililitro, remova 100 microlitros de pasta de velocidade SRO e adicione 30 microgramas de anticorpo para cada reação IP individual. Por exemplo, em nosso experimento, usamos um anticorpo who re, que é um anticorpo IgG um de camundongo.

Portanto, nosso anticorpo de controle também é IgG. Em seguida, adicione 100 a 200 microlitros de tampão NT dois à mistura de esferas de anticorpos. Além disso, um anticorpo compatível com o isotipo ou soro normal inteiro da mesma espécie deve ser usado em paralelo como controle de anticorpos contra o RNA de fundo.

Adicione o anticorpo apropriado à mistura de grânulos e incube durante a noite, caindo sobre a extremidade a quatro graus Celsius. Prepare grânulos revestidos com anticorpos imediatamente antes do uso, lavando com um mililitro de NT gelado duas vezes tampão cinco vezes lave os grânulos por centrifugação a 13.000 G por um a dois minutos a quatro graus. Remova cuidadosamente o sobrenadante com pipetador manual ou aspirador.

Essa lavagem ajuda a remover anticorpos não ligados, bem como contaminantes de RNAs da mistura de anticorpos. Uma vez concluída a lavagem final, resus suspende os grânulos e 700 microlitros de tampão T dois gelados, seguido de tratamento com vários inibidores de RNAs para proteger os mRNAs alvo, incluindo 10 microlitros de RNAs, 10 microlitros de 100 DTT milimolar e 15 microlitros de EDTA. Traga o volume para 900 microlitros com NT dois buffer.

Em seguida, vamos imunoprecipitar o complexo alvo. Recomendamos fortemente o uso de uma etapa de pré-limpeza para reduzir o sinal de fundo em sua análise de RNA após o procedimento de rasgo pré-limpeza com 15 microgramas de controle de isotipo por 30 minutos a quatro graus Celsius. Adicione 50 microlitros de grânulos PAS pré-inchados não revestidos com anticorpos.

Incubar 30 minutos a quatro graus Celsius com rotação e em centrifugação a 10.000 G a quatro graus Celsius. Dois pellets. Salve o super natin para ip.

Em seguida, adicione 100 microlitros de lisado limpo isolado com aproximadamente dois a cinco miligramas de proteína à mistura de anticorpos preparada. A diluição do lisado ajudará a reduzir o tubo de envoltório de fundo e a paraforma para garantir um teto apertado e incubar a quatro graus Celsius por quatro horas, tombando e nos próximos grânulos de pellets a 5.000 G por cinco minutos a quatro graus Celsius e economizando supernat para análise de potencial, armazenando a menos 80 graus Celsius, conforme descrito anteriormente. Lave as contas cinco vezes com um mililitro de gelo frio e T dois tampão e centrifugação.

Em seguida, remova o super natin com pipetador manual ou aspirador. Métodos mais rigorosos podem ser usados para reduzir o fundo, suplementando o tampão NT dois com recato de desoxi de sódio, uma urinária ou SDS. Mantenha as amostras no gelo o máximo possível e trabalhe rapidamente para minimizar a degradação do mRNA alvo.

Por fim, utilizaremos tratamentos com DNAs e proteinase K seguidos de precipitação de RNA para isolar os RNAs da proteína nuclear do ribon após a lavagem ressuspender grânulos com 100 microlitros de N NT dois tampão suplementado com cinco microlitros de RNAs DNAs livres um. Mantenha as amostras a 37 graus Celsius por cinco a 10 minutos. Adicione um mililitro de N NT dois tampão e gire a 5.000 G por cinco minutos.

Descarte a proteína de spin SUPERNAT Reese, um pellet SROs e 100 microlitros de NT, dois tampão com cinco microlitros de proteinase K a 10 miligramas por mililitro e um microlitro de 10% SDS incubar a mistura de esferas ressuspensas por 30 minutos em banho-maria a 55 graus Celsius, sacudindo suavemente a cada 10 minutos. A proteinase K ajudará na liberação dos componentes da proteína do núcleo da costela. Contas de pellets.

Adicione 5.000 G por cinco minutos em temperatura ambiente, colete o super nome, que deve ter aproximadamente 100 microlitros de volume. Em seguida, adicione 200 microlitros de NT duas centrífugas tampão a 5.000 G por dois minutos. Colete aproximadamente 200 microlitros de super natin e descarte as contas.

Combine o super natin e adicione 300 microlitros de vórtice de fenol ácido da camada inferior. Um minuto à temperatura ambiente e centrifugue a velocidade máxima à temperatura ambiente durante um minuto. Colete 250 microlitros de camada superior.

Tenha muito cuidado para não perturbar a interface, pois isso irá contaminar. Amostra de RNA adiciona 25 microlitros de acetato de sódio a pH de 5,2 625 microlitros de mistura gelada, 100% etanol e cinco microlitros de mistura de azul de glico. Bem armazene durante a noite a menos 20 graus Celsius.

Além disso, para garantir a recuperação adequada do RNA. A adição de azul de glico aumentará a visibilidade do pellet de RNA, agindo como uma molécula transportadora no dia seguinte, tubos mistos invertendo de três a cinco vezes, depois girando a 12.000 G a quatro graus Celsius por 30 minutos e descartando o super natin. Adicione um mililitro de etanol 70% resfriado ao pellet azul e misturado por centrífuga de inversão ou vórtice.

Amostra a 12.000 G a quatro graus Celsius por dois minutos. Rejeitar o supernat e centrifugar a 12 000 g durante um minuto a quatro graus Celsius. Remova qualquer resíduo, 70% de etanol com uma pipeta e um pellet seco ao ar.

Adicione a temperatura ambiente por cinco minutos. Regastar em 20 a 40 microlitros de RNAs, água livre de DNA. A amostra está agora pronta para quantificação por espectrometria NanoDrop e outras aplicações a jusante, como PCR quantitativo em tempo real ou análise de microarray após isolamento de RNA, microarray e PCR quantitativo em tempo real foram realizados para revelar os alvos de mRNA da proteína de ligação ao RNA que são, e seu enriquecimento resultante da imunoprecipitação.

A confirmação por western blot revela um isolamento limpo de quem é proteína. A PCR quantitativa demonstra o enriquecimento dobrado da actina beta alvo do mRNA em comparação com os controles IgG one. Embora a análise de microarray revele perfis genéticos únicos entre MC seven e MB 2 31, a imunoprecipitação geral de proteínas do núcleo da costela das linhagens de células de câncer de mama foi estabelecida como uma excelente ferramenta usada para isolar e estudar as interações entre as proteínas de ligação ao RNA e seu MR. Um alvo do nosso grupo, bem como de muitos outros grupos de pesquisa, embora sensíveis na natureza e na prática, a execução adequada desse procedimento resultará no isolamento desses complexos de proteínas do núcleo da costela, que até recentemente eram inacessíveis para descoberta e análise.