Um parasita Ensaio de Resgate e Transformação de Triagem leishmanicida contra intracelular Leishmania donovani Amastigotas em THP1 linha celular humana aguda Monocytic Leucemia

O objetivo geral da tecnologia experimental demonstrada aqui é rastrear compostos contra o crescimento e proliferação do estágio intracelular de cabra ama de Lishmania. Don Avani a causa do agente para a leishmaniose visceral com o objetivo principal de descobrir novos medicamentos para o tratamento de lemanis Primeiro THP um As células de leucemia monocítica aguda humana são diferenciadas in vitro em macrófagos aderentes, as células THP diferenciadas e depois infectadas com cabras ProMaster da coleira Manaya Donovan parasitas, o que permite a invasão das cabras ProMaster nos macrófagos TP um, sua transformação em AMAs, caprinos e proliferação intracelular. Em seguida, os macrófagos THP um infectados com leishmania são expostos a compostos teste e drogas padrão e, em seguida, submetidos a lise controlada, resgate de uma transformação residual de cabras mestras, uma cabra mestre em cabras ProMaster e quantificação de cabras ProMaster por ensaios colormétricos de crescimento celular.

Resultados obtidos que mostram o efeito antimania de compostos teste e drogas padrão sobre o crescimento e proliferação intracelular com base na quantificação de caprinos mestres intracelulares. Lemanis é uma grande ameaça à saúde global, especialmente em áreas tropicais do mundo. Novos medicamentos com melhores perfis terapêuticos para tratar esta doença são urgentemente necessários.

Nós, do Centro Nacional de Pesquisa de Produtos Naturais, lançamos um programa multidirecional para a descoberta de novos tratamentos para doenças parasitárias tropicais. Ao contrário dos ensaios de análise de imagem microscópica e Rogen, que podem não diferenciar entre os produtos MSST vivos e mortos, este SA mede apenas os produtos MST intracelulares vivos. Otimizamos um ensaio de resgate e transformação de parasitas com células TP one diferenciadas infectadas in vitro com o liman para triagem do composto puro e extrato do produto natural e determinação da eficácia contra a limânia intracelular.

Os detalhes experimentais deste ensaio serão demonstrados pelo Sr. Ra, que é o biólogo de pesquisa e desenvolvimento em meu laboratório e realiza este ensaio e pelo Sr. RA Sahu, que também está trabalhando como biólogo de pesquisa e desenvolvimento em meu laboratório. Existem quatro etapas básicas no ensaio. O primeiro passo é a semeadura e diferenciação terminal das células THP one.

O segundo passo é a infecção in vitro de células TP um diferenciadas com cabras L mania proma. A terceira etapa é o tratamento de macrófagos infectados por Lish mania com os compostos de teste ou medicamentos padrão. E o quarto passo é a quantificação do crescimento e proliferação de cabras parasitas de mania exuberante com análise de imagem microscópica ou ensaios de resgate e transformação de parasitas.

Colha uma cultura de quatro dias de macrófagos THP one e prepare uma suspensão celular em nosso PMI suplementada com FPS ativado por aquecimento a 10% com uma concentração de 2,5 vezes 10 elevado a cinco células por mililitro. Adicione 25 nanogramas por mililitro de PMA às células para desencadear a diferenciação. Em seguida, transfira 200 microlitros de suspensão de células para cada poço de uma placa de 96 poços e cada câmara de uma lâmina de vidro de 16 câmaras, uma vez que as células tenham sido revestidas, coloque a lâmina e a placa de 96 poços em uma incubadora de 37 graus Celsius e incube as células durante a noite para permitir que ocorra uma diferenciação celular quase completa.

Para a infecção. Use uma cultura de parasitas de cabra ProMaster de cinco a seis dias de idade, na qual a maioria dos organismos está no estágio cínico infeccioso. Ao contrário das cabras ProMaster em estágio pró-cíclico, que são células elipsóides curtas com um gel curto, motil semanal e frequentemente encontradas em rosetas, os organismos metacíclicos infecciosos podem ser reconhecidos por sua forma cilíndrica longa e alta motilidade.

Colha os parasitas e prepare uma suspensão de cabra ProMaster de 2,5 vezes 10 para os seis parasitas por mililitro em 2%F-B-S-R-P-M-I recupere as culturas de células THP diferenciadas da incubadora processando a placa de 96 poços e a lâmina de vidro. Paralelamente, remova o supinato das culturas e, em seguida, lave as células adicionando meio livre de soro pré-guerra. Remova o meio livre de soro e substitua-o por 200 microlitros por poço de suspensão de cabra ProMaster, alcançando uma proporção de 10 parasitas para cada célula THP.

Para poços de controle, adicione 200 microlitros de meio 2%F-P-S-R-P-M-I em vez da suspensão do parasita. Depois de adicionar os parasitas, incubar as coculturas a 37 graus Celsius por 24 horas para permitir que a infecção ocorra a partir de soluções estoque do medicamento a ser testado. Prepare seis diluições seriais de um a cinco em 2%F-B-S-R-P-M-I, de modo que as concentrações de cada diluição sejam o dobro do teste final pretendido.

Concentração como controles drogas antimaníacas padrão, como anfotericina b pentamidina, melter, Fosse e gluconato de sódio stib, podem ser usadas antes de adicionar as drogas às coculturas. Lave repetidamente as células TP uma na placa e deslize conforme descrito anteriormente. Lave as células pelo menos cinco vezes para remover quaisquer cabras ProMaster não internalizadas.

Em seguida, adicione 100 microlitros de 2%F-B-S-R-P-M-I e 100 microlitros de cada solução medicamentosa a cada poço ou câmara, incube a placa e deslize a 37 graus Celsius por 48 horas após o tratamento medicamentoso. Lave a câmara. Deslize três vezes em meio livre de soro.

Retire as câmaras de plástico da lâmina e fixe as células imergindo a lâmina em metanol por 30 segundos. Coloque a lâmina em uma capa de risco biológico com fluxo de lâmina para permitir que seque. Enquanto isso, prepare uma solução cinco x de verde cibernético.

Quando a lâmina estiver seca, mergulhe-a em verde cibernético para manchar o DNA celular e parasitário. Incubar a amostra no escuro durante 15 minutos à temperatura ambiente. Após a etapa de coloração, lave a lâmina com água e deixe secar.

Usando o meio de montagem, coloque uma lamínula de vidro sobre o slide. Em seguida, observe as amostras usando um microscópio fluorescente e capture imagens de cada câmara em células não infectadas, apenas o núcleo do macrófago é visível nas células infectadas. Os núcleos e canlas do parasita podem ser vistos no citoplasma celular, atestando a presença de parasitas intracelulares l Donny.

Para quantificar a infecção, use a imagem J para calcular a porcentagem de infectividade, que é o número de núcleos de cabras mestres vezes 100 sobre o número de núcleos de macrófagos para o ensaio de resgate do parasita. Primeiro, lave a co-cultura em placa de 96 poços três vezes com meio RPMI livre de soro para células liso a 20 microlitros de 0,05% S-D-S-R-P-M-I. Para cada poço, agite o prato por 30 segundos.

Em seguida, adicione 180 microlitros de 10% F-B-S-R-P-M-I por poço. O tempo para o tratamento SDS não deve exceder 30 segundos para obter lise controlada do macrófago sem qualquer efeito sobre a viabilidade de um mestre resgatado. As cabras incubam a placa a 26 graus Celsius por 48 horas para permitir a transformação e proliferação do mestre visível resgatado em cabras profissionais.

Para quantificar as cabras pro master, adicione 10 microlitros de azul de alamar a cada poço da placa de 96 poços e incube-o a 26 graus Celsius durante a noite. Após esta incubação, quantificar os parasitas vivos lendo a placa em um fluorímetro de fluorescência padrão. Na ausência de drogas, a porcentagem de infecção aumenta com o número de cabras mestras presentes em relação ao número de macrófagos.

Além disso, a quantidade de parasitas sobreviventes determinada pelo ensaio de resgate se correlaciona bem com a porcentagem de infecção na presença de concentrações crescentes de anfotericina. B. O número de parasitas resgatados diminui de maneira dependente da dose. O ensaio de resgate e transformação do parasita pode ser resumido com visualizações microscópicas sequenciais.

Esta imagem mostra células THP um intactas em cultura infectadas com cabras Amma de mania exuberante. Essas células THP um infectadas são submetidas a lise controlada para resgatar cabras amma vivas. As cabras Amma vivas resgatadas das células THP um infectadas transformando a cultura em cabras ProMaster.

Essas cabras ProMaster transformadas crescem e proliferam cultura. O número total de cabras ProMaster em cultura é diretamente proporcional ao número de cabras com oma intracelular vivas. Este ensaio foi otimizado para a licença de controle de células THV uma infectadas com limânia.

O objetivo foi otimizar as condições para o tratamento com detergente, que irá lise quase completa das células THV um com efeito mínimo sobre o TY dos códigos MST de resgate. Esta etapa é muito crítica neste ensaio. O demonstrador de ensaio de resgate de parasitas aqui também pode ser aplicado para aerar a infectividade de diferentes espécies de parasitas linia causando ácido de leishman cutâneo ou mu cutâneo em diferentes linhagens de células microcardíacas, e também diferentes campos de lenia como isolados ou linhagens celulares de parasitas geneticamente manipuladas.

Tanto o resgate do parasita como SA quanto a análise de imagem como SA mostram resultados comparáveis. Eles têm potencial para automação e aplicação para triagem em larga escala. Aplicamos com sucesso este ensaio para triagem de mais de 16.000 frações preparadas por fracionamento de alto rendimento de produtos naturais disponíveis em nosso centro.

Também otimizamos a análise de imagem como ensaio, combinando as imagens capturadas sob os filtros DIC e fluoresceína e quantificação da infecção com a imagem IM j. A imagem J é um programa de processamento de imagem baseado em Java disponível publicamente, originalmente desenvolvido no NIH. Por meio deste ensaio, várias frações de produtos naturais com novos compostos foram identificadas como novas pistas para a descoberta do trato internacional.