Name: Um parasita Ensaio de Resgate e Transformação de Triagem leishmanicida contra intracelular Leishmania donovani Amastigotas em THP1 linha celular humana aguda Monocytic Leucemia (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 22 s
Description: Aprenda a realizar ensaio de resgate e transformação parasitária para triagem de fármacos anti-leishmania contra amastigotas intracelulares de Leishmania donovani em células THP1 diferenciadas. Este método otimizado quantifica apenas amastigotas vivas, aumentando a precisão na descoberta de novos tratamentos para leishmaniose visceral.

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O NCNPR-USDA-ARS acordo Científico Não. 58-6408-2-0009; CDMRP Prêmio concessão # W81XWH-09-2-0093 pelos EUA investigação médica do Exército e Comando de Material.

1. Manter e Subculture THP1 Cultura de Células <ol><li> THP1 manter as células em meio RPMI-1640 (com 10% de FBS e pH 7,4) a 37 ° C em 5% de uma incubadora de CO 2. </li><li> Células de subcultura duas vezes por semana para evitar a contagem de células a partir de superior a 1x10 6 células / ml. Isto é importante para manter a sua capacidade de transformação. </li></ol> 2. Manter e Subculture Leishmania donovani promastigotas Cultura <ol><li> Manter a L. donovani promastigotas (S1, estirpe sudão) em meio RPMI-1640 (sem bicarbonato de sódio e piruvato de sódio) com 10% de FBS a 26 ° C. </li><li> L. subcultura donovani promastigotas duas vezes por semana, com a mais alta concentração de células na gama de 20-25x10 / 6 promastigotas ml.Caution: Todos os meios e soluções deve ser levado à temperatura ambiente antes do uso. </li></ol> 3. Sementeira e diferenciação das células THP1 em um 96 poços de microplacas de 16 e câmara de slides Cultura vidro. <ol><li> Prepara-se uma cultura THP1 diluída com a contagem de células de 2.5x10 5 células / ml a partir de uma cultura de células de quatro dias de idade (número de células não deve exceder 10 6 células / ml) em meio RPMI-1640 com 10% de FBS inactivado pelo calor. Preparado 20 ml de cultura de cada placa de 96 poços e 4 ml da cultura para cada lâmina câmara 16 poços. </li><li> Adicionar forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) (para a diferenciação de THP1) a uma suspensão diluída de células de cultura (10 ml de cultura μl/20 partir do stock de 50 mg / ml em DMSO) (concentração final de PMA em cultura de células diluída deve ser 25 ng / ml). </li><li> Para comparar a Digital-Imagem-Análise-Direct-Contagem-Ensaio e Parasite-Rescue-Transformação de Ensaio, configurar os ensaios simultaneamente em claro, de fundo plano, placa de 96 poços e 16 câmaras, vidro, slide cultura microscópica. </li><li> Pipetar 200 ul de células THP1-PMA-tratados para cada cavidade ou câmara. </li><li> Incubar a p 96 poçoslates e slides 16 poços numa câmara de 37 ° C, 5% CO 2 incubadora durante a noite para permitir a diferenciação quase completa das células. </li></ol> Nota: As células THP1, que normalmente crescem em suspensão, são diferenciadas em macrófagos aderentes. 4. Infecção das células transformadas THP1 com promastigotas de Leishmania donovani <ol><li> Para a infecção da cultura de células THP1 diferenciadas com promastigotas Leishmania donovani, a maioria dos parasitas deve estar na fase metacíclico infecciosa (formas cilíndricas longas, a cultura ~ 5-6 dias de idade). </li><li> Uma célula THP1 1:10 a relação parasita é ideal para a infecção tanto no Digital Image Analysis-Direct-Contagem-Ensaio e promastigota-Rescue-Transformação de Ensaio. </li><li> Prepara-se uma cultura diluída de L. donovani promastigotas do parasita com uma contagem de 2.5x10 6 parasita / ml (para células THP1: proporção = 1:10 parasitas) deuma cultura de 5-6 dias de idade em meio RPMI-1640 com 2% de FBS. </li><li> A partir do passo 3.5 (após a diferenciação durante a noite de cultura de células THP1) retirar as placas e lâminas de câmara, remover o meio e lava-se as culturas de células uma vez com soro isento de meio RPMI-1640. </li><li> Após lavagem cuidadosa de PMA-tratado com células THP1 isento de soro, morno RPMI-1640 (~ 37 ° C) média, substituir o meio isento de soro com 200 uL da cultura diluída de L. donovani promastigotas (2.5x10 6 parasitas / ml) do passo 4.3. Configurar os poços de controlo de células THP1 sem o parasita e os parasitas sem THP1 células em cada placa e as lâminas 16 poços de câmara. </li><li> Após a adição de parasita para a cultura de células THP1, incubar a placa e as lâminas a 37 ° C, 5% CO 2 por 24 horas para permitir que os parasitas que infectam os THP1 diferenciadas células. </li></ol> 5. O tratamento de macrófagos infectados com drogas de ensaio / Compostos <ol><li> TesteAnfotericina B, pentamidina e Miltefosina como padrão anti-Leishmania drogas para a seleção. Preparam-se soluções de estoque dos compostos de teste de drogas / em água ou DMSO, como mencionado na tabela reagente. Testar cada composto a 6 concentrações de droga. </li><li> Seriadamente diluído (1:5), as drogas padrão e compostos de teste numa placa de 96 poços, frescas ou tubos de 2 ml (para lâminas de câmara) com meio RPMI-1640 com 2% de FBS. Os medicamentos / concentrações de composto de teste neste prato são 2X de concentrações finais. </li><li> Lavar as placas de cultura e lâminas de câmara infectados com L. promastigotas donovani (a partir do passo 4.5), pelo menos, 5 vezes com soro isento, meio RPMI-1640. Adicionam-se 100 ul de meio de cultura (RPMI-1640 com 2% de FBS) em cada poço / câmara. As lavagens múltiplas são necessárias para assegurar a completa remoção de não-internalizadas promastigotas. </li><li> Adicionam-se 100 ul de meio de seriadamente diluídas padrão anti-Leishmania drogas ou os compostos de teste a cada poço ou câmara. Configure a infecçãoted células THP1 controla sem drogas, simultaneamente, em cada placa deslizante / câmara. </li><li> Incubar as placas e lâminas de câmara a 37 ° C, 5% CO 2 durante 48 horas. </li></ol> 6. Coloração Deslize Câmara, Imaging microscópio de fluorescência e Análise de Imagem para Quantificação de Infecção e Efeito de Tratamento de Drogas <ol><li> Após uma incubação de 48 horas, lava-se a câmara de corrediça 3 vezes com soro isento de meio RPMI-1640. Descasque as câmaras de plástico dos slides e consertar as células, mergulhando as lâminas em metanol por 30 seg. Deixe os slides em bio-capa sob o fluxo de ar para a secagem. </li><li> Prepara-se uma solução corante SYBR Green I (5X) por diluição (1:2000) no estoque (10.000 X) com água. </li><li> Coloração das lâminas, no escuro, com o verde SYBR diluída I mancha solução durante 15 min à temperatura ambiente, lava-se uma vez com água e deixar as lâminas sob o fluxo de ar para a secagem. </li><li> Coloque uma lamela de vidro cheio sobre o stained corrediça com a ajuda de meio de montagem. </li><li> Capturar as imagens digitais de células THP1: sem infecção (em branco), com a infecção (controlo), as células infectadas tratadas com diferentes fármacos padrão ou dos compostos de teste em diluições diferentes (Figura 3, 5 e 6)), utilizando um microscópio Nikon Eclipse 90I fluorescente acompanhado por elemento de software NIS 3,2 AR. </li><li> Contagem dos núcleos de macrófagos (grande) e os núcleos de parasita (pequeno com cinetoplasto) usando ImageJ (Figura 7), que é um publicamente disponível, baseado em Java programa de processamento de imagem desenvolvido no National Institutes of Health ( <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html" target="_blank">http://rsb. info.nih.gov / ij / download.html</a> ). Expressar os dados como o número de amastigotas por 100 células transformadas THP1. </li></ol> 7. O Parasita-Rescue-Transformação-Ensaio: lise controlada de L. donovani Amastigotas Macrófagos infectados<ol><li> Lava-se a microplaca de 96 poços a partir do passo 5,5 três vezes com soro isento de meio de cultura RPMI-1640. </li><li> Entre os detergentes diferentes testadas em diferentes concentrações, de 0,05% de tratamento de SDS durante 30 segundos é o ideal para a lise controlada (lise celular máxima, com perda mínima de viabilidade parasitas resgatados &#39;). </li><li> Remover o meio isento de soro a partir de cada cavidade, após a última lavagem e adicionar 20 ul de meio RPMI-1640 (com 0,05% de SDS) a cada poço. Agitar a placa durante 30 segundos, e adicionar 180 ul completo RPMI-1640 (com FBS a 10%) a cada poço. </li><li> Incubar as placas a 26 ° C, durante 48 horas, para a transformação de amastigotas resgatados para promastigotas. </li></ol> 8. Análise Quantitativa de promastigotas Transformado (ensaio alamarBlue) <ol><li> Após uma incubação de 48 h a 26 ° C, todas as formas amastigotas resgatados vivos são transformados em promastigotes (Figura 1D). Adicionar 10 ul de alamarBlue em cada cavidade da p 96 poçoslates. </li><li> Incubar as placas a 26 ° C durante a noite. </li><li> Após incubação durante a noite, ler as placas para fluorescência padrão num Fluostar Galaxy fluorímetro (BMG Lab Technologies) a 544 nm de excitação, 590 nm de emissão. </li><li> Preparar as curvas de dose-resposta (percentagem de crescimento em função da concentração do composto de fármaco ou de teste) com ExcelFit (Figuras 7-9) e IC de computação CI 50/90 valores de tais curvas (Tabela 1). </li></ol> 9. Padronização de THP1 Células à relação de Parasitos <ol><li> Padronizar as células THP1 a proporção de parasitas para determinar a sensibilidade do ensaio. Nota: infecção Baixo / alto número parasitas / pode comprometer com sensibilidade e seletividade do exame. </li><li> Padronizar as células à razão de THP1 parasitas, seguindo o protocolo descrito acima para a sementeira de células THP1 e infecção por Leishmania promastigotes (secção 3 e 4) excepto o uso diffrácios erent de células THP1 em parasitas como 1:1,25, 1:2,5, 1:5 e 1:10. </li><li> Configure a experiência tanto na câmara de 16-slide (para análise de imagem) e placa de 96 poços (para parasita resgate ensaio) formatos para comparar o resgate parasita e ensaios de análise de imagem. </li></ol> 10. Padronização dos detergentes diferentes para a lise celular controlada <ol><li> O principal objectivo desta experiência é para otimizar o protocolo para a lise controlada das células THP1 para alcançar o máximo / total THP1 lise células sem afetar significativamente a viabilidade dos parasitas amastigotas resgatados. </li><li> Testar diferentes detergentes, tais como Tween 20, Tween 80, Triton X-100, NP-40 e SDS em concentrações diferentes e durações de tratamento diferentes (Figura 2). </li><li> THP1 células à razão de parasitas é de 1:10 e de outras condições semelhantes como acima secções 1-8. </li><li> Teste a 0,05% SDS tratamento adicional para o tempo de tratamento diferentes para optimizar ainda mais a lise celular controlada. </li></ol>

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Não há conflitos de interesse declarados.

Há vários métodos disponíveis para os anticorpos anti-leishmaniose triagem de drogas baseadas em macrófagos amastigotas modelos. Os ensaios podem ser feitos com os macrófagos obtidos a partir de animais hospedeiros células de exsudado peritoneal (PEC nomeadamente), células de monócitos do sangue periférico (PBMC) de 6 ou derivadas da medula óssea (BMM macrófagos) ou em linhas de células monocíticas, tais como o rato (J774 e RAW264.7 ) 7 e humano (THP1, U937, HL-60) 8 células monocíticas. Os ensaios, que utilizam células de divisão de acolhimento, deve assegurar que os efeitos de confusão da atividade de drogas em ambos parasita e hospedeiro número de células são consideradas. Os macrófagos diferenciados primários coletados de várias fontes, tais como camundongos e ratos são não-divisão na natureza, mas estas preparações celulares não pode ter populações de células homogêneas. As linhas de células monocíticas células-derivados são homogéneas na natureza e são um melhor modelo para a despistagem de macrófagos-amastigota-baseado. Fora de diferentes linhas de células monocíticas, diferentiated THP1 células (linha de células humanas de leucemia monocítica aguda) pode formar uma monocamada não estão em divisão e oferecem uma alternativa atraente aos macrófagos isolados primários. O rastreio de macrófagos-amastigota baseada pode ser feito de várias maneiras. Avaliação microscópica clássica, baseada em célula direta e parasita contando 9 é um trabalho intensivo. A ausência de automação limita a utilidade deste ensaio. Contagem de células é demorado e pode dar determinação imprecisa de valores de IC50 desde determinação da viabilidade do parasita por meio de um procedimento de coloração é difícil. Muitos corantes fluorescentes e os anticorpos monoclonais podem ser utilizados para ensaios de citometria de fluxo 10, 11, mas estes testes também são limitados devido à menor sensibilidade e limitação do intervalo de tempo de fármaco para o tratamento de apenas um dia. Existem vários ensaios reporter genes disponíveis para quantificar o crescimento de formas amastigotas 12,13,14. Uma máquina automáticaed rastreio pode ser possível usando genes repórter, mas estes testes também têm certas desvantagens. Primeiro, a maioria destes ensaios necessitam de selecção de drogas para a manutenção da expressão epissómica dos genes repórter, o que pode não ser ideal para uma experiência de rastreio de drogas. A maneira pela qual o gene repórter é introduzido também podem influenciar as propriedades fisiológicas do parasita e têm um impacto sobre a triagem. Se o gene repórter é a parte de um plasmídeo epissómico, a saída relativa do repórter pode depender do número de cópias do plasmídeo transfectado (que varia de célula para célula), em vez de sobre a actividade do fármaco 14. Alguns parasitas repórter que são transformados parasitas não precisa de manter a pressão selectiva no gene repórter, no entanto, pode haver consequências biológicas ou por ruptura da arquitectura genómica ou apenas pela presença das proteínas repórter estranhos 15. Em alguns ensaios de gene repórter com base, existemquestões de sensibilidade e de fundo atividade 16. Mais importante, muitos dos ensaios de expressão do gene repórter, especialmente uma com a GFP repórter gene15, não podem diferenciar entre os amastigotas intracelulares vivos e mortos. Ensaios baseados em genes repórter da luciferase pode discernir entre vivas e mortas formas amastigotas, mas o substrato e tampão de lise de células para esses ensaios são caros em grande escala de triagem 17. Para superar estes deméritos e as limitações de anteriores ensaios de rastreio para macrófagos amastigota-based, temos desenvolvido e optimizado neste ensaio parasita salvamento e de transformação. Este ensaio baseia-se em células THP1, que têm boa homogeneidade e são não se dividem na natureza, como células hospedeiras. O ensaio Parasite-Rescue-Transformação-Ensaio aqui descrito é comparável ao ensaio baseado em Digital-Análise de Imagens-Direct-Contagem de amastigotas intracelulares. Microscopia de fluorescência e DIC, digital imagAs análises de e por ImageJ para contagem diferencial dos núcleos de macrófagos e os núcleos do parasita ainda mais refinado o ensaio de contagem, ao microscópio. Capturar as imagens em filtros de luz fluorescente e contraste de interferência diferencial (DIC) filtros melhoraram a qualidade da imagem digital para a contagem mais precisa dos parasitas intracelulares. Tanto imagens fluorescentes e DIC podem ser fundidas para obter as imagens digitais com contornos claros de macrófagos celulares e núcleos intracelular fluorescente. Os núcleos dos macrófagos e os núcleos parasita pode ser diferencialmente reconhecido com ImageJ. Portanto, tanto o Digital-Análise de Imagens-Direct-Contagem-Ensaio e Parasite-Rescue-Transformação-Ensaio têm o potencial para automação e aplicação em larga escala de triagem. Os passos críticos na Parasite-Rescue-Transformação Assay-se: (a) as lavagens repetidas de culturas de células THP1 após a exposição a formas promastigotas de Leishmania, para assegurar a remoção quase completa do estágio não-promastigotas institucionalizados e (b) a lise controlada das células infectadas com SDS THP1. Ambas as etapas podem também ser controlados com a automatização e não deve comprometer a taxa de transferência do ensaio. O segundo passo de lavagem, após a exposição das células infectadas por Leishmania THP1 para os medicamentos de teste / compostos remove os restantes não internalizadas parasitas, se houver. O Parasite-Rescue-Transformação Assay oferece vantagens significativas sobre os existentes gene repórter microscópico, e ensaios de análise de imagem. O ensaio é simples, robusta e reproduzível, pode ser automatizado de grande escala de triagem e, portanto, deve ter importante aplicação na triagem de grandes bibliotecas de compostos para a descoberta de novos medicamentos anti-leishmaniose. Além disso, o ensaio também pode ser aplicado para avaliar a infectividade do clínico, assim como, os isolados laboratoriais de Leishmania in vitro.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) </td><td> Sigma-Aldrich EUA </td><td> P1585 </td><td> Necessária para a diferenciação de células THP1. </td></tr><tr><td> RPMI-1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 23400021 </td><td></td></tr><tr><td> Lab-Tek Sistema de slides Câmara (16 Secção) </td><td> Thermo Scientific Nunc </td><td> 178599 </td><td></td></tr><tr><td> Limpar, de fundo plano, placas de 96 poços </td><td> BD Falcon </td><td> 353075 </td><td> Placas para realizar 96 poços da placa de ensaio </td></tr><tr><td> A anfotericina B </td><td> Sigma-Aldrich EUA </td><td> A4888 </td><td> Drogas anti-leishmaniose padrão dissolvem em DMSO (2 mg / ml) </td></tr><tr><td> Pentamidina isotionato de Salt </td><td> Sigma-Aldrich EUA </td><td> P 0547 </td><td> Drogas anti-leishmaniose padrão dissolvem em DMSO (2 mg / ml) </td></tr><tr><td> Miltefosina </td><td> EMD Biosciences EUA </td><td> 475841 </td><td> Drogas anti-leishmaniose padrão dissolvem em soro isento de meio RPMI-1640 (preparar fresco) (2 mg / ml) </td></tr><tr><td> Estibogluconato de sódio </td><td> EMD Biosciences EUA </td><td> 567565 </td><td> Drogas anti-leishmaniose padrão preparar em meio RPMI-1640 com FBS a 4%. (1 mg / ml) </td></tr><tr><td> Dodecil sulfato de sódio </td><td> Sigma-Aldrich EUA </td><td> L 5750 </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio de fluorescência </td><td> NIKON </td><td> ECLIPSE 90I </td><td></td></tr><tr><td> Fluorescência Microplate Reader </td><td> BMG </td><td> Polar Star Galaxy </td><td></td></tr><tr><td> Meio de Montagem </td><td> Sigma-Aldrich EUA </td><td> M 1289 </td><td></td></tr><tr><td> umlamarBlue </td><td> Abd Serotec </td><td> BUF012 B </td><td></td></tr><tr><td> SYBR Green I </td><td> Sigma-Aldrich EUA </td><td> S 9430 </td><td></td></tr><tr><td> Bicarbonato de sódio </td><td> Fisher Sci. </td><td> 523500 </td><td></td></tr><tr><td> Piruvato de sódio </td><td> Sigma-Aldrich EUA </td><td> P2256 </td><td></td></tr><tr><td> 2-mercaptoetanol </td><td> Sigma-Aldrich EUA </td><td> M6250 </td><td></td></tr><tr><td> Soro Fetal Bovino </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11050H </td><td></td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Sigma-Aldrich EUA </td><td> P9416 </td><td></td></tr><tr><td> Tween 80 </td><td> Sigma-Aldrich EUA </td><td> P6474 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma-Aldrich EUA </td><td> T8787 </td><td></td></tr><tr><td> NP-40 </td><td> Calbiochem </td&gt; <td> 492016 </td><td></td></tr></tbody></table>

um parasita ensaio de resgate e transformação de triagem leishmanicida contra intracelular<em&gt; leishmania donovani</em&gt; amastigotas em thp1 linha celular humana aguda monocytic leucemia

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

A leishmaniose é uma das doenças mais negligenciadas do mundo, em grande parte afetando os mais pobres dos pobres, principalmente em países em desenvolvimento. Mais de 350 milhões de pessoas são consideradas em risco de contrair a leishmaniose, e cerca de 2 milhões de novos casos ocorrem um ano. Leishmania donovani é o agente causador da leishmaniose visceral (LV), a forma mais fatal da doença. A escolha de drogas disponíveis para tratar a leishmaniose é limitada 2; tratamentos actuais proporcionam uma eficácia limitada e muitos são tóxicos nas doses terapêuticas. Além disso, a maioria das drogas de primeira linha de tratamento já perderam a sua utilidade, devido ao aumento da resistência a múltiplas drogas 3. O gasoduto atual de anti-Leishmania drogas também é severamente reduzida. São necessários esforços continuados para enriquecer um novo anti-leishmaniose oleoduto de descoberta de drogas, e este esforço depende da disponibilidade de modelos adequados de rastreio in vitro. Em promastigotas in vitro e ensaios 4 axênicas amastigotas cinco são utilizados principalmente para anti-leishmaniose triagem de drogas no entanto, pode não ser adequado devido a importantes celulares, diferenças fisiológicas, bioquímicas e moleculares em comparação com amastigotas intracelulares. Ensaios com macrófagos amastigotas modelos são considerados mais próximo das condições fisiopatológicas de leishmaniose, e são, portanto, o mais apropriado para a avaliação in vitro. Diferenciadas, não-humanos que dividem as células de leucemia aguda monocíticas (THP1) (faça um atraente) Em alternativa à isoladas macrófagos primários e podem ser utilizados para ensaiar a actividade anti-Leishmania de diferentes compostos contra amastigotas intracelulares. Aqui, apresentamos um ensaio parasita resgate e transformação com diferentes THP1 células infectadas in vitro com Leishmania donovani para a seleção de compostos puros e naturais prodtos extractos e determinação da eficácia contra as formas amastigotas de Leishmania intracelulares. O ensaio envolve os seguintes passos: (1) a diferenciação de células THP1 em que não se dividem macrófagos, (2) a infecção de macrófagos com L. donovani promastigotas metacíclicas, (3) tratamento de células infectadas com os medicamentos de teste, (4) a lise controlada de macrófagos infectados, (5) A libertação / salvamento de amastigotas e (6) transformação de formas amastigotas de promastigotas vivos para. O ensaio foi optimizada utilizando tratamento com detergente para a lise controlada de infectados por Leishmania THP1 células para alcançar salvamento quase completa de formas amastigotas viáveis ​​com um efeito mínimo sobre a sua capacidade de transformar a promastigotas. Macrófagos diferentes relações entre promastigotas foram testados para alcançar infecção máxima. Quantificação da infecção foi realizada por meio da transformação de vida, resgatados Leishmania amastigotas para promastigotas e avaliação de seu crescimento por uma alamarBlue ensaio fluorométrico, em microplacas de 96 poços. Este ensaio é comparável ao actualmente usado microscópico gene repórter, transgénicos e digitais-imagem ensaios de análise. Este ensaio é robusto e mede apenas os amastigotas intracelulares vivos em relação ao gene repórter e ensaios de análise de imagem, que não podem diferenciar entre os amastigotas vivos e mortos. Além disso, o ensaio foi validado com um painel de corrente de anti-Leishmania drogas e tem sido aplicado com sucesso em grande escala de triagem de compostos puros e de uma biblioteca de fracções de produtos naturais (Tekwani et al. Não publicado).

A análise quantitativa foi feito para ambos Digital Image Analysis-Direct-Contagem-Ensaio e Parasite-Rescue-Transformação Ensaio para 24, 48, 72 e 96 horas após o tratamento de drogas Na contagem infecção método direto, de L. donovani macrófagos infectados (THP1 células) foi calculada pela equação seguinte: <img alt="Equação 1" fo:content-width="3.75in" fo:src="/files/ftp_upload/4054/4054eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4054/4054eq1.jpg" /> Os amastigotas (determinada por contagem dos núcleos amastigotas) / 100 (células transformadas THP1 determinada por contagem contada em núcleos de células THP1) (Figura 7) é uma medida mais precisa de analisar o efeito de diferentes padrões ou compostos de teste do que a percentagem de células infectadas THP1 , conforme relatado em alguns trabalhos anteriores, porque este número está directamente relacionado com efeito geral de compostos, quer através de uma diminuiçãoem parasitas em macrófagos ou remoção total do parasita da cells.Infection macrófagos foi calculada a partir de imagens digitais de células infectadas THP1 tratadas com diferentes drogas padrão a diluições diferentes para vários intervalos de tempo (Figura 10 e Tabela 1). A leitura para fora para a Digital-Análise de Imagens-Direct-Contagem-ensaio foi amastigotas infection/100 transformado THP1 células, enquanto a leitura para fora para o Parasite-Rescue-Transformação-ensaio foi unidades relativas de fluorescência (RFU), o que é directamente proporcional ao número de formas amastigotas de Leishmania vivos resgatados dos macrófagos infectados e se transformar em promastigotes. O ensaio alamarBlue é utilizada rotineiramente para Leishmania triagem de drogas anti-promastigotas de Leishmania sp. O ensaio foi inicialmente padronizada e optimizado para a lise controlada de infectados por Leishmania THP1 células. O objetivo foi otimizar as condições para o detergente tretamento, que geram a lise quase completa de células THP1 com um efeito mínimo sobre a viabilidade das formas amastigotas resgatados. Figura 1 representa uma vista microscópica do protocolo do ensaio completo. THP1 intactas as células infectadas com amastigotas de Leishmania pode ser visto na figura 1A. A Figura 1B mostra a lise das células THP1 após tratamento com detergente. Figura 1C mostra resgatado Leishmania amastigotas, que foram parcialmente transformado em promastigotas e A Figura 1D mostra a transformação quase completa de amastigotas em promastigotas e sua proliferação subsequente. O crescimento destes promastigotas transformados podem ser quantitativamente controlada com adição de alamarBlue e medição da fluorescência num leitor de microplacas. O tratamento com NP-40 (Figura 2A) e Triton X-100 (Figura 2B) lisadas infectadas as células THP1, no entanto, que também influenciou a viabilidade etransformação das amastigotas resgatados. O tratamento com Tween 20 (Figura 2C) e Tween 80 (figura 2D) não causar a lise óptima de células THP1 resultantes em um salvamento incompleto de amastigotas como indicado por números baixos de promastigotas transformadas. O tratamento com SDS a 0,05% durante 30 segundos (Figura 2E) produziu a lise quase completa dos infectados por Leishmania THP1 células e não afectou a viabilidade e transformação de amastigotas resgatados. Optimização adicional mostrou que o tratamento de células com SDS a 0,05% por 20-30 segundos proporcionou maior emergência de formas amastigotas de Leishmania viáveis ​​(Figura 2F). Nas experiências subsequentes, o tratamento com SDS a 0,05% durante 30 segundos foi usado. Processo para o tratamento de SDS é a mesma para as placas únicas ou múltiplas. Em placas múltiplas, o tratamento com SDS foi implementado coluna por coluna, com uma pipeta multicanal. Meio isento de soro foi removido de todos os oito poços de uma coluna da placa e 20 mu &amp;; L de SDS a 0,05% foi adicionado em 8 poços da mesma coluna e diluída após 30 s com meio RPMI-1640 com FBS a 10%. Durante a padronização inicial do ensaio, as placas foram verificados sob o microscópio para a não-internalizadas promastigotas. Um mínimo de cinco lavagens foram necessárias para a remoção de parasitas antes da etapa 5 de tratamento de células de macrófagos infectados com compostos padrão e três lavagens foram necessários antes do passo 7 do tratamento de DSS. Assim, as células foram lavadas 8 vezes e não visíveis não internalizadas promastigotas permaneceu antes de lise de controlo infectadas células THP1. Análise de Imagem Digital e contagem direta As imagens digitais dos infectados por Leishmania THP1 células foram capturados em microscópio Nikon Eclipse 90I fluorescente após coloração com SYBR Green I. Tanto o núcleo de macrófagos Leishmania intracelular e núcleos com DNA cinetoplasto característica foram observados sob os filtros fluorescentes (Figura 3). Além disso, as imagens de células infectadas THP1 também foram capturadas sob DIC. Quando ambas as imagens foram mesclados, os contornos de THP1 células com formas amastigotas foram vistos mais claramente (Figura 4). O software ImageJ foi utilizado para analisar as imagens. ImageJ é de domínio público, baseado em Java, o programa de processamento de imagem desenvolvido no Instituto Nacional de Saúde ( <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html</a> ). ImageJ foi projetado com uma arquitetura aberta que fornece extensibilidade através de plugins Java e macros graváveis. Plugins personalizados aquisição, análise e processamento podem ser desenvolvidos usando ImageJ editor built-in e um compilador Java. Para contagem diferencial de THP1 núcleos das células e núcleos parasita por ImageJ, a imagem foi inaugurado em ImageJ. Contador de células foi encontrado em Analise opção no plugin do Software. A imagem foi inicializado e tipo de célula contra um foi selecionado para THP1 cnúcleos ell e tipo de célula contador 2 foi seleccionado para núcleos de parasita (Figura 3). A contagem diferencial foi realizada durante pelo menos 200 núcleos de células THP1 e os amastigotas intracelulares presentes nesses núcleos de células THP1. Uma comparação de parasita salvamento ensaio e método de análise de imagens foi feita para avaliação da infecciosidade de células THP1 com macrófagos diferente:. Promastigotas ratios (Figura 4) A Figura 5 representa a infectividade diferencial em células THP1 em macrófagos diferentes relações entre promastigotas. Ambos os métodos demonstraram resultados comparáveis ​​e o macrófago: razão de promastigotas de 1:10 produziu infectividade optimizada e reprodutível. Uma vez que as condições de ensaio parasite-rescue/transformation e a análise de imagem digital, foram optimizadas, a utilidade destes ensaios foi avaliado por anti-leishmaniose triagem de drogas. Os infectados por Leishmania THP1 células foram tratadas com diferentes concentrações de um padrãonti-Leishmania drogas ou seja, a anfotericina B, pentamidina e Miltefosina para diferentes intervalos de tempo variando de 24 a 96 h. O experimento para parasita resgatado ensaio / transformação foi feita em triplicado e da experiência para as células diretas método de contagem foi feita em duplicata. Figura 6 mostra imagens microscópicas do controle, controle não infectado infectados não tratados e Leishmania-infectados, tratados THP1 células. As curvas de resposta à dose foram preparados a partir do ensaio de parasita salvamento e transformação (concentração do fármaco vs parasitas transformadas) e o ensaio de análise de imagem (número de células THP1 amastigotes/100) (Figuras 7-9). A CI50 dos fármacos foram calculados ExcelFit e são apresentados na Tabela 1. Imagem Digital-Análise-Direct-Contagem-Ensaio e Parasite-Rescue-Transformação-Ensaio mostrou resultados comparáveis. Imagem Digital-Análise-Direct-Contagem-ensaio foi menos ideal durante os momentos iniciais de 24 e 48 h de drogas treatments, enquanto o parasita-Rescue-Transformação-Ensaio mostrou resultados mais consistentes com os valores relatados em todos os pontos de tempo durante a hora 24-96 depois de tratamentos com drogas. Esta diferença de resultados com Digital-Imagem-Análise-Direct-Contagem-Ensaio e Parasite-Rescue-Transformação-ensaio pode ser devido a presença de não-viáveis ​​amastigotas durante os períodos iniciais de tratamento de drogas em Digital Image Analysis-Direct-Contagem -Ensaio. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4054/4054fig1.jpg" /> Figura 1. Uma vista microscópica da Leishmania donovani amastigotas de salvamento e de transformação de promastigotas. A - aderentes THP1 células infectadas com Leishmania amastigotas; B - aderentes, infectados THP1 células após lise controlada C - Transformada promastigotas de Leishmania donovani das formas amastigotas resgatados de macrófagos infectados THP1 células D - Crescimento e proliferação de transformed Leishmania donovani promastigotas. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4054/4054fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4054/4054fig2.jpg" /> Figura 2. Análise Optimização de lise controlada das células infectadas THP1 para alcançar resgate máximo de formas amastigotas de Leishmania donovani vivos e sua transformação de promastigotas. De lise de células THP1 e resgate de formas amastigotas de Leishmania a partir das células infectadas com THP1 detergentes diferentes. Duas concentrações (0,05% e 0,1%) de detergente e dois períodos de tempo (30 seg e 60 seg) para o tratamento, foram testadas. RFU = unidades relativas de fluorescência. Cada barra representa a média de observações duplicadas. [A] NP-40 tratamento causou a lise das células THP1 e também afectou a viabilidade dos parasitas amastigotas resgatados. [B] Triton X-100 treatment causou a lise das células THP1 e também afectou a viabilidade dos parasitas amastigotas resgatados [C] Tween 80 causou lise parcial das células THP1 para resgatar os amastigotas. [D] Tween 80 causou lise parcial das células THP1 para resgatar os amastigotas. [E ] O tratamento SDS causou lise quase completa de THP1 células e não afetam a viabilidade das amastigotas resgatados em 0,05% / 30 seg. [F] O tratamento com SDS 0,05% para 20-30 seg causou lise quase completa de THP1 células e resgatou parasita viável amastigotas para transformar em promastigotas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4054/4054fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4054/4054fig3.jpg" /> Figura 3. Fluorescente imagem digital de uma célula diferenciada THP1 infectados in vitro com Leishmanium donovani amastigotas. O kDNA característica também pode ser visto com cada núcleo do parasita. O núcleo de macrófagos (mN) (1) e os núcleos parasita (pN) (2) pode ser marcado diferencialmente e diferencialmente contadas por ImageJ software de análise para avaliação quantitativa da infecção. A quantificação foi feita como o número de células THP1 amastigotes/100. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4054/4054fig4.jpg" /> Figura 4. Comparação entre Digital Image Analysis-Direct-Contagem-Ensaio (painel inferior) e Parasite-Rescue-Transformação-Ensaio (painel superior). O macrófago: razão de promastigotas de 1:10 produziu infecção óptimo. Ambos mostraram resultados comparáveis. O ensaio parasita resgate mostrou alguns valores de fundo. Cada barra mostra média de valores duplicados. <img alt="Figura 5" src = &quot;files/ftp_upload/4054/4054fig5.jpg /&quot; /&gt; Figura 5 THP1 células infectadas com promastigotas de Leishmania por THP1 diferente:. Relação promastigota. Os resultados quantitativos como o número de células THP1 amastigotes/100 são apresentados na Figura 4. <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4054/4054fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4054/4054fig6.jpg" /> Figura 6. Imagens digitais (fluorescente + DIC) de THP1 células infectadas com Leishmania donovani amastigotas após o tratamento com anti-Leishmania padrão medicamentos por períodos de tempo diferentes. Os resultados foram quantificados como o número de células THP1 amastigotes/100 e usada para calcular o crescimento percentual comparada com os controlos não tratados e de determinar os valores de IC 50. <img alt="Figura 7" fo: Conteúdo largura = &quot;4.75in&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/4054/4054fig7highres.jpg&quot; src = &quot;files/ftp_upload/4054/4054fig7.jpg /&quot; /&gt; Figura 7. Comparação de Imagem Digital-Análise de-Direct-Contagem-Ensaio e Parasite-Rescue-Transformação-Ensaio para anti-leishmaniose triagem de drogas (Amophotericin B). Os macrófagos infectados foram tratados com diferentes concentrações de drogas anti-leishmaniose padrão para diferentes períodos. IC 50 (ug / ml) Os valores foram calculados a partir da curva de resposta à dose por Excelfit. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4054/4054fig7large.jpg" target="_blank">para ver figura maior</a> . <img alt="Figura 8" fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/4054/4054fig8highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4054/4054fig8.jpg" /> Figura 8. Comparação de Imagem Digital-Análise de-Direct-Contagem-Ensaio e Parasite-Rescue-Transformação-Ensaio para umnti-leishmaniose triagem de drogas (pentamidina). Os macrófagos infectados foram tratados com diferentes concentrações de drogas anti-leishmaniose padrão para diferentes períodos. IC 50 (ug / ml) Os valores foram calculados a partir das curvas de resposta à dose por Excelfit. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4054/4054fig8large.jpg" target="_blank">para ver figura maior</a> . <img alt="Figura 9" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/4054/4054fig9highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4054/4054fig9.jpg" /> Figura 9. Comparação de Imagem Digital-Análise de-direto-ensaio-Contagem e-Parasita-Salvamento Transformação Ensaio para anti-leishmaniose triagem de drogas (Mitefosine). Os macrófagos infectados foram tratados com diferentes concentrações de drogas anti-leishmaniose padrão para diferentes períodos de tempo. CI50 (ug / ml) Os valores foram calculados a partir das curvas de resposta à dose por Excelfit.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4054/4054fig9large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <table border="1"><tbody><tr><td rowspan="2"> Drogas teste </td><td colspan="2"> 24 hr uma </td><td colspan="2"> 48 hr uma </td><td colspan="2"> 72 hr uma </td><td colspan="2"> 96 hr uma </td></tr><tr><td> B IACA </td><td> PRTA c </td><td> B IACA </td><td> PRTA c </td><td> B IACA </td><td> PRTA c </td><td> B IACA </td><td> PRTA c </td></tr><tr><td> A anfotericina B </td><td> 0,24 ± 0,03 </td><td> 0,17 ± 0,01 * </td><td> 0,12 ± 0,04 </td><td> 0,20 ± 0,07 </td><td> 0,06 ± 0,01 </td><td> 0,06 ± 0,01 </td><td> 0,11 ± 0,03 </td><td> 0,10 ± 0,03 </td></tr><tr><td> Pentamidina </td><td> &gt; 10 </td><td> 2,55 ± 1,16 * </td><td> 2,88 e plusmn; 0,58 </td><td> 1,43 ± 0,91 </td><td> 1,24 ± 0,35 </td><td> 1,52 ± 0,16 </td><td> 0,71 ± 0,63 </td><td> 0,98 ± 0,33 </td></tr><tr><td> Miltefosina </td><td> 0,38 ± 0,02 </td><td> 0,19 ± 0,08 * </td><td> 0,24 ± 0,06 </td><td> 0,30 ± 0,08 </td><td> 0,36 ± 0,02 </td><td> 0,16 ± 0,06 </td><td> 0,21 ± 0,15 </td><td> 0,17 ± 0,10 </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Comparação de Imagem Digital-Análise de-Direct-Contagem-Ensaio e Parasite-Rescue-Transformação-Ensaio para anti-leishmaniose triagem de drogas. Os macrófagos infectados foram tratados com diferentes concentrações de drogas anti-leishmaniose padrão para diferentes períodos. CI50 (ug / ml) Os valores foram calculados a partir das curvas de resposta à dose por Excelfit (Figuras 7-9) uma Horas após o tratamento medicamentoso;. B Contagem IACA = Análise de Imagem e DirectEnsaio; c PRTA = Parasite-Salvamento e Ensaio de Transformação. Os valores fornecidos são IC50 (concentração do fármaco que causa uma inibição de 50% no crescimento do parasita) como ug / ml, e são a média ± SD de pelo menos três experiências. * Estatisticamente diferente (p &lt;0,05) em comparação com os valores de IC50 com IACA.

Um ensaio de parasita resgate e transformação com células infectadas THP1<em&gt; In vitro</em&gt; Com<em&gt; Leishmania donovani</em&gt; Foi otimizado para anti-leishmaniose triagem de drogas. O ensaio envolve a diferenciação de células THP1, a infecção com promastigotas, o tratamento com medicamentos de teste, na lise controlada dos macrófagos infectados, resgate de amastigotas, transformação de promastigotas e crescimento e proliferação de promastigotas de monitorização com um ensaio fluorimétrico.

Um parasita Ensaio de Resgate e Transformação de Triagem leishmanicida contra intracelular<em&gt; Leishmania donovani</em&gt; Amastigotas em THP1 linha celular humana aguda Monocytic Leucemia

A leishmaniose é uma das doenças mais negligenciadas do mundo, afetando amplamente os mais pobres entre os pobres, principalmente em países em desenvolvimento. Mais de 350 milhões...

O objetivo geral da tecnologia experimental demonstrada aqui é triar compostos contra o crescimento e a proliferação da fase intracelular de amastigotas de Leishmania donovani, o agente causador da leishmaniose visceral, com o objetivo principal de descobrir novas drogas para o tratamento da leishmaniose. Primeiramente, células humanas de leucemia monocítica aguda THP-1 são diferenciadas in vitro em macrófagos aderentes; essas células THP-1 diferenciadas são então infectadas com promastigotas dos parasitas Leishmania donovani, permitindo a invasão dos promastigotas nos macrófagos THP-1, sua transformação em amastigotas e proliferação intracelular. Em seguida, os macrófagos THP-1 infectados com Leishmania são expostos a compostos em teste e drogas padrão, seguidos por lise controlada, resgate dos amastigotas, transformação dos amastigotas remanescentes de volta em promastigotas e quantificação dos promastigotas por ensaios colorimétricos de crescimento celular.Resultados obtidos que demonstram o efeito anti-mania de compostos em teste e medicamentos padrão sobre o crescimento e a proliferação intracelular, com base na quantificação de am mestres intracelulares de cabras. A lemaniose é uma grave ameaça à saúde global, especialmente em regiões tropicais do mundo. Novos medicamentos com perfis terapêuticos superiores para tratar esta doença são urgentemente necessários.Nós, do Centro Nacional de Pesquisa em Produtos Naturais, lançamos um programa multidirecional para a descoberta de novos tratamentos para doenças parasitárias tropicais. Diferentemente dos ensaios de Rogen e de análise de imagens microscópicas, que podem não distinguir entre os MSTs intracelulares vivos e mortos, este ensaio SA mede apenas os MSTs intracelulares vivos. Otimizamos um ensaio de resgate e transformação de parasitas com células TP diferenciadas, infectadas in vitro com a limânia, para triagem de compostos puros e extratos de produtos naturais e determinação da eficácia contra a limânia intracelular.Os detalhes experimentais deste ensaio serão demonstrados pelo Sr. Ra, que é o biólogo de pesquisa e desenvolvimento do meu laboratório e realiza este ensaio, e pelo Sr. RA Sahu, que também atua como biólogo de pesquisa e desenvolvimento no meu laboratório. Existem quatro etapas básicas no ensaio. A primeira etapa é o semeamento e a diferenciação terminal de células THP-1.O passo dois é a infecção in vitro de células TP1 diferenciadas com formas promastigotas de L. manna. O passo três é o tratamento de macrófagos infectados com Leishmania com os compostos em teste ou fármacos padrão. E o passo quatro é a quantificação do crescimento e proliferação dos parasitas de Leishmania por meio de análise de imagens microscópicas ou ensaios de resgate e transformação de parasitas.Colete uma cultura de quatro dias de macrófagos THP-1 e prepare uma suspensão celular no meio RPMI suplementado com 10% de FBS ativado pelo calor, com uma concentração de 2,5 vezes 10 à quinta células por mililitro. Adicione 25 nanogramas por mililitro de PMA às células para induzir a diferenciação. Em seguida, transfira 200 microlitros da suspensão celular para cada poço de uma placa de 96 poços e para cada câmara de uma lâmina de vidro com 16 câmaras. Após o plaqueamento das células, coloque a lâmina e a placa de 96 poços em um incubador a 37 graus Celsius e incube as células durante a noite para permitir que ocorra uma diferenciação celular quase completa.Para a infecção, utilize uma cultura de parasita de cabra ProMaster com cinco a seis dias de idade, na qual a maioria dos organismos esteja na fase infecciosa metacíclica. Diferentemente da fase procíclica, em que as formas de ProMaster são células elipsoides curtas com um flagelo curto, motilidade reduzida e frequentemente encontradas em rosáceas, os organismos metacíclicos infecciosos podem ser reconhecidos por sua forma cilíndrica longa e alta motilidade.Colete os parasitas e prepare uma suspensão ProMaster de cabra com 2,5 vezes 10 à sexta potência de parasitas por mililitro em RPMI com 2% de FBS. Retire as culturas celulares THP-1 diferenciadas do incubador, processando a placa de 96 poços e a lâmina de vidro. Em paralelo, remova o sobrenadante das culturas, depois lave as células adicionando meio livre de soro previamente aquecido. Remova o meio sem soro e substitua por 200 microlitros por poço da suspensão ProMaster de cabra, obtendo uma proporção de 10 parasitas para cada célula THP-1.Para os poços de controle, adicione 200 microlitros de meio 2%F-P-S-R-P-M-I em vez da suspensão de parasitas. Após a adição dos parasitas, incube as culturas em co durante 24 horas a 37 graus Celsius para permitir que a infecção ocorra a partir de soluções estoque da droga a ser testada. Prepare seis diluições seriadas de um para cinco em 2%F-B-S-R-P-M-I, de modo que as concentrações de cada diluição sejam o dobro da concentração final de teste pretendida.A concentração como padrão de controle de fármacos antimaláricos, como anfotericina B, pentamidina, melarsópio, fosfato e gluconato de antimônio sódico, pode ser usada antes de adicionar os fármacos aos cultivos co-cultivados. Lave repetidamente as células TP uma placa e lâmina conforme descrito anteriormente. Lave as células pelo menos cinco vezes para remover quaisquer caprinos ProMaster não internalizados.Em seguida, adicione 100 microlitros de 2%F-B-S-R-P-M-I e 100 microlitros de cada solução de fármaco a cada poço ou câmara, e incube a placa e a lamínula a 37 graus Celsius por 48 horas após o tratamento com o fármaco. Lave a câmara. Passe a lamínula três vezes em meio livre de soro.Retire cuidadosamente as câmaras de plástico da lâmina e fixe as células imergindo a lâmina em metanol por 30 segundos. Coloque a lâmina em uma cabine de segurança biológica com fluxo laminar para secar. Enquanto isso, prepare uma solução cinco vezes concentrada de cyber green.Uma vez que a lâmina esteja seca, mergulhe-a em cyber green para corar o DNA celular e parasitário. Incube a amostra no escuro por 15 minutos à temperatura ambiente. Após a etapa de coloração, lave a lâmina com água e deixe secar.Usando meio de montagem, coloque uma lamínula de vidro sobre a lâmina. Em seguida, observe as amostras utilizando um microscópio de fluorescência e capture imagens de cada câmara em células não infectadas, onde apenas o núcleo do macrófago é visível; em células infectadas, os núcleos dos parasitas e os canlas podem ser observados no citoplasma celular, indicando a presença de parasitas intracelulares l Donny.Para quantificar a infecção, utilize o ImageJ para calcular a porcentagem de infectividade, que é o número de núcleos de am mestre cabrito multiplicado por 100 dividido pelo número de núcleos de macrófagos no ensaio de resgate do parasita. Primeiramente, lave a placa de co-cultura de 96 poços três vezes com meio RPMI sem soro para lisar as células em 20 microlitros de RPMI com 0,05% de S-D-S. Agite a placa durante 30 segundos em cada poço.Em seguida, adicione 180 microlitros de 10% F-B-S-R-P-M-I por poço. O tempo de tratamento com SDS não deve exceder 30 segundos para obter uma lise controlada do macrófago sem qualquer efeito sobre a viabilidade do a master resgatado. Incube a placa com cabras a 26 graus Celsius durante 48 horas para permitir a transformação e proliferação do a master visível resgatado em pro master cabras.Para quantificar os pro cabras mestres, adicione 10 microlitros de azul de alamar a cada poço da placa de 96 poços e incube-a a 26 graus Celsius durante a noite. Após essa incubação, quantifique os parasitas vivos lendo a placa em um fluorímetro de fluorescência padrão. Na ausência de fármacos, a porcentagem de infecção aumenta com o número de cabras mestres presentes em relação ao número de macrófagos.Além disso, a quantidade de parasitas sobreviventes determinada pelo ensaio de resgate correlaciona-se bem com a porcentagem de infecção na presença de concentrações crescentes de anfotericina B. O número de parasitas resgatados diminui de maneira dependente da dose. O ensaio de resgate e transformação de parasitas pode ser resumido com vistas microscópicas sequenciais.Esta imagem mostra células THP-1 intactas em cultura infectadas com Amma goats luxuriante. Essas células THP-1 infectadas são submetidas a uma lise controlada para recuperar Amma goats vivos. Os Amma goats vivos recuperados da cultura de células THP-1 infectadas transformam a cultura em cabras ProMaster.Esses cabritos ProMaster transformados crescem e proliferam em cultura. O número total de cabritos ProMaster em cultura é diretamente proporcional ao número de cabritos oma intracelulares vivos. Este ensaio foi otimizado para o controle da licença de células THV um infectadas por limânia.O objetivo foi otimizar as condições para o tratamento com detergente, o que provocará lise quase completa das células THV uma com efeito mínimo sobre a TY dos códigos MST de resgate. Este passo é muito crítico neste ensaio. O demonstrador do ensaio de resgate de parasitas descrito aqui também pode ser aplicado para avaliar a infectividade de diferentes espécies de parasitas linia que causam leishmaniose cutânea ou mucocutânea em diferentes linhagens celulares de micro coração, bem como diferentes isolados de campo de lenia ou linhagens celulares de parasitas geneticamente manipuladas.Tanto o resgate do parasita como SA quanto a análise de imagem como SA mostram resultados comparáveis. Eles têm potencial para automação e aplicação em triagem em larga escala. Aplicamos com sucesso este ensaio na triagem de mais de 16.000 frações preparadas por fracionamento de alto rendimento de produtos naturais disponíveis em nosso centro.Também otimizamos a análise de imagens como ensaio ao combinar as imagens capturadas com filtros DIC e fluoresceína e à quantificação da infecção com o ImageJ. O ImageJ é um programa público de processamento de imagens baseado em Java, originalmente desenvolvido no NIH. Por meio deste ensaio, diversas frações de produtos naturais com compostos novos foram identificadas como novas moléculas promissoras para a descoberta de fármacos para o trato intestinal.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

In vivo de imagens de parasitas Leishmania transgênicas em um host ao vivo

Este vídeo investiga a virulência de Leishmania tratando macrófagos com promastigotas metacíclicos, resultando na formação de amastigotas intracelulares. A confirmação da virulência de Leishmania é obtida através da coloração com corante fluorescente de ácido nucleico. Essa percepção pode contribuir para o desenvolvimento de novas terapias para a leishmaniose.

Avaliação da virulência de Leishmania em macrófagos cultivados

Este vídeo demonstra um ensaio para quantificar o crescimento intracelular de parasitas em macrófagos derivados da medula óssea (BMMs). As células de macrófagos estão infectadas com os estágios invasivos móveis e imóveis de Leishmania, promastigotas metacíclicos e amastigotas, respectivamente. Os parasitas invadem os macrófagos, internalizando-se em um vacúolo parasitóforo e se multiplicando em seu interior. O crescimento do parasita intracelular é quantificado usando um microscópio após a...

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Um protocolo para sintetizar peptóides com funcionalidade catiônica mista na mesma sequência é apresentado (monômeros do tipo lisina e arginina). Testes subsequentes desses compostos contra Leishmania mexicana, os protozoários parasitas causadores da leishmaniose cutânea, também são descritos.

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Todas as espécies de Leishmania patogênicas residem e replicam no interior de macrófagos de seus hospedeiros vertebrados. Aqui, apresentamos um protocolo para infectar murino macrófagos derivados da medula óssea em cultura com Leishmania, seguido por quantificação exacta da cinética de crescimento intracelular. Esse método é útil para estudar os fatores individuais que influenciam a interação patógeno-hospedeiro e virulência de Leishmania .

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O mecanismo associado à fagocitose na infecção por Leishmania permanece mal compreendido. Aqui, descrevemos métodos para avaliar os primeiros eventos ocorridos durante a interação da Leishmania com as células hospedeiras.

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Apresenta-se aqui um protocolo que utiliza promastigotas maiores de Leishmania para determinar a ligação, citotoxicidade e sinalização induzidas por toxinas formadoras de poros. É fornecida uma prova de conceito com estreptolisina O. Outras toxinas também podem ser usadas para alavancar os mutantes genéticos disponíveis em L. major para definir novos mecanismos de resistência a toxinas.

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Aqui, descrevemos a metodologia usada para gerar cepas de L. panamensis e L . donovani expressando o gene para eGFP como um transgene integrado estável usando o sistema pLEXSY. Os parasitas transfectados foram clonados por diluição limitante, e os clones com maior intensidade de fluorescência em ambas as espécies foram selecionados para uso posterior em ensaios de triagem de drogas.

Desenvolvimento de Cepas de Espécies de Leishmania com Expressão Constitutiva de eGFP

Aqui apresentamos uma avaliação longitudinal de hamsters dourados infectados intraperitonealmente (IP) ou via intragengival (IG) com L. infantum-Luc por imagem bioluminescente e por PCR. Os hamsters foram avaliados 1 dia após a infecção (1 dpi), 1 semana após a infecção (8 dpi) e 3 semanas após a infecção (22 dpi) e eutanasiados aos 50dpi e 8 meses após a infecção.

In vivo Imagem de hamsters infectados por Leishmania infantum por inoculação gengival de amastigotas axênicas expressando luciferase

Aprenda a realizar ensaio de resgate e transformação parasitária para triagem de fármacos anti-leishmania contra amastigotas intracelulares de Leishmania donovani em células THP1 diferenciadas. Este método otimizado quantifica apenas amastigotas vivas, aumentando a precisão na descoberta de novos tratamentos para leishmaniose visceral.

Um parasita Ensaio de Resgate e Transformação de Triagem leishmanicida contra intracelular Leishmania donovani Amastigotas em THP1 linha celular humana aguda Monocytic Leucemia (Vídeo) | JoVE Journal

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