Name: A coloração imuno-histoquímica de B7-H1 (PD-L1) na histológicos em parafina lâminas de tecido adenocarcinoma do pâncreas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: Aprenda a técnica de coloração imuno-histoquímica para avaliar a expressão de B7-H1 (PD-L1) em tecidos de adenocarcinoma pancreático. Este método permite visualizar a localização proteica no microambiente tumoral.

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EB, KMB, e HX contribuir igualmente. Este estudo foi financiado pelo NCI SPORE em Cânceres Gastrointestinais P50 CA062924, CA148964 NIH K23, Lustgarten Foundation, Viragh Foundation, ASCO Young Investigator Award, NIH 5T32 CA0090701-28 Formação Grant, Sol Goldman Centro de cancro do pâncreas, e da Fundação Nacional de Pâncreas.

B7-H1/PD-L1, um membro da família B7 de imuno-regulação de superfície celular de proteínas, tem um papel importante na regulação negativa de respostas mediadas por células imunitárias através da sua interacção com o seu receptor, a morte programada-1 (DP -1) 1,2. A sobre-expressão de B7-H1 por células tumorais foi observado em vários cancros humanos, incluindo o melanoma, glioblastoma, e carcinomas do pulmão, mama, cólon, ovário e células renais, e tem sido mostrado para danificar anti-tumorais T- imunidade celular 3-8. Recentemente, a expressão B7-H1 por tecidos de adenocarcinoma do pâncreas foi identificado como um potencial marcador de prognóstico 9,10. Além disso, o bloqueio de B7-H1, em um modelo de rato de cancro pancreático foi mostrado para produzir uma resposta anti-tumor 11. Estes dados sugerem a importância de B7-H1 como um potencial alvo terapêutico. Anticorpos anti-B7-H1 bloqueio são, portanto, está sendo testado em ensaios clínicos para humana múltiplatumores sólidos, incluindo melanoma e cancros do pulmão, do cólon, estômago, rim e pâncreas 12. A fim de, eventualmente, ser capaz de identificar os doentes que irão beneficiar de B7-H1 terapias com alvo, é crítico para investigar a correlação entre a expressão e localização de B7-H1 e a resposta do paciente ao tratamento com os anticorpos B7-H1 bloqueio. Examinando a expressão de B7-H1 em tecidos pancreáticos humanos através de adenocarcinoma imunohistoquímica dará um melhor entendimento de como esta molécula de sinalização co-inibidor contribui para a supressão da imunidade antitumoral em microambiente do tumor. O anticorpo anti-B7-H1 monoclonal (clone 5H1), desenvolvido por Chen e colaboradores demonstrou produzir resultados fiáveis ​​em criocortes de coloração de vários tipos de tecidos neoplásicos humanos 4,8, mas a coloração de lâminas embebidas em parafina tinha sido um desafio até Recentemente, 13-18. Nós desenvolvemos o staini B7-H1ng protocolo para slides incluídos em parafina de tecidos de adenocarcinoma do pâncreas. O protocolo de coloração B7-H1 descrito aqui produz a coloração das membranas e citoplasmática consistente de B7-H1 com pouco fundo. 1. De-parafinization <ol><li> Asse desliza a 55 ° C durante 20 min. </li><li> Em um capuz químico, mergulhe slides em xileno por 10 min. </li><li> Imergir as lâminas em xileno fresco por 10 min. </li><li> Imergir desliza em etanol a 100% durante 5 min. </li><li> Imergir desliza em etanol a 100% fresco durante 5 min. </li><li> Imergir desliza em etanol a 95% durante 5 min. </li><li> Imergir desliza em etanol a 80% durante 5 min. </li><li> Imergir desliza em água desionizada durante 5 min. </li></ol> 2. A recuperação antigênica <ol><li> Imergir as lâminas em tampão Tris-EDTA (pH 9,0) e de calor em uma panela de pressão a 125 ° C durante 30 seg, depois 90 ° C durante 10 seg. </li><li> Deixe esfriar por lâminas de 60 min. </li><li> Imergir as lâminas em TBST por 5 min; REPEmenos duas vezes. </li></ol> 3. Coloração <ol><li> Limpe soluções em volta do tecido nos slides. Marcar um círculo em torno do tecido com uma caneta hidrofóbica. </li><li> Colocar as lâminas numa câmara de humidade e evitar a secagem do tecido na lâmina durante o processo de coloração inteiro. Colocar uma gota (aproximadamente 200 uL ou superior para cobrir a área do tecido completamente) de bloqueio da peroxidase no círculo hidrofóbico sobre a lâmina e incubar no bloqueio da peroxidase, durante 5 min. </li><li> Lavar as lâminas com TBST, e depois colocar em TBST durante 5 minutos. </li><li> Depositar uma gota de um tampão de bloqueio BLOCK ACE em cada lâmina e incubar durante 15 min. </li><li> Lavar as lâminas com TBST, e depois colocar em TBST durante 5 minutos. </li><li> Colocar uma gota de solução de Avidina em cada lâmina e incubar durante 15 min. </li><li> Lavar as lâminas com TBST, e depois colocar em TBST durante 5 minutos. </li><li> Colocar uma gota de solução de biotina em cada lâmina e incubar durante 15 min. </li><li> Lavar slides com TBST, e depois colocar em TBST durante 5 minutos. </li><li> Incubar as lâminas com a diluição de 1:1000 de anticorpo de ratinho anti-B7-H1 monoclonal (clone 5H1) ou de um rato de controlo de isotipo IgG1 κ em 200 ul de TBST, a 4 ° C durante a noite, durante 22 h + / - 1 h. A concentração de anticorpo final em TBST é 2,57 ng / ml. </li><li> Lavar as lâminas com TBST, e depois colocar em TBST durante 5 minutos. Repita duas vezes. </li><li> Incubar as lâminas com um conjugado de biotina anti-ratinho de rato-IgG1 anticorpo secundário, a uma concentração de 1:500 (em 200 ul de solução de cabra 2% de soro) durante 30 minutos. </li><li> Lavar as lâminas com TBST, e depois colocar em TBST durante 5 minutos. Repita duas vezes. </li><li> Depositar uma gota de um complexo de estreptavidina-biotina (deve ser preparada, pelo menos, 30 min antes da sua utilização) em cada lâmina e incubar durante 15 min. </li><li> Lavar as lâminas com TBST, e depois colocar em TBST durante 5 minutos. Repita duas vezes. </li><li> Colocar uma gota de Reagente de Amplificação (diluído 2:1 com TBST) em cada lâmina e incubar durante 4 min. </li><li> Lavar as lâminas com TBST, e depois colocar em TBST durante 5 minutos. Repita duas vezes. </li><li> Colocar uma gota de Estreptavidina-HRP em cada lâmina e incubar durante 15 min. </li><li> Lavar as lâminas com TBST, e depois colocar em TBST durante 5 minutos. Repita duas vezes. </li><li> Colocar uma gota de 3,3-diaminobenzidina (DAB) e substrato cromogénio em cada lâmina e desenvolver a cor durante 2 min. </li><li> Imediatamente após o desenvolvimento de cor, lavagem das lâminas com DDQ 2 O durante 1-2 min. </li><li> Incubar as lâminas com uma gota de hematoxilina durante 90 segundos. </li><li> Lava-se com DDQ 2 O durante 1-2 min. </li><li> Lavar com água corrente e sabão por 1-2 min. </li><li> Lava-se com DDQ 2 O durante 1-2 min. </li></ol> 4. Desidratação e montagem <ol><li> Imergir as lâminas em etanol a 80% durante 3 min. </li><li> Imergir as lâminas em etanol a 95% durante 3 min. </li><li> Imergir as lâminas em etanol a 100% durante 5 min. Repetir. </li><li> Mergulhe as lâminas em xilol por 5 min. Repetir. </li><li> Adicione uma gota deCytoseal 60 para o slide e colocar a lamela. </li></ol> A Tabela 1 enumera os reagentes utilizados nos procedimentos acima descritos.

<ol><li>Flies, D. B., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+new+B7s%3A+playing+a+pivotal+role+in+tumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunother%22%5BJournal%5D)">The new B7s: playing a pivotal role in tumor immunity.</a> J. Immunother. 30, 251-260 (2007).</li>
<li>Dong, H., Zhu, G., Tamada, K., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B7-H1%2C+a+third+member+of+the+B7+family%2C+co-stimulates+T-cell+proliferation+and+interleukin-10+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">B7-H1, a third member of the B7 family, co-stimulates T-cell proliferation and interleukin-10 secretion.</a> Nat. Med. 5, 1365-1369 (1999).</li>
<li>Curiel, T. J., Wei, S., Dong, H., Alvarez, X., Cheng, P., Mottram, P., Krzysiek, R., Knutson, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockade+of+B7-H1+improves+myeloid+dendritic+cell-mediated+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Blockade of B7-H1 improves myeloid dendritic cell-mediated antitumor immunity.</a> Nat. Med. 9, 562-567 (2003).</li>
<li>Dong, H., Strome, S. E., Salomao, D. R., Tamura, H., Hirano, F., Flies, D. B., Roche, P. C., Lu, J., Zhu, G. Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDong%2C+H+%22Nat.+Med%22">Nat. Med</a>. 8, 793-800 (2002).</li>
<li>Dong, H., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B7-H1+pathway+and+its+role+in+the+evasion+of+tumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Med.+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">B7-H1 pathway and its role in the evasion of tumor immunity.</a> J. Mol. Med. (Berl). 81, 281-287 (2003).</li>
<li>Strome, S. E., Dong, H., Tamura, H., Voss, S. G., Flies, D. B., Tamada, K., Salomao, D., Cheville, J., Hirano, F., Lin, W., Kasperbauer, J. L., Ballman, K. V., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B7-H1+blockade+augments+adoptive+T-cell+immunotherapy+for+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">B7-H1 blockade augments adoptive T-cell immunotherapy for squamous cell carcinoma.</a> Cancer Res. 63, 6501-6505 (2003).</li>
<li>Hirano, F., Kaneko, K., Tamura, H., Dong, H., Wang, S., Ichikawa, M., Rietz, C., Flies, D. B., Lau, J. S., Zhu, G., Tamada, K., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockade+of+B7-H1+and+PD-1+by+monoclonal+antibodies+potentiates+cancer+therapeutic+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Blockade of B7-H1 and PD-1 by monoclonal antibodies potentiates cancer therapeutic immunity.</a> Cancer Res. 65, 1089-1096 (2005).</li>
<li>Thompson, R. H., Gillett, M. D., Cheville, J. C., Lohse, C. M., Dong, H., Webster, W. S., Krejci, K. G., Lobo, J. R., Sengupta, S., Chen, L., Zincke, H., Blute, M. L., Strome, S. E., Leibovich, B. C., Kwon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Costimulatory+B7-H1+in+renal+cell+carcinoma+patients%3A+Indicator+of+tumor+aggressiveness+and+potential+therapeutic+target%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Costimulatory B7-H1 in renal cell carcinoma patients: Indicator of tumor aggressiveness and potential therapeutic target.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17174-17179 (2004).</li>
<li>Geng, L., Huang, D., Liu, J., Qian, Y., Deng, J., Li, D., Hu, Z., Zhang, J., Jiang, G., Zheng, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B7-H1+up-regulated+expression+in+human+pancreatic+carcinoma+tissue+associates+with+tumor+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cancer+Res.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">B7-H1 up-regulated expression in human pancreatic carcinoma tissue associates with tumor progression.</a> J. Cancer Res. Clin. Oncol. 134, 1021-1027 (2008).</li>
<li>Loos, M., Giese, N. A., Kleeff, J., Giese, T., Gaida, M. M., Bergmann, F., Laschinger, M., WB, M., Friess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+significance+and+regulation+of+the+costimulatory+molecule+B7-H1+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Clinical significance and regulation of the costimulatory molecule B7-H1 in pancreatic cancer.</a> Cancer Lett. 268, 98-109 (2008).</li>
<li>Okudaira, K., Hokari, R., Tsuzuki, Y., Okada, Y., Komoto, S., Watanabe, C., Kurihara, C., Kawaguchi, A., Nagao, S., Azuma, M., Yagita, H., Miura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockade+of+B7-H1+or+B7-DC+induces+an+anti-tumor+effect+in+a+mouse+pancreatic+cancer+model%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Blockade of B7-H1 or B7-DC induces an anti-tumor effect in a mouse pancreatic cancer model.</a> Int. J. Oncol. 35, 741-749 (2009).</li>
<li>Wang, S., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunobiology+of+cancer+therapies+targeting+CD137+and+B7-H1%2FPD-1+cosignal+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunobiology of cancer therapies targeting CD137 and B7-H1/PD-1 cosignal pathways.</a> Curr. Top Microbiol. Immunol. 344, 245-267 (2011).</li>
<li>Thompson, R. H., Webster, W. S., Cheville, J. C., Lohse, C. M., Dong, H., Leibovich, B. C., Kuntz, S. M., Sengupta, S., Kwon, E. D., Blute, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B7-H1+glycoprotein+blockade%3A+a+novel+strategy+to+enhance+immunotherapy+in+patients+with+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Urology%22%5BJournal%5D)">B7-H1 glycoprotein blockade: a novel strategy to enhance immunotherapy in patients with renal cell carcinoma.</a> Urology. 66, 10-14 (2005).</li>
<li>Thompson, R. H., Kuntz, S. M., Leibovich, B. C., Dong, H., Lohse, C. M., Webster, W. S., Sengupta, S., Frank, I., Parker, A. S., Zincke, H., Blute, M. L., Sebo, T. J., Cheville, J. C., Kwon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+B7-H1+is+associated+with+poor+prognosis+in+renal+cell+carcinoma+patients+with+long-term+follow-up%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Tumor B7-H1 is associated with poor prognosis in renal cell carcinoma patients with long-term follow-up.</a> Cancer Res. 66, 3381-3385 (2006).</li>
<li>Thompson, R. H., Dong, H., Kwon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+of+B7-H1+expression+in+clear+cell+carcinoma+of+the+kidney+for+prognostication+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Implications of B7-H1 expression in clear cell carcinoma of the kidney for prognostication and therapy.</a> Clin. Cancer Res. 13, 709s-715s (2007).</li>
<li>Karim, R., Jordanova, E. S., Piersma, S. J., Kenter, G. G., Chen, L., Boer, J. M., Melief, C. J., vander Burg, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-expressed+B7-H1+and+B7-DC+in+relation+to+PD-1%2B+T-cell+infiltration+and+survival+of+patients+with+cervical+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Tumor-expressed B7-H1 and B7-DC in relation to PD-1+ T-cell infiltration and survival of patients with cervical carcinoma.</a> Clin. Cancer Res. 15, 6341-6347 (2009).</li>
<li>Inman, B. A., Sebo, T. J., Frigola, X., Dong, H., Bergstralh, E. J., Frank, I., Fradet, Y., Lacombe, L., Kwon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-L1+%28B7-H1%29+expression+by+urothelial+carcinoma+of+the+bladder+and+BCG-induced+granulomata%3A+associations+with+localized+stage+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">PD-L1 (B7-H1) expression by urothelial carcinoma of the bladder and BCG-induced granulomata: associations with localized stage progression.</a> Cancer. 109, 1499-1505 (2007).</li>
<li>Brahmer, J. R., Drake, C. G., Wollner, I., Powderly, J. D., Picus, J., Sharfman, W. H., Stankevich, E., Pons, A., Salay, T. M., McMiller, T. L., Gilson, M. M., Wang, C., Selby, M., Taube, J. M., Anders, R., Chen, L., Korman, A. J., Pardoll, D. M., Lowy, I., Topalian, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+I+study+of+single-agent+anti-programmed+death-1+%28MDX-1106%29+in+refractory+solid+tumors%3A+safety%2C+clinical+activity%2C+pharmacodynamics%2C+and+immunologic+correlates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Phase I study of single-agent anti-programmed death-1 (MDX-1106) in refractory solid tumors: safety, clinical activity, pharmacodynamics, and immunologic correlates.</a> J. Clin. Oncol. 28, 3167-3175 (2010).</li>
<li>Wang, L., Ma, Q., Chen, X., Guo, K., Li, J., Zhang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+significance+of+B7-H1+and+B7-1+expressions+in+pancreatic+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22World+J.+Surg%22%5BJournal%5D)">Clinical significance of B7-H1 and B7-1 expressions in pancreatic carcinoma.</a> World J. Surg. 34, 1059-1065 (2010).</li>
<li>Nomi, T., Sho, M., Akahori, T., Hamada, K., Kubo, A., Kanehiro, H., Nakamura, S., Enomoto, K., Yagita, H., Azuma, M., Nakajima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+significance+and+therapeutic+potential+of+the+programmed+death-1+ligand%2Fprogrammed+death-1+pathway+in+human+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Clinical significance and therapeutic potential of the programmed death-1 ligand/programmed death-1 pathway in human pancreatic cancer.</a> Clin. Cancer Res. 13, 2151-2157 (2007).</li>
<li>Taube, J. M., Anders, R. A., Young, G. D., Xu, H., Sharma, R., McMiller, T. L., Chen, S., Klein, A. P., Pardoll, D. M., Topalian, S. L., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colocalization+of+inflammatory+response+with+B7-h1+expression+in+human+melanocytic+lesions+supports+an+adaptive+resistance+mechanism+of+immune+escape%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Colocalization of inflammatory response with B7-h1 expression in human melanocytic lesions supports an adaptive resistance mechanism of immune escape.</a> Sci. Transl. Med. 4, 127ra37(2012).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

A coloração imuno-histoquímica de B7-H1 em criocortes tem sido relatada em estudos anteriores para uma variedade de cancros 3,4. No entanto, as amostras de tumor clínicos geralmente só estão disponíveis sob a forma de blocos embebidos em parafina. O anticorpo monoclonal 5H1 mais recentemente tem sido aplicado com sucesso para a coloração de tecidos embebidos em parafina de tumores, incluindo carcinoma de células renais, carcinoma cervical, cancro da bexiga e melanoma 13-18. B7-H1 coloração em paraf...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> CSA Sistema </td><td> Dako </td><td> K1500 </td><td> Inclui os seguintes reagentes mencionados no protocolo: bloqueio da peroxidase, estreptavidina-biotina complexos, reagentes de amplificação, estreptavidina-HRP e DAB substrato eo cromógeno </td></tr><tr><td> Avidina / biotina Blocking Kit </td><td> Vetor </td><td> SP-2001 </td><td></td></tr><tr><td> Bloco ACE </td><td> Serotec </td><td> BUF029 </td><td></td></tr><tr><td> Biotina anti-mouse IgG1 </td><td> BD </td><td> 553441 </td><td></td></tr><tr><td> IgG1 de ratinho de controlo K Isotype </td><td> eBioscience </td><td> 14-4714-85 </td><td></td></tr><tr><td> TBS (Tris-solução salina tamponada), 10X </td><td> Cellgro </td><td> 46-012 CM- </td><td> 10xTBS contém 80 g / L de NaCl e 24,2 g / L Tirs; Diluído a 1X com ddH2O para lavagens; </td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P1379 </td><td> Adicionado 1 ml para 1 L de 1X TBS para fazer TBST </td></tr><tr><td> Alvo de recuperação, 20x </td><td> Celerus Onda </td><td> 014-3000-000 </td><td> Diluída para 1x com DDH 2 O </td></tr><tr><td> 190 Prova Álcool Etílico </td><td> Pharmco-Aaper </td><td> 111000190 </td><td></td></tr><tr><td> 200 Prova Álcool Etílico </td><td> Pharmo-Aaper </td><td> 111000200 </td><td></td></tr><tr><td> Xileno </td><td> VWR </td><td> 95057-827 </td><td></td></tr><tr><td> Hematoxilina </td><td> Richard-Allan Scientific </td><td> 72804 </td><td></td></tr><tr><td> Cytoseal 60 </td><td> Richard-Allan Scientific </td><td> 8310-4 </td><td></td></tr><tr><td> Lamelas </td><td> Corning </td><td> 2940-245 </td><td></td></tr><tr><td> Câmara de umidade </td><td> Sigma </td><td> H6644 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabela 1. Reagentes e equipamentos. </td></tr></tbody></table>

a coloração imuno-histoquímica de b7-h1 (pd-l1) na histológicos em parafina lâminas de tecido adenocarcinoma do pâncreas

Immunohistochemical Staining of B7-H1 (PD-L1) on Paraffin-embedded Slides of Pancreatic Adenocarcinoma Tissue

B7-H1/PD-L1, um membro da família B7 de imuno-regulação de superfície celular de proteínas, tem um papel importante na regulação negativa de respostas mediadas por células imunitárias através da sua interacção com o seu receptor, a morte programada-1 (DP -1) 1,2. A sobre-expressão de B7-H1 por células tumorais foi observado em vários cancros humanos, incluindo o melanoma, glioblastoma, e carcinomas do pulmão, mama, cólon, ovário e células renais, e tem sido mostrado para danificar anti-tumorais T- imunidade celular 3-8. Recentemente, a expressão B7-H1 por tecidos de adenocarcinoma do pâncreas foi identificado como um potencial marcador de prognóstico 9,10. Além disso, o bloqueio de B7-H1, em um modelo de rato de cancro pancreático foi mostrado para produzir uma resposta anti-tumor 11. Estes dados sugerem a importância de B7-H1 como um potencial alvo terapêutico. Anticorpos anti-B7-H1 bloqueio são, portanto, está sendo testado em ensaios clínicos para multiple tumores sólidos humanos, incluindo melanoma e cancros do pulmão, do cólon, estômago, rim e pâncreas 12. A fim de, eventualmente, ser capaz de identificar os doentes que irão beneficiar de B7-H1 terapias com alvo, é crítico para investigar a correlação entre a expressão e localização de B7-H1 e a resposta do paciente ao tratamento com os anticorpos B7-H1 bloqueio. Examinando a expressão de B7-H1 em tecidos pancreáticos humanos através de adenocarcinoma imunohistoquímica dará um melhor entendimento de como esta molécula de sinalização co-inibidor contribui para a supressão da imunidade antitumoral em microambiente do tumor. O anticorpo anti-B7-H1 monoclonal (clone 5H1), desenvolvido por Chen e colaboradores demonstrou produzir resultados fiáveis ​​em criocortes de coloração de vários tipos de tecidos neoplásicos humanos 4,8, mas a coloração de lâminas embebidas em parafina tinha sido um desafio até Recentemente, 13-18. Temos devfugiu do protocolo de coloração B7-H1 para os slides incluídos em parafina de tecidos de adenocarcinoma do pâncreas. O protocolo de coloração B7-H1 descrito aqui produz a coloração das membranas e citoplasmática consistente de B7-H1 com pouco fundo.

A coloração imuno-histoquímica de sucesso de B7-H1 irá demonstrar a expressão heterogénea de B7-H1 (castanho sinais de desenvolvimento de cor DAB) em adenocarcinoma pancreático. Algumas células de adenocarcinoma do pâncreas têm uma expressão predominantemente membranosas de B7-H1 (Figura 1A) enquanto que outros têm uma expressão ou predominantemente citoplasmática de B7-H1 ou pouca expressão de B7-H1 (Figura 2 e 3). Epitélio pancreático normal duto expressa pouco B7-H1 (Figura 4...

B7-H1 (PD-L1) e a sua ligação ao PD-1 fornece um sinal induzida por tumor principal imunossupressor no microambiente do tumor. Uma técnica de coloração imuno-histoquímica para caracterizar a expressão e localização de B7-H1 em adenocarcinoma pancreático é descrito aqui.

A coloração imuno-histoquímica de B7-H1 (PD-L1) na histológicos em parafina lâminas de tecido adenocarcinoma do pâncreas

B7-H1/PD-L1, um membro da família B7 de proteínas de superfície celular reguladoras do sistema imune, desempenha um papel importante na regulação negativa da resposta mediada por células...

O objetivo geral deste procedimento é utilizar técnicas de coloração imunohistoquímica para avaliar a expressão de B sete H um PD L um em cortes de tecido de adenocarcinoma pancreático humano em parafina. Isso é realizado primeiramente removendo a parafina e reidratando os cortes de tecido. O segundo passo do procedimento é a recuperação de antígeno, que envolve o uso de uma panela de pressão para colorir o tecido.Um procedimento de coloração com anticorpo é seguido por etapas de amplificação do sinal e desenvolvimento da cor com DAB. Os passos finais são desidratar e montar o tecido. Uma vez concluído.A microscopia e a análise de imagem podem ser utilizadas para visualizar a B sete H um membranosa e citoplasmática. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no estudo do carcinoma endócrino pancreático, proporcionando uma melhor compreensão de como a B sete um BTL um contribui para a supressão da imunidade anti-tumoral no microambiente tumoral. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como a coloração em cortes criostáticos, é que ela foi otimizada para o uso de cortes de tecido embebidos em parafina, que geralmente são mais acessíveis e mais facilmente armazenáveis.A coloração confiável com anticorpos em lâminas não é possível sem a remoção da parafina previamente. Para preparar lâminas com tecidos embebidos em parafina, aqueça primeiro as lâminas a 55 graus Celsius por 20 minutos. Em seguida, em uma capela química, utiliza-se uma série de sete banhos químicos para remover a parafina; inicialmente, mergulhe as lâminas em xilol por 10 minutos.Em seguida, mergulhe as lâminas em um segundo banho de xilol fresco por 10 minutos. Terceiro, mergulhe as lâminas em etanol a 100% por cinco minutos. Quarto, novamente, mergulhe as lâminas em etanol fresco a 100% por cinco minutos.Quinto, mergulhe as lâminas em etanol a 95% por cinco minutos. Sexto, mergulhe as lâminas em etanol a 80% por cinco minutos. Finalmente, lave as lâminas com água desionizada por cinco minutos.Uma vez removida a parafina, é necessário em seguida disponibilizar o antígeno. Primeiro, imergir as lâminas em tampão Tris EDTA. A seguir, aquecer as lâminas em uma panela de pressão com um programa de dois passos.Primeiro, aqueça-os a 125 graus Celsius por 30 segundos. Segundo, a 90 graus Celsius por 10 segundos. Em seguida, coloque as lâminas de lado para esfriar até a temperatura ambiente.Após deixar as lâminas esfriarem por uma hora, lave as lâminas com TBST duas vezes, cinco minutos por banho. As lâminas podem agora ser coradas individualmente. Comece secando por absorção a solução de TBST ao redor do tecido e, em seguida, delimite um círculo ao redor do tecido com uma caneta hidrofóbica.Durante todo este procedimento, evite o ressecamento do tecido mantendo as lâminas em uma câmara umidificada. Quando não estiverem sendo lavadas, coloque uma gota de bloqueador de peroxidase dentro do círculo hidrofóbico na lâmina. Aguarde cinco minutos e enxágue a peroxidase com TBST.Em seguida, mergulhe as lâminas em TBST durante cinco minutos. Remova as lâminas da solução e agite suavemente para remover o excesso de TBST. Coloque então uma gota de tampão bloqueador CE sobre cada lâmina e incube-as à temperatura ambiente por 15 minutos.Limpe os lâminas com uma lavagem e um banho de cinco minutos em TBST. Em seguida, coloque uma gota da solução Vidan sobre cada lâmina e aguarde 15 minutos. Remova o AVADON com a mesma lavagem e regime de banho em TBST.Aplique agora a biotina. Aguarde cinco minutos e limpe as lâminas novamente com TBST. Incube, então, as lâminas com uma diluição de anticorpo monoclonal de camundongo ou com um anticorpo controle.Em TBST, deixe o anticorpo conjugado a quatro graus Celsius por 22 horas. No dia seguinte, lave as lâminas com TBST três vezes como antes. Cada lavagem inclui enxágue com A-T-B-S-T e banho de cinco minutos.Esse regime de lavagem tripla é repetido várias vezes consecutivas durante a remoção do anticorpo primário. Prepare a solução do complexo STR titina Bio ITIN. Ela deve ser preparada pelo menos 30 minutos antes de seu uso.Agora, incube as lâminas com anticorpo secundário de cabra anti-US conjugado à biotina em uma solução de soro de cabra por 30 minutos. Durante esta incubação, siga as instruções do kit DACO para preparar a solução cromogênica de substrato DAB. A solução pode ser armazenada a quatro graus no escuro por até oito horas.Após a incubação, realize a lavagem tripla com TBST. Em seguida, coloque uma gota do complexo de estreptavidina-biotina em cada lâmina, incube as lâminas por 15 minutos e depois lave-as três vezes com TBST.Em seguida, aplique uma gota do reagente de amplificação em cada lâmina. Aguarde quatro minutos e lave as lâminas três vezes com TBST. Após a remoção do reagente de amplificação, adicione uma gota de estreptavidina HRP em cada lâmina e incube-as por 15 minutos.Realize outra lavagem tripla com TBST antes de prosseguir. Agora vem a etapa mais sensível do procedimento. Adicione uma gota de substrato cromogênico DAB com peróxido de hidrogênio ao porta-objetos e comece a observar o desenvolvimento da coloração, o substrato DAB.O tempo de revelação do CROMOGÊNIO é normalmente de dois minutos, mas rotineiramente monitoramos o processo ao microscópio para garantir uma coloração ideal. Com fundo mínimo em cada rodada de coloração, incluímos um lâmina de um lote anterior e uma lâmina de amígdala como nossos controles positivos. Ao finalizar, lave imediatamente a lâmina em água, não em TBST.Incube a lâmina com uma gota de hematina por 90 segundos. Lave imediatamente a lâmina com água destilada desionizada, seguida por água da torneira com sabão e, em seguida, mais água DD. Isso conclui o procedimento de coloração.Após todas as lâminas terem sido coradas, utilize uma série de etanol para desidratar as lâminas antes de montá-las. Primeiro, mergulhe as lâminas em etanol 80% por três minutos. Segundo, mergulhe as lâminas em etanol 95% por três minutos.Para os terceiro e quarto banhos, mergulhe as lâminas em etanol a 100% por cinco minutos. Quinto e sexto, mergulhe as lâminas em xilol por cinco minutos. Finalmente, adicione uma gota de per milligram por lâmina e aplique cuidadosamente uma lamínula.As lâminas estão agora prontas para microscopia, com coloração imuno-histoquímica para B sete H um demonstrando a expressão heterogênea de B sete H um em adenocarcinoma pancreático. Elas são vistas em marrom com o desenvolvimento da coloração por DAB. Algumas células de adenocarcinoma pancreático apresentam expressão predominantemente membranar de B sete H um, enquanto outras exibem expressão predominantemente citoplasmática de B sete H um ou pouca expressão de B sete H um. O epitélio ductal pancreático normal expressou pouca coloração de B sete H um. A utilização de um anticorpo controle de isotipo de rato IgG um kappa, em vez do anticorpo anti B sete H um, produziu pouca coloração de fundo. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em sete horas, distribuídas por dois dias, com uma incubação noturna de 22 horas, se realizada corretamente após este desenvolvimento.Essa técnica abriu caminho para que pesquisadores na área de oncologia explorassem a sinalização B sete H um PD L um em outras neoplasias malignas.

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