Método para o isolamento e identificação de mRNAs, microRNAs e componentes proteicos de complexos de ribonucleoproteínas de extratos celulares utilizando RIP-Chip

O objetivo deste vídeo é demonstrar o método para o isolamento e identificação de componentes de RNA e proteínas de complexos ribonucleoproteicos a partir de extratos celulares, utilizando métodos de imunoprecipitação. Olá, meu nome é Garrett Dom e sou aluno de pós-graduação no departamento de Microbiologia Molecular e Imunologia da Universidade de Missouri, realizando estudos sob a orientação da Dra. Eli Sso. Com os avanços no sequenciamento de alto rendimento e na análise eficiente de microarranjos, a expressão gênica global e sua análise tornaram-se formas fáceis e amplamente disponíveis de coleta de dados em diversos modelos de pesquisa e de doenças.

No entanto, o estudo dos níveis de estado estacionário do mRNA do gene alvo nem sempre se correlaciona diretamente com os níveis estáveis de proteína. A regulação gênica pós-transcricional é uma explicação provável para a divergência entre os dois, impulsionada pelas interações de proteínas que se ligam ao RNA.

A regulação pós-transcricional afeta a localização, estabilidade e tradução do mRNA ao formar um complexo ribonucleoproteico com mRNAs-alvo. A identificação desses alvos de mRNA Denovo desconhecidos em extratos celulares nesse complexo é fundamental para compreender os mecanismos e funções da proteína ligadora de RNA e seus efeitos resultantes na produção proteica. Este protocolo descreve um método denominado ribo proteína, imunoprecipitação imuno ou rip, que permite a identificação de mRNAs específicos associados ao complexo ribonucleoproteico.

Antes de iniciar o experimento, é essencial ter todos os reagentes, recipientes e utensílios. Trate vidraria livre de RNAses com inibidor de RNaseses, como o RNA ZAP da ambion, seguido por enxágue com água tratada com dpci, garantindo que todos os reagentes sejam confirmados como livres de RNAses. O primeiro passo do procedimento é colher o complexo ribonucleoproteico do lisado celular: colha células de tecido em crescimento exponencial para produzir entre dois a cinco miligramas de proteína total para cada amostra utilizada; normalmente, duas placas de cultura P um 50 são suficientes.

Aqui estamos colhendo as linhagens celulares humanas MB 2 31 e MC sete de câncer de mama e investigando as interações ribonucleoprotéicas da proteína ligadora de RNA. É importante observar que, para cada proteína ligadora de RNA em estudo, o número total de células e as quantidades de proteína devem ser otimizados para maximizar as interações apropriadas entre o mRNA alvo e a proteína ligadora de RNA. Pelotizar as células por centrifugação a 1000 RPM por aproximadamente oito a 10 minutos a quatro graus Celsius, depois lavar três vezes com PBS gelado. Após a lavagem final, agitar suavemente o fundo do tubo e ressuspender o pellet celular em volumes iguais do tampão de lise de polissomos preparado com inibidores de RNAses e proteases.

Recomenda-se medir o volume exato do pellet celular, pipetar suavemente a mistura para dissociar agregados de células e incubar o lisado em gelo por cinco minutos. Centrifugue a 13.000 ×g por 20 minutos a quatro graus Celsius para remover os detritos do lisado, transfira imediatamente o sobrenadante clarificado para tubos microcêntricos pré-resfriados de RNAs Free, mantenha-os em gelo e armazene a menos 80 graus Celsius.

Este lisado pode ser armazenado por até seis meses a menos 80 graus Celsius. Evite ciclos repetidos de congelamento e descongelamento, pois isso pode levar à degradação de proteínas e/ou mRNA. O ideal é realizar a IP imediatamente.

Realize uma quantificação rápida da concentração de proteína e do lisado utilizando o ensaio padrão de proteína de Bradford. Em seguida, precisaremos preparar os materiais para o isolamento da nossa proteína específica de interesse. Primeiro, pré-hidrate a proteína.

Incubar esferas Sphero durante a noite em tampão NT2 suplementado com 5% de BSA a quatro graus Celsius. Utilizar o tampão NT2 numa proporção de quatro para um com as esferas PAS. Pode-se armazenar por longo prazo, por vários meses, a quatro graus Celsius.

Quando suplementado com 0,1% de azida de sódio antes do uso, remova o tampão NT dois em excesso para que a proporção final entre as microesferas e o tampão seja de um para um. Usando tubos microcentrífugos de 1,5 mililitro livres de RNase, remova 100 microlitros da suspensão SRO e adicione 30 microgramas de anticorpo para cada reação individual de IP. Por exemplo, em nosso experimento, utilizamos um anticorpo who are, que é um anticorpo IgG de camundongo um.

Portanto, nosso anticorpo controle também é IgG. Em seguida, adicione de 100 a 200 microlitros de tampão NT2 à mistura de anticorpo e microesferas. Além disso, um anticorpo com isotipo correspondente ou soro normal total da mesma espécie deve ser usado em paralelo como controle de anticorpo contra o RNA de fundo.

Adicione o anticorpo apropriado à mistura de microesferas e incube sob agitação rotativa durante a noite a quatro graus Celsius. Prepare as microesferas recobertas com anticorpo imediatamente antes do uso, lavando-as com um mililitro de tampão NT2 gelado cinco vezes; lave as microesferas por centrifugação a 13.000 ×g por um a dois minutos a quatro graus. Remova cuidadosamente o sobrenadante com pipetador manual ou aspirador.

Esta lavagem ajuda a remover o anticorpo não ligado, bem como contaminantes de RNA da mistura de anticorpos. Após a conclusão da lavagem final, ressuspenda as microesferas em 700 microlitros de tampão T2 gelado, seguido pelo tratamento com vários inibidores de RNA para proteger os RNAm-alvo, incluindo 10 microlitros de RNAse, 10 microlitros de DTT 100 milimolar e 15 microlitros de EDTA. Complete o volume para 900 microlitros com tampão NT2.

Em seguida, realizaremos a imunoprecipitação do complexo alvo. Recomendamos enfaticamente o uso de uma etapa de pré-limpeza para reduzir o sinal de fundo na análise de RNA após o procedimento de RIP: pré-limpe com 15 microgramas de controle de isotipo por 30 minutos a quatro graus Celsius. Adicione 50 microlitros de microesferas PAS pré-infladas não revestidas com anticorpo.

Incubar por 30 minutos a quatro graus Celsius com rotação e posteriormente em centrífuga a 10.000 G a quatro graus Celsius. Dois pellets. Guardar o sobrenadante para IP.

Em seguida, adicione 100 microlitros do lisado isolado clarificado com aproximadamente dois a cinco miligramas de proteína à mistura de anticorpos preparada. A diluição do lisado ajudará a reduzir o fundo; enrole o tubo com parafilm para garantir um fechamento hermético e incube a quatro graus Celsius por quatro horas em rotação, depois centrifugue a 5.000 ×g por cinco minutos a quatro graus Celsius e guarde o sobrenadante para possível análise, armazenando-o a menos 80 graus Celsius conforme descrito anteriormente. Lave as microesferas cinco vezes com um mililitro de tampão T2 gelado e centrifugação.

Em seguida, remova o sobrenadante com uma pipeta manual ou um aspirador. Métodos mais rigorosos podem ser utilizados para reduzir o fundo, suplementando o tampão NT2 com desoxicolato de sódio, uréia ou SDS. Mantenha as amostras no gelo tanto quanto possível e trabalhe rapidamente para minimizar a degradação do mRNA alvo.

Por fim, utilizaremos tratamentos com DNAse e proteinase K seguidos por precipitação de RNA para isolar os RNAs de proteínas nucleares de ribonucleoproteínas após lavar e ressuspender as pérolas com 100 microlitros de tampão N NT dois suplementado com cinco microlitros de DNAse livre de RNAses um. Mantenha as amostras a 37 graus Celsius por cinco a 10 minutos. Adicione um mililitro de tampão N NT dois e centrifugue a 5.000 ×g por cinco minutos.

Descarte o sobrenadante, re-suspenda o pellet de proteína SROs em 100 microlitros de tampão NT2 com cinco microlitros de proteinase K a 10 miligramas por mililitro e um microlitro de SDS a 10%. Incube a mistura de perlas re-suspensas por 30 minutos em banho-maria a 55 graus Celsius, agitando suavemente a cada 10 minutos. A proteinase K auxiliará na liberação dos componentes ribonucleoproteicos. Peliculize as perlas.

Adicione 5.000 ×g por cinco minutos à temperatura ambiente, colete o sobrenadante, que deve ter aproximadamente 100 microlitros de volume. Em seguida, adicione duas esferas, acrescente 200 microlitros do tampão NT2 e centrifugue a 5.000 ×g por dois minutos. Colete aproximadamente 200 microlitros do sobrenadante e descarte as esferas.

Misture o super natin e adicione 300 microlitros de ácido fenol da camada inferior com vortex. Incube por um minuto à temperatura ambiente e centrifugue na velocidade máxima à temperatura ambiente por um minuto. Colete 250 microlitros da camada superior.

Tenha muito cuidado para não perturbar a interface, pois isso causará contaminação. Adicione à amostra de RNA 25 microlitros de acetato de sódio em pH 5,2, 625 microlitros de etanol gelado a 100% e cinco microlitros de glicoazul; misture bem e armazene durante a noite a menos 20 graus Celsius.

Além disso, para garantir a recuperação adequada do RNA. A adição de glicoazul aumentará a visibilidade do pellet de RNA ao atuar como uma molécula carreadora no dia seguinte, misture os tubos invertendo de três a cinco vezes, em seguida centrifugue a 12.000 ×g a quatro graus Celsius por 30 minutos e descarte o sobrenadante. Adicione um mililitro de etanol a 70% gelado ao pellet azul e misture por inversão ou vortex, depois centrifugue.

Centrifugue a amostra a 12.000 G a quatro graus Celsius por dois minutos. Descarte o sobrenadante e centrifugue a 12.000 G por um minuto a quatro graus Celsius. Remova qualquer resíduo de etanol 70% com uma pipeta e seque o pellet ao ar.

Adicione temperatura ambiente por cinco minutos. Reconstitua em 20 a 40 microlitros de água livre de RNAses e DNAses. A amostra está agora pronta para quantificação por espectrometria NanoDrop e aplicações downstream subsequentes, como PCR quantitativa em tempo real ou análise por microarranjo, após o isolamento de RNA, microarranjo e PCR quantitativa em tempo real terem sido realizados para revelar os alvos de mRNA da proteína ligadora de RNA who, e seu enriquecimento resultante a partir da imunoprecipitação.

A confirmação por western blot revela o isolamento limpo da proteína de interesse. A PCR quantitativa demonstra o enriquecimento relativo do alvo de mRNA beta actina em comparação com os controles de IgG. Embora a análise por microarray revele perfis genéticos únicos entre as linhagens celulares de câncer de mama MC7 e MB231, a imunoprecipitação de ribonucleoproteínas tem sido estabelecida como uma excelente ferramenta utilizada para isolar e estudar as interações entre proteínas que ligam RNA e seus alvos de mRNA, por nosso grupo, bem como por muitos outros grupos de pesquisa. Apesar de ser sensível por natureza e na prática, a execução adequada deste procedimento permitirá o isolamento desses complexos de ribonucleoproteínas, os quais, até recentemente, eram inacessíveis para descoberta e análise.