Isolamento de cromatina por purificação de RNA (CHIRP)

CHIRP é uma técnica recente e rápida de mapa genômico sítios de ligação de RNAs não-codificantes longos (lncRNAs). O método tira partido da especificidade dos oligonucleótidos anti-sentido ladrilhos para permitir que a enumeração de sítios lncRNA-bound genómicos.

O objetivo geral do experimento a seguir é determinar as regiões de DNA associadas a um RNA não codificante específico usando QPCR ou sequenciamento de alto rendimento. Isso é obtido por meio da reticulação de células para capturar interações D-N-A-R-N-A nativas in vivo. Como segunda etapa, as células são lisadas e submetidas à sonicação para solubilizar o lisado celular e a cromatina pura em pequenos fragmentos.

Em seguida, oligos antisense biotinilados são adicionados ao lisado celular para enriquecer especificamente para os complexos R-N-A-D-N-A de interesse, são obtidos resultados que elucidam a identidade de sítios genômicos ligados a RNA não codificantes com base em QPCR ou sequenciamento de alto rendimento. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como o R-N-A-D-N-A FISH, é que o chirp permite mapas de todo o genoma de locais de ligação de RNA não codificantes em resoluções próximas ao par de bases. Esse método pode nos ajudar a responder a perguntas-chave no campo do RNA não codificante, como como as rochas, RNAs e moscas machos alcançam a compensação de dosagem.

As implicações desta técnica, a extensão para terapias de doenças relacionadas com NA não codificantes, pois permite compreender melhor como o RNA não codificante regula os estados de cromatina e a expressão génica. Para este isolamento da cromatina por purificação de RNA ou experimento chirp, 40 milhões de células serão colhidas após centrifugação, decantar o PBS e remover o líquido restante aspirando cuidadosamente em um ângulo desalojado o pellet celular batendo no fundo do tubo de falcão. Adicione o glutaraldeído a 1% recém-preparado, começando com um pequeno volume e ressuspenda a superfície do pellet celular até o volume total e, em seguida, inverta para misturar a reticulação por 10 minutos à temperatura ambiente em um agitador ou rotador de ponta a ponta, extinguir a reação de reticulação com um décimo volume de glicina molar de 1,25 e deixar em um agitador em temperatura ambiente por cinco minutos, As células ficarão laranja brilhante.

Em seguida, centrifugar a 2000 RCF durante cinco minutos, decantar e aspirar o sobrenadante e lavar novamente o pellet com 20 mililitros de centrifugação PBS refrigerada, aspirar o sobrenadante e ressuspender o palato reticulado lavado com PBS refrigerado. Transfira cada mililitro de células para um tubo einor e gire a 2000 RCF por três minutos a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, use uma ponta de pipeta para remover cuidadosamente o máximo de PBS possível.

Flash, congele todos os grânulos de células em nitrogênio líquido e armazene a 80 graus Celsius negativos indefinidamente. Para preparar o lisado celular para chirp, descongele os pellets de células reticuladas congelados à temperatura ambiente. Bata com força para desalojar e misturar o pellet celular.

Gire os pellets e use uma ponta de pipeta afiada de 10 microlitros para remover qualquer PBS restante em uma balança eletrônica com precisão de um miligrama. Rasgue a massa de um tubo einor vazio. Pese cada pellet e registre seu peso.

Adicione 10 x volume de tampão de lise suplementado com inibidor de protease fresco PMSF e super ace em cada tubo e ressuspenda o pellet. O lisado celular deve ser adiado imediatamente após a sua preparação. Transfira não mais do que 1,5 mililitros de lisado para cada tubo de falcão de 15 mililitros e insira as sondas de sonicação aparafusando-as firmemente.

Em seguida, coloque os tubos em uma bioruptura, sonice a quatro graus Celsius na configuração mais alta com 30 segundos em intervalos de pulso de 45 segundos. Verifique o lisado a cada 30 minutos. Continue a sonicar até que o lisado celular não esteja mais turvo.

Isso pode levar de 30 minutos a quatro horas, dependendo do número de tubos, do volume da amostra, da temperatura do banho e do período de tempo de sonicação. Quando o lisado ficar claro, transfira cinco microlitros para um novo tubo einor. Adicione o tampão de protease K de DNA e o vórtice de protease K para misturar e girar, incube brevemente por 45 minutos a 50 graus Celsius após a extração de DNA com um kit de purificação de PCR.

Verifique o tamanho do DNA em um gel 1%aros. A maior parte do esfregaço de DNA deve ser de 100 a 500 pares de bases, indicando centrífuga de sonicação completa. Alíquotas de um mililitro de amostras sonicadas a 16, 100 RCF por 10 minutos a quatro graus Celsius, transferir o sobrenadante para tubos de einor frescos e congelar rapidamente em nitrogênio líquido para iniciar o procedimento de tubos de descongelamento de cromatina à temperatura ambiente para uma amostra típica de chirp.

Usando um mililitro de lisado, remova 10 microlitros para entrada de RNA e 10 microlitros para entrada de DNA e coloque em tubos einor. Mantenha no gelo até mais. Use a transferência de um mililitro de cada amostra de cromatina para um tubo de falcão de 15 mililitros.

Adicione dois mililitros de tampão de hibridização a cada tubo. Em seguida, descongele as sondas em temperatura ambiente. Esses oligos de ladrilhos biotinilados são marcados de acordo com suas posições ao longo do RNA e separados em dois pools.

O pool par contém todos os testes com números pares. E o pool ímpar contém sondas com números ímpares. Todos os experimentos são realizados usando os dois pools que servem como controles internos um para o outro.

Um dos aspectos mais desafiadores do protocolo verdadeiro é que todas as etapas de hibridização e lavagem precisam ser executadas a 37 graus. Para garantir uma temperatura experimental consistente, execute todas as etapas dentro ou perto de um forno de habitação, adicione o volume apropriado de sondas a tubos específicos. Misture bem, incube a 37 graus por quatro horas com agitação 20 minutos antes da hibridização estar completa.

Prepare as contas magnéticas C one. Use 100 microlitros por 100 pico mol de sondas. Lave com um mililitro de tampão de lise suplementado três vezes usando o ímã de duas tiras Dyna mag para separar as contas do tampão.

Após a lavagem final, resus suspenda os grânulos no volume original do tampão de lise e suplemente com superin fresh PMSF e inibidor de protease. Quando a reação de hibridização de quatro horas estiver completa, adicione 100 microlitros de grânulos a cada mistura de tubo. Bem, incube a 37 graus Celsius por 30 minutos com contas de lavagem agitadas com um mililitro de tampão de lavagem pré-aqueça a 37 graus Celsius na primeira lavagem.

Use uma fita magnética dyna mag 15 para separar as contas, decantar e ressuspender em um tampão de lavagem de mililitro, transfira para um tubo EOR de 1,5 mililitro. Incube a 37 graus Celsius com agitação por cinco minutos nas lavagens subsequentes, gire cada tubo em uma mini centrífuga e coloque a amostra em uma fita magnética dyna mag two para uma amostra de decantação de um minuto. Limpe todas as gotas com um lenço Kim e ressuspenda em um mililitro.

Tampão de lavagem, incube a 37 graus Celsius com agitação por cinco minutos. Repita para um total de cinco lavagens na última lavagem Resus. Suspenda bem as contas, remova 100 microlitros e reserve para isolamento de RNA, reserve 900 microlitros para a fração de DNA.

Coloque todos os tubos na tira magnética do tubo dyna mag e remova o tampão de lavagem. Após uma breve rotação, coloque o tubo novamente na tira magnética com uma ponta de pipeta afiada de 10 microlitros. Remova completamente o tampão de lavagem restante de cada tubo.

As frações de RNA e DNA são posteriormente isoladas das amostras de chirp para quantificação e sequenciamento. Esta figura mostra o enriquecimento da telomerase humana, RNA ou Turk de células HELOC sobre GA dh. Um RNA celular abundante que serve como um controle negativo.

A maior parte do RNA turco presente na célula, cerca de 88%, foi puxada para baixo pela realização de chirp, enquanto apenas 0,46% do RNA GA DH foi recuperado, demonstrando um fator de enriquecimento de aproximadamente 200 vezes Sondas não específicas, como sondas direcionadas ao LAC ZRNA, que geralmente não são expressas em células de mamíferos, podem ser usadas como controles negativos adicionais. Espera-se que as regiões de DNA se liguem ao alvo. O RNA longo não codificante é tipicamente enriquecido em regiões negativas quando medido por QPCR.

Esta figura mostra a validação de QPCR de quatro locais ligados ao ar quente em fibroblastos primários do prepúcio humano determinados pela realização de chirp SSE na mesma linha celular, enquanto os locais de DNA Turk e GA DH servem como regiões de controle negativo. Os conjuntos de sondas pares e ímpares produziram enriquecimento comparável de locais esperados de ar quente em regiões negativas. Uma marca registrada de verdadeiros locais de ligação de RNA não codificantes longos.

Um mapa global de locais de ligação de RNA longos não codificantes pode ser obtido por sequenciamento de alto rendimento de DNA enriquecido com chirp, conforme ilustrado por esses dados do RNA longo sem revestimento de trla Rocks two, que é conhecido por interagir com o cromossomo X de uma maneira necessária para compensação de dosagem. As amostras pares e ímpares foram sequenciadas separadamente e seus ruídos únicos eliminados para produzir uma trilha de sinais sobrepostos, onde cada pico indica uma forte visão de rochas duas ligações Ao tentar este procedimento. É importante exercitar a técnica livre de RNAs correta seguindo este procedimento.

Outros métodos, como o blotting de proteínas, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como quais proteínas estão interagindo com o DRNA não clínico de interesse após seu desenvolvimento. O CHI abriu caminho para pesquisadores no campo da biologia de RNA mapearem o RN aact em células de cultura e tecidos fixos.