Name: Isolamento de cromatina por purificação de RNA (CHIRP) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Aprenda a técnica ChIRP para mapear sítios de ligação de lncRNAs no genoma usando oligonucleotídeos antisense biotinilados. Este método oferece resolução próxima ao par de bases para estudar regulação gênica.

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Agradecemos T. Hung, MC. Tsai, O. Manor, E. Segal, M. Kuroda, T. Swigut, e I. Shestopalov para as discussões. Apoiado pela Agência de Ciência, Tecnologia e Pesquisa de Cingapura (CC), NIH-R01 e R01 CA118750-HG004361 (HYC), e do Instituto de Medicina Regenerativa da Califórnia (HYC). HYC é um cientista de carreira precoce do Howard Hughes Medical Institute.

1. Projeto Sonda Design DNA anti-senso de lado a lado sondas para a recuperação seletiva de RNA alvo por piar. <ol><li> Projeto sondas anti-senso oligo usando o designer sonda on-line em <a href="http://singlemoleculefish.com">singlemoleculefish.com</a> 18. </li><li> Use esses parâmetros: número de sondas = 1 / sonda de 100 pb de comprimento RNA, 2) Alvo% GC = 45, comprimento Espaçamento 4) = 60-80; 3) Comprimento Oligonucleotide = 20. Quebre RNA em segmentos se muito tempo para o designer. Omitir regiões de repetições ou homologia extensa. </li><li> Ordem sondas anti-senso de DNA com BiotinTEG em 3-primeiro-final. </li><li> Sondas etiqueta de acordo com as suas posições ao longo do RNA. Separá-los em dois grupos para que a piscina &quot;, mesmo&quot; contém todas as sondas de numeração 2, 4, 6, etc, e na piscina &quot;estranho&quot; contém sondas de numeração 1, 3, 5, etc Diluir pool de sondas para concentração de 100 mM e armazenar a -20 ° C. </li><li> Todas as experiências são para ser feita usandoambas as caixas, que servem como controles internos para o outro. Sinal dependente de ARN real estaria presente em ambos os pools, enquanto sonda específicas ruídos seria único para cada pool. Isto aplica-se tanto para CHIRP-qPCR e CHIRP-seq. </li></ol> 2. Células Colheita Recolher células que serão usados ​​para a experiência CHIRP. <ol><li> Crescer as células em placas de cultura de tecidos ou frascos até à confluência. Lavar com salina tamponada com fosfato (PBS) e uma vez trypsinize. Têmpera de tripsina com&gt; volume 2x de mídia, pipeta cima e para baixo para retirar as células e ressuspender em suspensão de células individuais. Transferir todos os meios e as células ressuspensas em tubos de 50 ml Falcon. 20 milhões de células são tipicamente suficiente para uma amostra CHIRP. </li><li> Girar em células 800RCF durante 4 min. Meios aspirado e ressuspender 40 milhões de células em 40 ml de PBS, combinar os tubos, se necessário. Girar em células 800RCF durante 4 min. Decantar PBS, aspirar cuidadosamente sobre um ângulo que o líquido restante. </li></ol&gt; 3. Cross-link células e recolher pellet celular Crosslink coletadas células com glutaraldeído para preservar RNA-cromatina interações e preparar pellet celular. <ol><li> Execute todas as etapas à temperatura ambiente. </li><li> Prepare glutaraldeído 1% em PBS à temperatura ambiente. Preparar 10 ml por 10 milhões de células (0,4 ml de caldo de glutaraldeído a 25% + 9,6 mL de PBS). O glutaraldeído deve ser utilizado fresco. </li><li> Toque fundo de tubos Falcon de desalojar pelotas. Ressuspender o sedimento de células em glutaraldeído a 1%, começando com um pequeno volume para evitar pedaços, em seguida, o início até ao volume total. Inverta para misturar. Reticulação durante 10 min à temperatura ambiente num agitador de ponta a ponta ou rotador. </li><li> Extingue-se a reacção de reticulação com um volume de 1/10th de 1,25 M de glicina, à temperatura ambiente durante 5 min. </li><li> Girar em 2000RCF durante 5 min. Aspirar o sobrenadante e lava-pelete com 20 mL de PBS gelado uma vez, girando a 2000RCF durante 5 min. </li><li> Aspirar e ressuspender o wincinerada, reticulada pelete com 1 ml de PBS, refrigerada por 20 milhões de células. Transfira cada ml a um tubo Eppendorf e giram a 2000RCF durante 3 min a 4 ° C. Remover PBS, tanto quanto possível, com a ponta da pipeta com cuidado. </li><li> Flash-congelar os peletes de células em azoto líquido e armazenada a -80 ° C indefinidamente. </li></ol> 4. Lise Celular Lisar células reticulados para preparar lisado celular. <ol><li> Descongelar sedimentos celulares congelados à temperatura ambiente. Toque difícil desalojar e misturar o pellet celular. Girar para baixo o sedimento em 2000RCF durante 3 min a 4 ° C. Use uma forte ponta da pipeta 10 ul para remover qualquer PBS restante. </li><li> Em uma balança eletrônica (precisão de 1 mg) tara de um tubo de Eppendorf vazio (os nossos tubos de pesar 1.060 gramas muito consistente). Pese cada pellet e gravar o seu peso. Um prato centímetros completa 15 de células HeLa reticulados tipicamente pesa 100 mg. </li><li> Tampão de Lise suplemento (massa 10X de pellet, por exemplo, 1 ml para 100 mg) com fresh inibidor da protease, PMSF e Superase-in (veja a lista de tampão em anexo). Misture bem. </li><li> Adicionar 10X volume de Tampão de Lise completado, para cada tubo e ressuspender o sedimento. Para as pelotas pequenas &lt;25 mg, ressuspender em 250 ul de tampão de lise suplementado. Suspensão deve ser suave. Se não, dividir suspensão em 500 uL alíquotas e usar uma motorizada pelete misturador para quebrar grumos. Proceder de imediato à sonicação. </li></ol> 5. Sonicação DNA de cisalhamento por sonicando lisados ​​de células reticuladas. <ol><li> Sonicar lisado celular em Bioruptor em 15 tubos Falcon ml. Use &lt;1,5 lisado ml em cada tubo, e para mais rapidamente sonicação, sonicar não mais do que dois tubos de cada vez. </li><li> Sonifique em um banho de água 4 ° C a mais alta definição com 30 segundos, 45 segundos OFF intervalos de pulso. Verifique lisado cada 30 min. Continuar sonicando até que o ligado celular não é mais turvo. Isso pode demorar tão pouco como 30 minutos e até 4 horas. O númerode tubos, o volume da amostra, a temperatura do banho, eo período de tempo de sonicação irá afectar o tempo que o processo leva. Tubos provavelmente sonicar em taxas diferentes, de modo juntam-los em conjunto a cada 30 min e redistribuir em tubos originais para assegurar a homogeneidade. Nota: o glutaraldeído-reticulado células demorar muito mais para sonicate do que seus equivalentes de formaldeído. </li><li> Quando lisado transforma claro, transferir 5 uL lisado para um novo tubo Eppendorf. Adicione 90 uL de DNA de proteases K (PK) Buffer (ver lista buffer) e 5 PK uL. Vortex para misturar e girar rapidamente. Incubar durante 45 min a 50 ° C. </li><li> Extrair DNA com Qiagen kit de purificação PCR. Eluir o DNA em 30 uL Tampão eluição Qiagen (EB) e verificar o tamanho do DNA em 1% gel de agarose. Se grandes quantidades de DNA é o esfregaço 100-500 pb, sonicação está completa. Se não, continuar a sonicate. </li><li> Centrifugue as amostras sonicadas em 16100RCF durante 10 min a 4 ° C. Combine sobrenadantes, alíquotas em amostras de 1 ml e congelar-in Flash nitroge líquidon. Armazenar a -80 ° C. </li></ol> 6. CHIRP Hibridizar sondas de DNA biotiniladas para o RNA e isolar cromatina ligada. <ol><li> Tubos de descongelamento de cromatina à temperatura ambiente. </li><li> Preparar o tampão de hibridação (ver lista de buffer, prepare 2 ml por ml de cromatina). Vórtice para misturar. </li><li> Para uma amostra CHIRP típico usando 1 ml de lisado, remover 10 uL para RNA INPUT e 10 uL de ADN para INPUT e local em tubos de Eppendorf. Manter em gelo até posterior utilização. </li><li> Transferir 1 cromatina mL a 15 mL tubo Falcon. Adicionar 2 mL Tampão de Hibridização a cada tubo. Para o volume total &lt;1,5 ml, utilizar tubos Eppendorf. </li><li> Descongele sondas à temperatura ambiente. Nanodrop sondas para verificar quantidade se você não tê-lo usado em um longo tempo (100 sondas iM deve especificação ~ 500-600 ng / ul usando configuração DNA de cadeia simples). Adicionar volume apropriado de sondas específicas para os tubos (100 pmol por sonda 1 mL da cromatina, 1 uL de 100 sonda pmol / uL por 1 mL de cromatina).Misture bem. Incubar a 37 ° C durante 4 horas com agitação. </li><li> Com 20 min restante para a hibridação, preparar os grânulos C-1 magnéticos (armazenada a 4 ° C). Use de 100 L por 100 pmol de sondas. Lava-se com 1 mL Tampão de Lise não suplementado três vezes, utilizando a tira de íman DynaMag-2 a esferas separadas a partir de tampão. </li><li> Contas Ressuspender em volume original de tampão de lise e Suplemento com PMSF fresco, PI e Superase-in. Após 4 h de reacção de hibridação está completa, adicionar 100 grânulos uL a cada tubo. Misture bem. Incubar a 37 ° C durante 30 min com agitação. </li><li> Preparar tampão de lavagem (5 mL por amostra). Vórtice para misturar. Pré-aquecido a 37 ° C. Adicionar PMSF antes da utilização. </li><li> Lavar grânulos com 1 mL de tampão de lavagem por cinco vezes. Na primeira lavagem, utilizar-15 DynaMag tira magnética a esferas separadas, decantar, e ressuspender em 1 mL de tampão de lavagem. Transferir volume para tubo Eppendorf de 1,5 mL. Incubar a 37 ° C com agitação durante 5 min. </li><li> Em lavagens subseqüentes, girar cada tubo em um minicentrifuge, Definir amostra em DynaMag-2 tira magnética durante 1 min. Decantar amostra, seque os pingos com um Kimwipe, ressuspender em 1 ml de tampão de lavagem. Incubar a 37 ° C com agitação durante 5 min. Repetir para cinco lavagens totais. </li><li> Na última lavagem, ressuspender as esferas bem. Retirar 100 uL e reserve para o isolamento de RNA. Reserve uL 900 para fração de DNA. Coloque todos os tubos em DynaMag-2 fita magnética e remover o tampão de lavagem. Gire todos os tubos para baixo brevemente; colocá-los na faixa ímã. Retire o último pedaço de tampão de lavagem completamente com uma afiada ponta de pipeta 10 ul. </li></ol> 7. RNA Isolation Extrair fracção de ARN a partir de amostras Chirp para quantificar por qRT-PCR. <ol><li> Tome 100 l amostras de contas e 10 amostra de entrada uL RNA. Adicionam-se 85 uL RNA tampão pH 7,0 PK para o RNA INPUT. Contas Ressuspender em 95 uL de RNA PK pH 7,0. Adicionar 5 K Proteinease uL e incubar a 50 ° C durante 45 min com ponta a ponta de agitação. </li><li> Resumidamente girar todos os tubos eferver amostras durante 10 min em bloco de aquecimento a 95 ° C. </li><li> Arrefeça amostras em gelo, adicionar 500 uL TRIzol vórtice, vigorosamente, durante 10 seg. Incubar a temperatura ambiente durante 10 min. Conservar a -80 ° C ou vá para a etapa 4. </li><li> Adicionar 100 uL de clorofórmio para TRIzol amostras tratadas. Vortex vigorosamente durante 10 seg. Girar em 16100RCF numa centrífuga de bancada durante 15 min a 4 ° C. </li><li> Remover ~ 400 uL sobrenadante aquoso, evitando orgânica e de interface. </li><li> Adicionar 600 uL (1,5 de volume) de etanol a 100% e misturar bem. Centrifugue a amostra através MIRNeasy colunas mini. Lave 1x com ERP (MIRNeasy mini-kit), 2x por RPE com o protocolo do fabricante. Eluir com 30 uL sem nuclease H2O (NFH 2 O). </li><li> Tratar o produto de eluição com a DNA-RNA livre por protocolo do fabricante. Após a reacção está completa, aquecer a amostra durante 15 minutos a 65 ° C para inactivar qualquer completamente DNase restante. </li><li> Use 1 RNA isolado por microlitro bem para qRT-PCR para confirmar lncRNArecuperação. GAPDH é frequentemente utilizado como um controlo negativo. </li></ol> 8. Isolamento de DNA Extrair DNA de amostras de fração Chirp para identificar por seqüenciamento ou quantificar por qPCR. <ol><li> Preparar o tampão de eluição DNA (ver lista de buffer), 150 ul por amostra, incluindo entrada DNA. </li><li> Adicionar 1 0μL RNase A (10 mg / mL) e 10 uL de RNase H (10 U / ul) por ml de tampão de eluição de DNA, e vórtice para misturar. </li><li> Ressuspender cada amostra de grânulos em 150 uL de Tampão de Eluição com DNA RNases. (Ressuspender ENTRADA DNA em 140 uL) Incubar a 37 ° C durante 30 min com agitação. </li><li> Contas separadas e sobrenadante em DynaMag-2 tira magnética. Remover o sobrenadante e adicionar aos tubos etiquetados. </li><li> Prepara-se uma segunda alíquota de tampão de eluição de ADN com 10 uL de RNase A (10 mg / mL) e RNaseH (10 U / mL) exactamente como é feito em 8,2). Adicionar 150 uL de cada amostra (incluindo entrada do ADN), incubar e remover o sobrenadante. Colete todos sobrenadante (should ser ~ uL 300). </li><li> Adicionar 15 PK uL de cada amostra. Incubar a 50 ° C durante 45 min com agitação. </li><li> Pré-girar amarelo tubos fase de bloqueio de gel (5PRIME). Transferir as amostras de DNA a tubos de bloqueio de fase de gel, e adicionam-se 300 uL PhOH: Clorofórmio: isoamilo por amostra. Agita-se vigorosamente durante 10 min, e girar para baixo em uma centrífuga de bancada a 16100RCF durante 5 min a 4 ° C. Tome aquosa a partir do topo (~ uL 300). Adicionar 3 GlycoBlue uL, 30 NaOAc uL, e 900 uL de EtOH a 100%. Misture bem e armazenar a -20 ° C durante a noite. </li><li> Girar amostras a 16100RCF durante 30 min a 4 ° C. </li><li> Decante o sobrenadante cuidadosamente. Adicionar 1 mL de EtOH a 70% e vórtice para misturar. Girar em 16100RCF durante 5 min. Remover o sobrenadante com uma pipeta. Deixe secar por 1min. Ressuspender em 30 uL EB. </li><li> Amostras de DNA está pronto para análise por qPCR ou preparação de bibliotecas de alto rendimento de sequenciamento por protocolo Illumina. </li></ol> 10. Os resultados representativos A Figura 1 </strong&gt; descreve o fluxo de trabalho piar. Uma experiência CHIRP bem sucedida tipicamente enriquece RNA alvo significativamente ao longo do não-específicos RNAs. A Figura 2 mostra o enriquecimento de humano telomerase RNA (TERC) a partir de células HeLa sobre GAPDH, um RNA abundantes celulares que serve como um controlo negativo. Maioria dos RNAs TERC (~ 88%) presentes na célula foram puxados para baixo através da realização de CHIRP, enquanto que apenas 0,46% de GAPDH RNA foi recuperado, demonstrando um factor de enriquecimento de ~ 200 vezes. Sondas inespecíficas, tais como sondas de segmentação LacZ RNA, que não se expressa em células de mamíferos (Figura 2), pode ser usado como adicionais controlos negativos. Regiões de ADN que se espera que se ligam a lncRNA alvo são tipicamente enriquecida ao longo de regiões negativas, quando medido por qPCR. A Figura 3 mostra qPCR validação de quatro hotair ligados a sítios em fibroblastos de prepúcio humanos primários que determinados através da realização de CHIRP-seq na mesma linha celular, enquanto TERC e GAPDH DNA sítios siRVE como regiões de controlo negativo. Tanto o &quot;mesmo&quot; ea sonda &quot;estranha&quot; define rendeu enriquecimento comparável de espera hotair ligados sites sobre regiões negativas, marca registrada dos verdadeiros lncRNA sítios de ligação. Alta capacidade de seqüenciamento de DNA CHIRP enriquecido produz um mapa global de lncRNA sítios de ligação. A Drosophila lncRNA roX2 é conhecido para interagir com o cromossoma X de uma maneira que é necessária para a compensação de dosagem. A Figura 4 mostra roX2 perfil de ligação ao longo de um secção do cromossoma X. Tanto o &quot;mesmo&quot; e &quot;estranha&quot; as amostras já foram seqüenciados e seus ruídos originais foram eliminados para produzir uma faixa de sinais que se sobrepõem. Cada &quot;pico&quot; aqui indica um site de forte roX2 vinculativo. A faixa completa ea lista de roX2 genes alvo têm sido descritas na Chu et ai. 2011 17. <img alt="Figura 1." src="/files/ftp_upload/3912/3912fig1.jpg" /> Figura Fluxograma 1. Do procedi CHIRPDure. Cromatina é reticulado para lncRNA: aductos de proteína in vivo biotinilados sondas azulejos são hibridizados para alvejar lncRNA, e os complexos de cromatina são purificados utilizando esferas de estreptavidina magnéticos, seguido por lavagens rigorosas.. Nós eluir lncRNA DNA ligado ou proteínas com um coquetel de RNase A e H. A seqüência lncRNA suposta ligação está esquematizado na laranja. Anteriormente publicado em Chu et ai. 2011. 17 <img alt="Figura 2." src="/files/ftp_upload/3912/3912fig2.jpg" /> Enriquece a Figura 2. Chirp para o homem TERC RNA. TERC-asDNA sondas recuperar ~ 88% de RNA celular TERC e GAPDH indetectável. LacZ-asDNA sondas são utilizados como controles negativos e recuperar nem RNAs. A média + dp são mostrados. Anteriormente publicado em Chu et ai. 2011. 17 <img alt="Figura 3." src="/files/ftp_upload/3912/3912fig3.jpg" /> Figura 3. Hotair CHIRP-qPCR em humano primário parafibroblastos Eskin. NFKBIA, HOXD3-4, SERINC5 e ABCA2 são regiões que interagem com hotair. TERC e GAPDH serviram como controles negativos. A média + dp são mostrados. Anteriormente publicado em Chu et ai. 2011. 17 <img alt="Figura 4." src="/files/ftp_upload/3912/3912fig4.jpg" /> Figura 4. CHIRP-seq de dados de roX2 RNA em células de Drosophila SL2. &quot;Mesmo&quot; e &quot;estranho&quot; foram seqüenciados em separado; seus dados mesclar para refletir apenas picos comuns em ambos. A faixa fundida é mostrado. Anteriormente publicado em Chu et ai. 2011. 17

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C. Chu e Chang HY são nomeados como inventores sobre um pedido de patente com base neste método.

Aqui descrevemos CHIRP-seq, um método de mapeamento em sites in vivo lncRNA ligação do genoma. Os principais parâmetros para o sucesso são as piscinas de divisão de azulejos sondas de oligonucleotídeos e reticulação glutaraldeído. A concepção de sondas de afinidade é simples, dada a sequência de RNA e não requer conhecimento prévio da estrutura do RNA ou domínios funcionais. O nosso sucesso com roX2, TERC, e hotair - três RNAs bastante diferentes em duas espécies - sugere que CHIRP-seq provavelmente generalizáveis ​​para lncRNAs muitos. Tal como com todas as experiências, os controlos de cuidados e adequada são necessários para interpretar os resultados. LncRNA diferente pode exigir titulação de condições, ea mudança criteriosa de condições, tais como seleção de sondas diferentes de afinidade ou reticuladores, pode realçar diferentes aspectos da RNA-cromatina interações. Como ChIP seguintes, nem todos os eventos de ligação são, necessariamente, funcional, e estudos adicionais são necessários para verificar as conseqüências biológicas da RNA occupancy em cromatina. No entanto, prevemos muitas aplicações interessantes desta tecnologia para os pesquisadores de outros cromatina associados lncRNAs, cujo número agora na casa dos milhares 8,9. Assim como ChIP-seq abriu a porta para a exploração do genoma de interações DNA-proteína, CHIRP-seq estudos do &quot;RNA interactoma&quot; pode revelar muitos novos caminhos da biologia.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Lista de tampões:</td></tr><tr><td colspan="4">Dissolva um pellet de inibidor de protease completo em 1 ml de água como solução estoque 50x. Prepare PMSF 100 mM em isopropanol (solução estoque 100x). O Superase-in é utilizado como solução estoque 200x. Armazene todos a -20 °C. &amp;deg;C.</td></tr><tr><td colspan="4">Tampão de lise:</td></tr><tr><td colspan="4">50 mM Tris-Cl pH 7,0&lt;br/&gt;10 mM EDTA&lt;br/&gt;1% SDS&lt;br/&gt;Sempre adicione PMSF, inibidor de proteases e Superase-in recém-preparados antes do uso, exceto quando estiver lavando as perlas</td></tr><tr><td colspan="4">Tampão Proteinase K (para DNA)</td></tr><tr><td colspan="4">100 mM NaCl&lt;br/&gt;10 mM TrisCl pH 8,0 (para RNA, use pH 7,0)&lt;br/&gt;1 mM EDTA&lt;br/&gt;0,5% de SDS&lt;br/&gt;Adicione 5% em volume de Proteinase K (Ambion AM2546 20 mg/ml) recém-preparado antes do uso</td></tr><tr><td colspan="4">Tampão de hibridização</td></tr><tr><td colspan="4">750 mM NaCl&lt;br/&gt;1% SDS&lt;br/&gt;50 mM Tris-Cl pH 7,0&lt;br/&gt;1 mM EDTA&lt;br/&gt;15% formamida (armazenar ao abrigo da luz a 4 &amp;deg;C)&lt;br/&gt;Sempre adicione PMSF, inibidor de proteases e Superase-in frescos antes do uso</td></tr><tr><td colspan="4">Tampão de lavagem</td></tr><tr><td colspan="4">2x cloreto de sódio e citrato de sódio (SSC) (diluído do estoque 20x SSC da Invitrogen)&lt;br/&gt;0,5% de SDS&lt;br/&gt;Sempre adicione PMSF recém-preparado antes do uso</td></tr><tr><td colspan="4">Tampão de eluição de DNA</td></tr><tr><td colspan="4">50 mM NaHCO₃&lt;br/&gt;1% SDS</td></tr><tr><td colspan="4">Tabela de reagentes e equipamentos específicos:</td></tr><tr><td>Glutaraldeído (grau EM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882-10x10ml</td><td></td></tr><tr><td>Misturador de pellet motorizado</td><td>VWR international</td><td>V8185-904</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de protease</td><td>Grupo Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>78830</td><td></td></tr><tr><td>Superase-in</td><td>Ambion</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.ambion.com/catalog/CatNum.php?AM2696">AM2696&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor</td><td>Diagenode</td><td>UCD-200</td><td></td></tr><tr><td>Tubos Falcon (para sonicação)</td><td>Corning</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Ambion</td><td>AM2546</td><td></td></tr><tr><td>kit de purificação de PCR</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>C-1 perolas magneticas</td><td>Invitrogen</td><td>65002</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626-25G</td><td></td></tr><tr><td>ímã DynaMag-15</td><td>Invitrogen</td><td>123-01D</td><td></td></tr><tr><td>ímã DynaMag-2</td><td>Invitrogen</td><td>123-21D</td><td></td></tr><tr><td>MIRNeasy mini kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>Rnase H</td><td>Epicentre Biotecnologias</td><td>R0601K</td><td></td></tr><tr><td>Rnase A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R4875-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Gel de Bloqueio de Fase Pesado</td><td>5 PRIMORDIAL</td><td>2302810</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>Fenol:clorofórmio:isoamil</td><td>Invitrogen</td><td>15593-031</td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Ricca</td><td>RSOC0020-1C</td><td></td></tr><tr><td>GlycoBlue</td><td>Ambion</td><td>AM9515</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>JT Baker</td><td>4057-06</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4</td><td>Invitrogen</td><td>10010-049</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de Eluição (EB)</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>Invitrogen</td><td>15557-036</td><td></td></tr><tr><td>10% SDS</td><td>Invitrogen</td><td>15553-027</td><td></td></tr><tr><td>DNA-&lt;em&gt;livre&lt;/em&gt;</td><td>Ambion</td><td>AM1906</td><td></td></tr><tr><td>Kit de tampão</td><td>Ambion</td><td>AM9010</td><td></td></tr><tr><td>Formamida</td><td>Invitrogen</td><td>15515-026</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento de cromatina por purificação de rna (chirp)

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

RNAs não-codificantes longos são os reguladores de cromatina principais estados para processos biológicos importantes, como a compensação de dosagem, imprinting e expressão de genes de desenvolvimento 1,2,3,4,5,6,7. A recente descoberta de milhares de lncRNAs em associação com os complexos de cromatina específicos de modificação, tal como o complexo Repressiva Polycomb 2 (PRC2) que medeia a histona H3 lisina 27 trimethylation (H3K27me3), sugere as funções gerais para lncRNAs numerosos estados na gestão de cromatina em um gene específico moda 8,9. Enquanto alguns lncRNAs são pensados ​​para trabalhar em cis em genes vizinhos, lncRNAs outros trabalhar em trans para regular genes localizados distantes. Por exemplo, Drosophila lncRNAs roX1 e roX2 regiões ligam numerosos no cromossomo X de células masculinas, e são críticas para a compensação de dosagem 10,11. No entanto, as localizações exatas dos seus locais de ligação não são conhecidos em alta resolução. Da mesma forma, humana lncRNA hotair pode afectar PRC2 ocupação em hundreds de genes do genoma 3,12,13, mas como especificidade o objectivo é claro. LncRNAs também pode servir como suportes modulares para recrutar o conjunto de complexos de proteínas múltiplas. O clássico trans-acting RNA andaime é o RNA TERC que serve como o modelo e andaime para a telomerase complexo 14; hotair também pode servir como um andaime para PRC2 e um desmetilase H3K4 complexo 13. Estudos anteriores de mapeamento de ocupação de RNA em cromatina revelaram percepções substanciais 15,16, mas apenas com um único locus do gene de cada vez. Os locais de ocupação da maioria dos lncRNAs não são conhecidos, e os papéis de lncRNAs na regulação da cromatina foram principalmente inferida a partir dos efeitos indiretos da perturbação lncRNA. Assim como imunoprecipitação de cromatina seguido por microarray ou seqüenciamento profunda (CHIP CHIP ou CHIP-seq, respectivamente) tem melhorado muito a nossa compreensão de interações DNA-proteína em escala genômica, aqui nós ilustrar um Recenqüentemente publicado estratégia para mapear ocupação RNA longo de todo o genoma em alta resolução 17. Este método de isolamento, cromatina pela RNA Purificação (CHIRP) (Figura 1), baseia-se na captura de afinidade de alvo lncRNA: Complexo de cromatina por ladrilhos anti-sentido-oligos, que gera então um mapa de sítios de ligação genómicos com uma resolução de várias centenas de bases com sensibilidade elevada e baixa do fundo. CHIRP é aplicável a muitos lncRNAs porque o desenho de afinidade sondas é simples, dada a sequência de RNA e não requer conhecimento da estrutura do RNA ou domínios funcionais.

CHIRP é uma técnica recente e rápida de mapa genômico sítios de ligação de RNAs não-codificantes longos (lncRNAs). O método tira partido da especificidade dos oligonucleótidos anti-sentido ladrilhos para permitir que a enumeração de sítios lncRNA-bound genómicos.

Isolamento de cromatina por purificação de RNA (CHIRP)

Os RNAs não codificadores longos são reguladores essenciais dos estados da cromatina para processos biológicos importantes, tais como a compensação de dose, a impregnação e o desenvolvimento...

O objetivo geral do experimento a seguir é determinar regiões de DNA associadas a um RNA não codificante específico utilizando QPCR ou sequenciamento de alto rendimento. Isso é alcançado por meio da reticulação cruzada de células para aprisionar interações nativas de D-N-A-R-N-A in vivo. Como segundo passo, as células são lisadas e submetidas à sonicação para solubilizar o lisado celular e fragmentar a cromatina em pequenos pedaços.Em seguida, oligonucleotídeos antissenso biotinilados são adicionados ao lisado celular para enriquecer especificamente os complexos de R-N-A-D-N-A de interesse, obtendo-se resultados que elucidam a identidade dos sítios genômicos ligados a RNAs não codificantes com base em QPCR ou sequenciamento de alto rendimento. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a FISH de R-N-A-D-N-A, é que o chirp permite obter mapas em todo o genoma dos sítios de ligação de RNAs não codificantes com resolução próxima ao par de bases. Este método pode nos ajudar a responder perguntas fundamentais no campo dos RNAs não codificantes, como a forma pela qual os rocks, RNAs e moscas machos realizam a compensação de dose.As implicações dessa técnica, na medida das terapias para doenças relacionadas ao ARN não codificante, residem na possibilidade de compreender melhor como o ARN não codificante regula os estados da cromatina e a expressão gênica. Para este experimento de isolamento de cromatina por purificação de ARN, ou ChIRP, 40 milhões de células serão colhidos após centrifugação, decante o PBS e remova o líquido remanescente aspirando cuidadosamente em um ângulo, desalojando o pellet celular ao bater suavemente na base do tubo de falcão. Adicione glutaraldeído recém-preparado a 1%, iniciando com um volume pequeno e ressuspendendo o pellet celular, completando até o volume final e, em seguida, inverta para misturar; realize a reticulação por 10 minutos à temperatura ambiente em um agitador horizontal ou rotativo. Interrompa a reação de reticulação com um décimo do volume de glicina 1,25 molar e deixe em agitação à temperatura ambiente por cinco minutos; as células ficarão laranja brilhante.Em seguida, centrifugue a 2000 RCF durante cinco minutos, decante e aspire o sobrenadante e lave o pellet com 20 mililitros de PBS gelado, centrifugue novamente, aspire o sobrenadante e re-suspenda o pellet reticulado com PBS gelado. Transfira cada mililitro de células para um tubo eppendorf e centrifugue a 2000 RCF durante três minutos a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, use uma ponteira de pipeta para remover cuidadosamente o máximo possível de PBS.Flash, congele todos os pellets celulares em nitrogênio líquido e armazene a menos 80 graus Celsius indefinidamente. Para preparar o lisado celular para o chirp, descongele os pellets celulares congelados e reticulados à temperatura ambiente. Bata com força para soltar e misturar o pellet celular.Centrifugue os pellets e use uma ponteira afiada de 10 microlitros para remover qualquer resíduo restante de PBS em uma balança eletrônica com precisão de um miligrama. Pese a massa de um tubo eppendorf vazio. Pese cada pellet e registre seu peso.Adicione 10 volumes do tampão de lise suplementado com inibidor de protease PMSF e super ace frescos a cada tubo e ressuspenda o precipitado. O lisado celular deve ser agitado imediatamente após sua preparação. Transfira não mais do que 1,5 mililitro de lisado para cada tubo cônico de 15 mililitros e insira as sondas de sonicação, rosqueando-as firmemente.Em seguida, coloque os tubos em um bio ruptor e sonique a quatro graus Celsius na configuração mais alta com intervalos de pulso de 30 segundos ligado e 45 segundos desligado. Verifique o lisado a cada 30 minutos. Continue a sonicação até que o lisado celular não esteja mais turvo.Isso pode levar de 30 minutos a quatro horas, dependendo do número de tubos, do volume da amostra, da temperatura do banho e do período de tempo de sonicação. Quando o lisado ficar transparente, transfira cinco microlitros para um tubo einor novo. Adicione tampão de protease K para DNA e protease K, vórtex para homogeneizar e centrifugue brevemente; incube por 45 minutos a 50 graus Celsius após extrair o DNA com um kit de purificação para PCR.Verifique o tamanho do DNA em um gel de agarose a 1%. A maior parte da mancha de DNA deve estar entre 100 e 500 pares de bases, indicando sonicação completa. Centrifugue alíquotas de um mililitro das amostras sonicadas a 16.100 RCF durante 10 minutos a quatro graus Celsius, transfira o sobrenadante para tubos eppendorf novos e congele rapidamente em nitrogênio líquido para iniciar o procedimento para descongelar tubos de cromatina à temperatura ambiente para uma amostra típica de chirp.Usando um mililitro de lisado, retire 10 microlitros para entrada de RNA e 10 microlitros para entrada de DNA e coloque em tubos einor. Mantenha em gelo até o uso posterior. Transfira um mililitro de cada amostra de cromatina para um tubo falcon de 15 mililitros.Adicione dois mililitros de tampão de hibridização a cada tubo. Em seguida, descongele as sondas à temperatura ambiente. Esses oligonucleotídeos biotinilados em mosaico são rotulados de acordo com suas posições ao longo do RNA e separados em dois grupos.O pool par contém todas as sondas com números pares. E o pool ímpar contém as sondas com números ímpares. Todos os experimentos são realizados utilizando ambos os pools, que servem como controles internos um para o outro.Um dos aspectos mais desafiadores do protocolo real é que todas as etapas de hibridização e lavagem precisam ser realizadas a 37 graus. Para garantir uma temperatura experimental constante, realize todas as etapas dentro ou próximo a uma estufa de hibridização. Adicione o volume apropriado de sondas a tubos específicos. Misture bem e incube a 37 graus por quatro horas com agitação, 20 minutos antes da conclusão da hibridização.Prepare os marcadores magnéticos C um. Utilize 100 microlitros por 100 pico mols de sondas. Lave com um mililitro de tampão de lise não suplementado três vezes, usando o ímã Dyna mag dois para separar os marcadores do tampão.Após a última lavagem, ressuspenda as esferas no volume original de tampão de lise e complemente com PMSF e inibidor de protease fresco. Quando a reação de hibridização de quatro horas estiver concluída, adicione 100 microlitros de esferas a cada tubo e misture bem. Incube a 37 graus Celsius por 30 minutos com agitação e lave as esferas com um mililitro de tampão de lavagem pré-aquecido a 37 graus Celsius na primeira lavagem.Utilize uma fita magnética dyna mag 15 para separar as microesferas, decante e ressuspenda em um mililitro de tampão de lavagem, transfira para um tubo EOR de 1,5 mililitro. Incube a 37 graus Celsius com agitação por cinco minutos nas lavagens subsequentes, centrifugue cada tubo em uma mini centrífuga e coloque a amostra em uma fita magnética dyna mag dois por um minuto para decantar a amostra. Remova qualquer resíduo com um lenço Kim e ressuspenda em um mililitro.Tamponar a lavagem, incubar a 37 graus Celsius com agitação durante cinco minutos. Repetir por um total de cinco lavagens; na última lavagem, ressuspender. Suspender bem as esferas, remover 100 microlitros e reservar para o isolamento de RNA; reservar 900 microlitros para a fração de DNA.Coloque todos os tubos na fita magnética Dyna Mag e remova o tampão de lavagem. Após uma breve centrifugação, coloque novamente o tubo na fita magnética com uma ponta de pipeta fina de 10 microlitros. Remova completamente o tampão de lavagem remanescente de cada tubo.As frações de RNA e DNA são subsequentemente isoladas das amostras de chirp para quantificação e sequenciamento. Esta figura mostra o enriquecimento de telomerase humana, RNA ou Turk a partir de células HELOC em comparação com GA dh. Um RNA celular abundante que serve como controle negativo.A maioria do RNA Turk presente na célula, cerca de 88%, foi retirada mediante a realização de chirp, enquanto apenas 0,46% do RNA GA DH foi recuperado, demonstrando um fator de enriquecimento de aproximadamente 200 vezes. Sondas não específicas, como as direcionadas ao RNA LAC Z, que normalmente não é expresso em células de mamíferos, podem ser usadas como controles negativos adicionais. Regiões de DNA esperadas para ligar ao alvo. Os RNAs não codificantes longos geralmente são enriquecidos em relação às regiões negativas quando medidos por QPCR.Esta figura mostra a validação por QPCR de quatro sítios ligados ao hot air em fibroblastos primários de prepúcio humano, determinados por meio da realização do chirp SSE na mesma linhagem celular, enquanto os sítios de DNA Turk e GA DH servem como regiões de controle negativo. Tanto os conjuntos de sondas pares quanto ímpares apresentaram enriquecimento comparável dos sítios ligados ao hot air esperados em relação às regiões negativas. Uma característica marcante de verdadeiros sítios de ligação de RNA não codificantes longos.Um mapa global de sítios de ligação de RNA não codificantes de longa extensão pode ser obtido por meio do sequenciamento de alto rendimento do DNA enriquecido por ChIRP, conforme ilustrado por estes dados do RNA não codificante de longa extensão Trla Rocks dois, que é conhecido por interagir com o cromossomo X de maneira necessária para a compensação de dose. As amostras pares e ímpares foram sequenciadas separadamente e seus ruídos únicos eliminados para produzir uma trilha de sinais sobrepostos, na qual cada pico indica um forte sítio de ligação do Rocks dois. Ao realizar este procedimento, é importante adotar a técnica correta de livre de RNAses.Outros métodos, como o "dot blot" de proteínas, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como quais proteínas estão interagindo com o DRNA não clínico de interesse após seu desenvolvimento. O CHI abriu caminho para pesquisadores na área de biologia de RNA mapearem a interação de RNA em células cultivadas e tecidos fixados.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Aqui estamos apresentando uma imunoprecipitação da cromatina (CHIP) procedimento para análise do genoma localização das isoformas de proteínas que diferem em um domínio de ligação de histonas. Estamos aplicando-a-CHIP Seq análise para identificar os alvos da demetilase KDM5A/JARID1A/RBP2 histonas.

Análise do genoma usando chip para identificar alvos isoforma específica Gene

Cromatina Análise de Interação por Emparelhados Fim-Tag Sequencing (Chia-PET) é um método...

Cromatina Análise de Interação com Emparelhados Fim-Tag Sequencing (Chia-PET) para mapeamento Interações cromatina e Compreensão regulação da transcrição

Nós descrevemos um método robusto para cromatina imunoprecipitação utilizando células T primárias. O método baseia-se em métodos normais, mas utiliza um conjunto específico de condições e reagentes que melhoram a eficiência de uma quantidade limitada de células. Importante, é apresentada uma descrição detalhada da fase de análise de dados.

Imunoprecipitação da Cromatina eficiente usando Limitando quantidades de biomassa

A combinação de cromatina imunoprecipitação e sequenciamento ultra-high-throughput (CHIP-seq) pode identificar e mapear as interações DNA-proteína em uma determinada linha de tecido ou célula. Delineado é como gerar um modelo de alta chip de qualidade para o seqüenciamento posterior, utilizando a experiência com o fator de transcrição TCF7L2 como um exemplo.

Geração de alta Chromatin Template DNA Immunoprecipitation Qualidade para seqüenciamento de alto rendimento (CHIP-seq)

Ao combinar nativa e reticulação da cromatina imunoprecipitação com alta resolução de Espectrometria de Massa, ChroP abordagem permite a dissecar a arquitectura proteómica composto de histonas modificações, variantes e proteínas não-histonic sinergia na cromatina domínios funcionalmente distintos.

A Abordagem ChroP Combina chip e Espectrometria de Massa dissecar proteômica Paisagens Locus específicas da cromatina

A identificação de moléculas associadas a regiões genômicas específicas de interesse é necessária para entender os mecanismos de regulação das funções dessas regiões. Este protocolo descreve procedimentos para realizar imunoprecipitação de cromatina mediada por molécula de ligação ao DNA (enChIP) projetada para identificação de proteínas e RNAs associados a uma região genômica específica.

O isolamento de regiões específicas genômico e identificação de moléculas pela Associated enChIP

Aqui, descrevemos uma imunoprecipitação da cromatina (ChIP) e protocolo de preparação ChIP-seq biblioteca para gerar perfis de epigenomic global de amostras embrionárias de galinha baixa abundância.

Cromatina (ChIP) imunoprecipitação para baixo-abundância embrionárias amostras

Descreveremos um protocolo passo a passo para cromatina em tandem da imunoprecipitação sequenciamento (tChIP-Seq) que permite a análise da modificação do histone todo o genoma de célula tipo-específicas.

TChIP-Seq: Epigenoma célula tipo-específicas de criação de perfil

Este protocolo concentra-se na preparação de cromatina a partir de tecidos congelados instantâneos e é adequado para Imunoprecipitação de Cromatina de Reticulação (X-ChIP) seguida de análise quantitativa de PCR (X-ChIP-qPCR) ou abordagens de sequenciamento de próxima geração (X-ChIP-seq).

Extração de cromatina de tecido hepático quimérico congelado para análise de imunoprecipitação de cromatina

Aqui, apresentamos um protocolo para capturar as interações DNA-DNA de cromatina associadas ao RNA para mapear a organização do genoma tridimensional relacionada ao RNA.

Método de Interação DNA-DNA de Cromatina Associada a RNA

Aprenda a técnica ChIRP para mapear sítios de ligação de lncRNAs no genoma usando oligonucleotídeos antisense biotinilados. Este método oferece resolução próxima ao par de bases para estudar regulação gênica.

Isolamento de cromatina por purificação de RNA (CHIRP)

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