Isolamento de cromatina por purificação de RNA (CHIRP)

O objetivo geral do experimento a seguir é determinar regiões de DNA associadas a um RNA não codificante específico utilizando QPCR ou sequenciamento de alto rendimento. Isso é alcançado por meio da reticulação cruzada de células para aprisionar interações nativas de D-N-A-R-N-A in vivo. Como segundo passo, as células são lisadas e submetidas à sonicação para solubilizar o lisado celular e fragmentar a cromatina em pequenos pedaços.

Em seguida, oligonucleotídeos antissenso biotinilados são adicionados ao lisado celular para enriquecer especificamente os complexos de R-N-A-D-N-A de interesse, obtendo-se resultados que elucidam a identidade dos sítios genômicos ligados a RNAs não codificantes com base em QPCR ou sequenciamento de alto rendimento. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a FISH de R-N-A-D-N-A, é que o chirp permite obter mapas em todo o genoma dos sítios de ligação de RNAs não codificantes com resolução próxima ao par de bases. Este método pode nos ajudar a responder perguntas fundamentais no campo dos RNAs não codificantes, como a forma pela qual os rocks, RNAs e moscas machos realizam a compensação de dose.

As implicações dessa técnica, na medida das terapias para doenças relacionadas ao ARN não codificante, residem na possibilidade de compreender melhor como o ARN não codificante regula os estados da cromatina e a expressão gênica. Para este experimento de isolamento de cromatina por purificação de ARN, ou ChIRP, 40 milhões de células serão colhidos após centrifugação, decante o PBS e remova o líquido remanescente aspirando cuidadosamente em um ângulo, desalojando o pellet celular ao bater suavemente na base do tubo de falcão. Adicione glutaraldeído recém-preparado a 1%, iniciando com um volume pequeno e ressuspendendo o pellet celular, completando até o volume final e, em seguida, inverta para misturar; realize a reticulação por 10 minutos à temperatura ambiente em um agitador horizontal ou rotativo. Interrompa a reação de reticulação com um décimo do volume de glicina 1,25 molar e deixe em agitação à temperatura ambiente por cinco minutos; as células ficarão laranja brilhante.

Em seguida, centrifugue a 2000 RCF durante cinco minutos, decante e aspire o sobrenadante e lave o pellet com 20 mililitros de PBS gelado, centrifugue novamente, aspire o sobrenadante e re-suspenda o pellet reticulado com PBS gelado. Transfira cada mililitro de células para um tubo eppendorf e centrifugue a 2000 RCF durante três minutos a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, use uma ponteira de pipeta para remover cuidadosamente o máximo possível de PBS.

Flash, congele todos os pellets celulares em nitrogênio líquido e armazene a menos 80 graus Celsius indefinidamente. Para preparar o lisado celular para o chirp, descongele os pellets celulares congelados e reticulados à temperatura ambiente. Bata com força para soltar e misturar o pellet celular.

Centrifugue os pellets e use uma ponteira afiada de 10 microlitros para remover qualquer resíduo restante de PBS em uma balança eletrônica com precisão de um miligrama. Pese a massa de um tubo eppendorf vazio. Pese cada pellet e registre seu peso.

Adicione 10 volumes do tampão de lise suplementado com inibidor de protease PMSF e super ace frescos a cada tubo e ressuspenda o precipitado. O lisado celular deve ser agitado imediatamente após sua preparação. Transfira não mais do que 1,5 mililitro de lisado para cada tubo cônico de 15 mililitros e insira as sondas de sonicação, rosqueando-as firmemente.

Em seguida, coloque os tubos em um bio ruptor e sonique a quatro graus Celsius na configuração mais alta com intervalos de pulso de 30 segundos ligado e 45 segundos desligado. Verifique o lisado a cada 30 minutos. Continue a sonicação até que o lisado celular não esteja mais turvo.

Isso pode levar de 30 minutos a quatro horas, dependendo do número de tubos, do volume da amostra, da temperatura do banho e do período de tempo de sonicação. Quando o lisado ficar transparente, transfira cinco microlitros para um tubo einor novo. Adicione tampão de protease K para DNA e protease K, vórtex para homogeneizar e centrifugue brevemente; incube por 45 minutos a 50 graus Celsius após extrair o DNA com um kit de purificação para PCR.

Verifique o tamanho do DNA em um gel de agarose a 1%. A maior parte da mancha de DNA deve estar entre 100 e 500 pares de bases, indicando sonicação completa. Centrifugue alíquotas de um mililitro das amostras sonicadas a 16.100 RCF durante 10 minutos a quatro graus Celsius, transfira o sobrenadante para tubos eppendorf novos e congele rapidamente em nitrogênio líquido para iniciar o procedimento para descongelar tubos de cromatina à temperatura ambiente para uma amostra típica de chirp.

Usando um mililitro de lisado, retire 10 microlitros para entrada de RNA e 10 microlitros para entrada de DNA e coloque em tubos einor. Mantenha em gelo até o uso posterior. Transfira um mililitro de cada amostra de cromatina para um tubo falcon de 15 mililitros.

Adicione dois mililitros de tampão de hibridização a cada tubo. Em seguida, descongele as sondas à temperatura ambiente. Esses oligonucleotídeos biotinilados em mosaico são rotulados de acordo com suas posições ao longo do RNA e separados em dois grupos.

O pool par contém todas as sondas com números pares. E o pool ímpar contém as sondas com números ímpares. Todos os experimentos são realizados utilizando ambos os pools, que servem como controles internos um para o outro.

Um dos aspectos mais desafiadores do protocolo real é que todas as etapas de hibridização e lavagem precisam ser realizadas a 37 graus. Para garantir uma temperatura experimental constante, realize todas as etapas dentro ou próximo a uma estufa de hibridização. Adicione o volume apropriado de sondas a tubos específicos. Misture bem e incube a 37 graus por quatro horas com agitação, 20 minutos antes da conclusão da hibridização.

Prepare os marcadores magnéticos C um. Utilize 100 microlitros por 100 pico mols de sondas. Lave com um mililitro de tampão de lise não suplementado três vezes, usando o ímã Dyna mag dois para separar os marcadores do tampão.

Após a última lavagem, ressuspenda as esferas no volume original de tampão de lise e complemente com PMSF e inibidor de protease fresco. Quando a reação de hibridização de quatro horas estiver concluída, adicione 100 microlitros de esferas a cada tubo e misture bem. Incube a 37 graus Celsius por 30 minutos com agitação e lave as esferas com um mililitro de tampão de lavagem pré-aquecido a 37 graus Celsius na primeira lavagem.

Utilize uma fita magnética dyna mag 15 para separar as microesferas, decante e ressuspenda em um mililitro de tampão de lavagem, transfira para um tubo EOR de 1,5 mililitro. Incube a 37 graus Celsius com agitação por cinco minutos nas lavagens subsequentes, centrifugue cada tubo em uma mini centrífuga e coloque a amostra em uma fita magnética dyna mag dois por um minuto para decantar a amostra. Remova qualquer resíduo com um lenço Kim e ressuspenda em um mililitro.

Tamponar a lavagem, incubar a 37 graus Celsius com agitação durante cinco minutos. Repetir por um total de cinco lavagens; na última lavagem, ressuspender. Suspender bem as esferas, remover 100 microlitros e reservar para o isolamento de RNA; reservar 900 microlitros para a fração de DNA.

Coloque todos os tubos na fita magnética Dyna Mag e remova o tampão de lavagem. Após uma breve centrifugação, coloque novamente o tubo na fita magnética com uma ponta de pipeta fina de 10 microlitros. Remova completamente o tampão de lavagem remanescente de cada tubo.

As frações de RNA e DNA são subsequentemente isoladas das amostras de chirp para quantificação e sequenciamento. Esta figura mostra o enriquecimento de telomerase humana, RNA ou Turk a partir de células HELOC em comparação com GA dh. Um RNA celular abundante que serve como controle negativo.

A maioria do RNA Turk presente na célula, cerca de 88%, foi retirada mediante a realização de chirp, enquanto apenas 0,46% do RNA GA DH foi recuperado, demonstrando um fator de enriquecimento de aproximadamente 200 vezes. Sondas não específicas, como as direcionadas ao RNA LAC Z, que normalmente não é expresso em células de mamíferos, podem ser usadas como controles negativos adicionais. Regiões de DNA esperadas para ligar ao alvo. Os RNAs não codificantes longos geralmente são enriquecidos em relação às regiões negativas quando medidos por QPCR.

Esta figura mostra a validação por QPCR de quatro sítios ligados ao hot air em fibroblastos primários de prepúcio humano, determinados por meio da realização do chirp SSE na mesma linhagem celular, enquanto os sítios de DNA Turk e GA DH servem como regiões de controle negativo. Tanto os conjuntos de sondas pares quanto ímpares apresentaram enriquecimento comparável dos sítios ligados ao hot air esperados em relação às regiões negativas. Uma característica marcante de verdadeiros sítios de ligação de RNA não codificantes longos.

Um mapa global de sítios de ligação de RNA não codificantes de longa extensão pode ser obtido por meio do sequenciamento de alto rendimento do DNA enriquecido por ChIRP, conforme ilustrado por estes dados do RNA não codificante de longa extensão Trla Rocks dois, que é conhecido por interagir com o cromossomo X de maneira necessária para a compensação de dose. As amostras pares e ímpares foram sequenciadas separadamente e seus ruídos únicos eliminados para produzir uma trilha de sinais sobrepostos, na qual cada pico indica um forte sítio de ligação do Rocks dois. Ao realizar este procedimento, é importante adotar a técnica correta de livre de RNAses.

Outros métodos, como o "dot blot" de proteínas, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como quais proteínas estão interagindo com o DRNA não clínico de interesse após seu desenvolvimento. O CHI abriu caminho para pesquisadores na área de biologia de RNA mapearem a interação de RNA em células cultivadas e tecidos fixados.