Name: A coloração imuno-histoquímica de B7-H1 (PD-L1) na histológicos em parafina lâminas de tecido adenocarcinoma do pâncreas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: Aprenda a técnica de coloração imuno-histoquímica para avaliar a expressão de B7-H1 (PD-L1) em tecidos de adenocarcinoma pancreático. Este método permite visualizar a localização proteica no microambiente tumoral.

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EB, KMB, e HX contribuir igualmente. Este estudo foi financiado pelo NCI SPORE em Cânceres Gastrointestinais P50 CA062924, CA148964 NIH K23, Lustgarten Foundation, Viragh Foundation, ASCO Young Investigator Award, NIH 5T32 CA0090701-28 Formação Grant, Sol Goldman Centro de cancro do pâncreas, e da Fundação Nacional de Pâncreas.

B7-H1/PD-L1, um membro da família B7 de imuno-regulação de superfície celular de proteínas, tem um papel importante na regulação negativa de respostas mediadas por células imunitárias através da sua interacção com o seu receptor, a morte programada-1 (DP -1) 1,2. A sobre-expressão de B7-H1 por células tumorais foi observado em vários cancros humanos, incluindo o melanoma, glioblastoma, e carcinomas do pulmão, mama, cólon, ovário e células renais, e tem sido mostrado para danificar anti-tumorais T- imunidade celular 3-8. Recentemente, a expressão B7-H1 por tecidos de adenocarcinoma do pâncreas foi identificado como um potencial marcador de prognóstico 9,10. Além disso, o bloqueio de B7-H1, em um modelo de rato de cancro pancreático foi mostrado para produzir uma resposta anti-tumor 11. Estes dados sugerem a importância de B7-H1 como um potencial alvo terapêutico. Anticorpos anti-B7-H1 bloqueio são, portanto, está sendo testado em ensaios clínicos para humana múltiplatumores sólidos, incluindo melanoma e cancros do pulmão, do cólon, estômago, rim e pâncreas 12. A fim de, eventualmente, ser capaz de identificar os doentes que irão beneficiar de B7-H1 terapias com alvo, é crítico para investigar a correlação entre a expressão e localização de B7-H1 e a resposta do paciente ao tratamento com os anticorpos B7-H1 bloqueio. Examinando a expressão de B7-H1 em tecidos pancreáticos humanos através de adenocarcinoma imunohistoquímica dará um melhor entendimento de como esta molécula de sinalização co-inibidor contribui para a supressão da imunidade antitumoral em microambiente do tumor. O anticorpo anti-B7-H1 monoclonal (clone 5H1), desenvolvido por Chen e colaboradores demonstrou produzir resultados fiáveis ​​em criocortes de coloração de vários tipos de tecidos neoplásicos humanos 4,8, mas a coloração de lâminas embebidas em parafina tinha sido um desafio até Recentemente, 13-18. Nós desenvolvemos o staini B7-H1ng protocolo para slides incluídos em parafina de tecidos de adenocarcinoma do pâncreas. O protocolo de coloração B7-H1 descrito aqui produz a coloração das membranas e citoplasmática consistente de B7-H1 com pouco fundo. 1. De-parafinization <ol><li> Asse desliza a 55 ° C durante 20 min. </li><li> Em um capuz químico, mergulhe slides em xileno por 10 min. </li><li> Imergir as lâminas em xileno fresco por 10 min. </li><li> Imergir desliza em etanol a 100% durante 5 min. </li><li> Imergir desliza em etanol a 100% fresco durante 5 min. </li><li> Imergir desliza em etanol a 95% durante 5 min. </li><li> Imergir desliza em etanol a 80% durante 5 min. </li><li> Imergir desliza em água desionizada durante 5 min. </li></ol> 2. A recuperação antigênica <ol><li> Imergir as lâminas em tampão Tris-EDTA (pH 9,0) e de calor em uma panela de pressão a 125 ° C durante 30 seg, depois 90 ° C durante 10 seg. </li><li> Deixe esfriar por lâminas de 60 min. </li><li> Imergir as lâminas em TBST por 5 min; REPEmenos duas vezes. </li></ol> 3. Coloração <ol><li> Limpe soluções em volta do tecido nos slides. Marcar um círculo em torno do tecido com uma caneta hidrofóbica. </li><li> Colocar as lâminas numa câmara de humidade e evitar a secagem do tecido na lâmina durante o processo de coloração inteiro. Colocar uma gota (aproximadamente 200 uL ou superior para cobrir a área do tecido completamente) de bloqueio da peroxidase no círculo hidrofóbico sobre a lâmina e incubar no bloqueio da peroxidase, durante 5 min. </li><li> Lavar as lâminas com TBST, e depois colocar em TBST durante 5 minutos. </li><li> Depositar uma gota de um tampão de bloqueio BLOCK ACE em cada lâmina e incubar durante 15 min. </li><li> Lavar as lâminas com TBST, e depois colocar em TBST durante 5 minutos. </li><li> Colocar uma gota de solução de Avidina em cada lâmina e incubar durante 15 min. </li><li> Lavar as lâminas com TBST, e depois colocar em TBST durante 5 minutos. </li><li> Colocar uma gota de solução de biotina em cada lâmina e incubar durante 15 min. </li><li> Lavar slides com TBST, e depois colocar em TBST durante 5 minutos. </li><li> Incubar as lâminas com a diluição de 1:1000 de anticorpo de ratinho anti-B7-H1 monoclonal (clone 5H1) ou de um rato de controlo de isotipo IgG1 κ em 200 ul de TBST, a 4 ° C durante a noite, durante 22 h + / - 1 h. A concentração de anticorpo final em TBST é 2,57 ng / ml. </li><li> Lavar as lâminas com TBST, e depois colocar em TBST durante 5 minutos. Repita duas vezes. </li><li> Incubar as lâminas com um conjugado de biotina anti-ratinho de rato-IgG1 anticorpo secundário, a uma concentração de 1:500 (em 200 ul de solução de cabra 2% de soro) durante 30 minutos. </li><li> Lavar as lâminas com TBST, e depois colocar em TBST durante 5 minutos. Repita duas vezes. </li><li> Depositar uma gota de um complexo de estreptavidina-biotina (deve ser preparada, pelo menos, 30 min antes da sua utilização) em cada lâmina e incubar durante 15 min. </li><li> Lavar as lâminas com TBST, e depois colocar em TBST durante 5 minutos. Repita duas vezes. </li><li> Colocar uma gota de Reagente de Amplificação (diluído 2:1 com TBST) em cada lâmina e incubar durante 4 min. </li><li> Lavar as lâminas com TBST, e depois colocar em TBST durante 5 minutos. Repita duas vezes. </li><li> Colocar uma gota de Estreptavidina-HRP em cada lâmina e incubar durante 15 min. </li><li> Lavar as lâminas com TBST, e depois colocar em TBST durante 5 minutos. Repita duas vezes. </li><li> Colocar uma gota de 3,3-diaminobenzidina (DAB) e substrato cromogénio em cada lâmina e desenvolver a cor durante 2 min. </li><li> Imediatamente após o desenvolvimento de cor, lavagem das lâminas com DDQ 2 O durante 1-2 min. </li><li> Incubar as lâminas com uma gota de hematoxilina durante 90 segundos. </li><li> Lava-se com DDQ 2 O durante 1-2 min. </li><li> Lavar com água corrente e sabão por 1-2 min. </li><li> Lava-se com DDQ 2 O durante 1-2 min. </li></ol> 4. Desidratação e montagem <ol><li> Imergir as lâminas em etanol a 80% durante 3 min. </li><li> Imergir as lâminas em etanol a 95% durante 3 min. </li><li> Imergir as lâminas em etanol a 100% durante 5 min. Repetir. </li><li> Mergulhe as lâminas em xilol por 5 min. Repetir. </li><li> Adicione uma gota deCytoseal 60 para o slide e colocar a lamela. </li></ol> A Tabela 1 enumera os reagentes utilizados nos procedimentos acima descritos.

<ol><li>Flies, D. B., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+new+B7s%3A+playing+a+pivotal+role+in+tumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunother%22%5BJournal%5D)">The new B7s: playing a pivotal role in tumor immunity.</a> J. Immunother. 30, 251-260 (2007).</li>
<li>Dong, H., Zhu, G., Tamada, K., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B7-H1%2C+a+third+member+of+the+B7+family%2C+co-stimulates+T-cell+proliferation+and+interleukin-10+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">B7-H1, a third member of the B7 family, co-stimulates T-cell proliferation and interleukin-10 secretion.</a> Nat. Med. 5, 1365-1369 (1999).</li>
<li>Curiel, T. J., Wei, S., Dong, H., Alvarez, X., Cheng, P., Mottram, P., Krzysiek, R., Knutson, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockade+of+B7-H1+improves+myeloid+dendritic+cell-mediated+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Blockade of B7-H1 improves myeloid dendritic cell-mediated antitumor immunity.</a> Nat. Med. 9, 562-567 (2003).</li>
<li>Dong, H., Strome, S. E., Salomao, D. R., Tamura, H., Hirano, F., Flies, D. B., Roche, P. C., Lu, J., Zhu, G. Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDong%2C+H+%22Nat.+Med%22">Nat. Med</a>. 8, 793-800 (2002).</li>
<li>Dong, H., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B7-H1+pathway+and+its+role+in+the+evasion+of+tumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Med.+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">B7-H1 pathway and its role in the evasion of tumor immunity.</a> J. Mol. Med. (Berl). 81, 281-287 (2003).</li>
<li>Strome, S. E., Dong, H., Tamura, H., Voss, S. G., Flies, D. B., Tamada, K., Salomao, D., Cheville, J., Hirano, F., Lin, W., Kasperbauer, J. L., Ballman, K. V., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B7-H1+blockade+augments+adoptive+T-cell+immunotherapy+for+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">B7-H1 blockade augments adoptive T-cell immunotherapy for squamous cell carcinoma.</a> Cancer Res. 63, 6501-6505 (2003).</li>
<li>Hirano, F., Kaneko, K., Tamura, H., Dong, H., Wang, S., Ichikawa, M., Rietz, C., Flies, D. B., Lau, J. S., Zhu, G., Tamada, K., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockade+of+B7-H1+and+PD-1+by+monoclonal+antibodies+potentiates+cancer+therapeutic+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Blockade of B7-H1 and PD-1 by monoclonal antibodies potentiates cancer therapeutic immunity.</a> Cancer Res. 65, 1089-1096 (2005).</li>
<li>Thompson, R. H., Gillett, M. D., Cheville, J. C., Lohse, C. M., Dong, H., Webster, W. S., Krejci, K. G., Lobo, J. R., Sengupta, S., Chen, L., Zincke, H., Blute, M. L., Strome, S. E., Leibovich, B. C., Kwon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Costimulatory+B7-H1+in+renal+cell+carcinoma+patients%3A+Indicator+of+tumor+aggressiveness+and+potential+therapeutic+target%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Costimulatory B7-H1 in renal cell carcinoma patients: Indicator of tumor aggressiveness and potential therapeutic target.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17174-17179 (2004).</li>
<li>Geng, L., Huang, D., Liu, J., Qian, Y., Deng, J., Li, D., Hu, Z., Zhang, J., Jiang, G., Zheng, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B7-H1+up-regulated+expression+in+human+pancreatic+carcinoma+tissue+associates+with+tumor+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cancer+Res.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">B7-H1 up-regulated expression in human pancreatic carcinoma tissue associates with tumor progression.</a> J. Cancer Res. Clin. Oncol. 134, 1021-1027 (2008).</li>
<li>Loos, M., Giese, N. A., Kleeff, J., Giese, T., Gaida, M. M., Bergmann, F., Laschinger, M., WB, M., Friess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+significance+and+regulation+of+the+costimulatory+molecule+B7-H1+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Clinical significance and regulation of the costimulatory molecule B7-H1 in pancreatic cancer.</a> Cancer Lett. 268, 98-109 (2008).</li>
<li>Okudaira, K., Hokari, R., Tsuzuki, Y., Okada, Y., Komoto, S., Watanabe, C., Kurihara, C., Kawaguchi, A., Nagao, S., Azuma, M., Yagita, H., Miura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockade+of+B7-H1+or+B7-DC+induces+an+anti-tumor+effect+in+a+mouse+pancreatic+cancer+model%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Blockade of B7-H1 or B7-DC induces an anti-tumor effect in a mouse pancreatic cancer model.</a> Int. J. Oncol. 35, 741-749 (2009).</li>
<li>Wang, S., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunobiology+of+cancer+therapies+targeting+CD137+and+B7-H1%2FPD-1+cosignal+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunobiology of cancer therapies targeting CD137 and B7-H1/PD-1 cosignal pathways.</a> Curr. Top Microbiol. Immunol. 344, 245-267 (2011).</li>
<li>Thompson, R. H., Webster, W. S., Cheville, J. C., Lohse, C. M., Dong, H., Leibovich, B. C., Kuntz, S. M., Sengupta, S., Kwon, E. D., Blute, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B7-H1+glycoprotein+blockade%3A+a+novel+strategy+to+enhance+immunotherapy+in+patients+with+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Urology%22%5BJournal%5D)">B7-H1 glycoprotein blockade: a novel strategy to enhance immunotherapy in patients with renal cell carcinoma.</a> Urology. 66, 10-14 (2005).</li>
<li>Thompson, R. H., Kuntz, S. M., Leibovich, B. C., Dong, H., Lohse, C. M., Webster, W. S., Sengupta, S., Frank, I., Parker, A. S., Zincke, H., Blute, M. L., Sebo, T. J., Cheville, J. C., Kwon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+B7-H1+is+associated+with+poor+prognosis+in+renal+cell+carcinoma+patients+with+long-term+follow-up%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Tumor B7-H1 is associated with poor prognosis in renal cell carcinoma patients with long-term follow-up.</a> Cancer Res. 66, 3381-3385 (2006).</li>
<li>Thompson, R. H., Dong, H., Kwon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+of+B7-H1+expression+in+clear+cell+carcinoma+of+the+kidney+for+prognostication+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Implications of B7-H1 expression in clear cell carcinoma of the kidney for prognostication and therapy.</a> Clin. Cancer Res. 13, 709s-715s (2007).</li>
<li>Karim, R., Jordanova, E. S., Piersma, S. J., Kenter, G. G., Chen, L., Boer, J. M., Melief, C. J., vander Burg, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-expressed+B7-H1+and+B7-DC+in+relation+to+PD-1%2B+T-cell+infiltration+and+survival+of+patients+with+cervical+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Tumor-expressed B7-H1 and B7-DC in relation to PD-1+ T-cell infiltration and survival of patients with cervical carcinoma.</a> Clin. Cancer Res. 15, 6341-6347 (2009).</li>
<li>Inman, B. A., Sebo, T. J., Frigola, X., Dong, H., Bergstralh, E. J., Frank, I., Fradet, Y., Lacombe, L., Kwon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-L1+%28B7-H1%29+expression+by+urothelial+carcinoma+of+the+bladder+and+BCG-induced+granulomata%3A+associations+with+localized+stage+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">PD-L1 (B7-H1) expression by urothelial carcinoma of the bladder and BCG-induced granulomata: associations with localized stage progression.</a> Cancer. 109, 1499-1505 (2007).</li>
<li>Brahmer, J. R., Drake, C. G., Wollner, I., Powderly, J. D., Picus, J., Sharfman, W. H., Stankevich, E., Pons, A., Salay, T. M., McMiller, T. L., Gilson, M. M., Wang, C., Selby, M., Taube, J. M., Anders, R., Chen, L., Korman, A. J., Pardoll, D. M., Lowy, I., Topalian, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+I+study+of+single-agent+anti-programmed+death-1+%28MDX-1106%29+in+refractory+solid+tumors%3A+safety%2C+clinical+activity%2C+pharmacodynamics%2C+and+immunologic+correlates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Phase I study of single-agent anti-programmed death-1 (MDX-1106) in refractory solid tumors: safety, clinical activity, pharmacodynamics, and immunologic correlates.</a> J. Clin. Oncol. 28, 3167-3175 (2010).</li>
<li>Wang, L., Ma, Q., Chen, X., Guo, K., Li, J., Zhang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+significance+of+B7-H1+and+B7-1+expressions+in+pancreatic+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22World+J.+Surg%22%5BJournal%5D)">Clinical significance of B7-H1 and B7-1 expressions in pancreatic carcinoma.</a> World J. Surg. 34, 1059-1065 (2010).</li>
<li>Nomi, T., Sho, M., Akahori, T., Hamada, K., Kubo, A., Kanehiro, H., Nakamura, S., Enomoto, K., Yagita, H., Azuma, M., Nakajima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+significance+and+therapeutic+potential+of+the+programmed+death-1+ligand%2Fprogrammed+death-1+pathway+in+human+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Clinical significance and therapeutic potential of the programmed death-1 ligand/programmed death-1 pathway in human pancreatic cancer.</a> Clin. Cancer Res. 13, 2151-2157 (2007).</li>
<li>Taube, J. M., Anders, R. A., Young, G. D., Xu, H., Sharma, R., McMiller, T. L., Chen, S., Klein, A. P., Pardoll, D. M., Topalian, S. L., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colocalization+of+inflammatory+response+with+B7-h1+expression+in+human+melanocytic+lesions+supports+an+adaptive+resistance+mechanism+of+immune+escape%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Colocalization of inflammatory response with B7-h1 expression in human melanocytic lesions supports an adaptive resistance mechanism of immune escape.</a> Sci. Transl. Med. 4, 127ra37(2012).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

A coloração imuno-histoquímica de B7-H1 em criocortes tem sido relatada em estudos anteriores para uma variedade de cancros 3,4. No entanto, as amostras de tumor clínicos geralmente só estão disponíveis sob a forma de blocos embebidos em parafina. O anticorpo monoclonal 5H1 mais recentemente tem sido aplicado com sucesso para a coloração de tecidos embebidos em parafina de tumores, incluindo carcinoma de células renais, carcinoma cervical, cancro da bexiga e melanoma 13-18. B7-H1 coloração em paraf...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> CSA Sistema </td><td> Dako </td><td> K1500 </td><td> Inclui os seguintes reagentes mencionados no protocolo: bloqueio da peroxidase, estreptavidina-biotina complexos, reagentes de amplificação, estreptavidina-HRP e DAB substrato eo cromógeno </td></tr><tr><td> Avidina / biotina Blocking Kit </td><td> Vetor </td><td> SP-2001 </td><td></td></tr><tr><td> Bloco ACE </td><td> Serotec </td><td> BUF029 </td><td></td></tr><tr><td> Biotina anti-mouse IgG1 </td><td> BD </td><td> 553441 </td><td></td></tr><tr><td> IgG1 de ratinho de controlo K Isotype </td><td> eBioscience </td><td> 14-4714-85 </td><td></td></tr><tr><td> TBS (Tris-solução salina tamponada), 10X </td><td> Cellgro </td><td> 46-012 CM- </td><td> 10xTBS contém 80 g / L de NaCl e 24,2 g / L Tirs; Diluído a 1X com ddH2O para lavagens; </td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P1379 </td><td> Adicionado 1 ml para 1 L de 1X TBS para fazer TBST </td></tr><tr><td> Alvo de recuperação, 20x </td><td> Celerus Onda </td><td> 014-3000-000 </td><td> Diluída para 1x com DDH 2 O </td></tr><tr><td> 190 Prova Álcool Etílico </td><td> Pharmco-Aaper </td><td> 111000190 </td><td></td></tr><tr><td> 200 Prova Álcool Etílico </td><td> Pharmo-Aaper </td><td> 111000200 </td><td></td></tr><tr><td> Xileno </td><td> VWR </td><td> 95057-827 </td><td></td></tr><tr><td> Hematoxilina </td><td> Richard-Allan Scientific </td><td> 72804 </td><td></td></tr><tr><td> Cytoseal 60 </td><td> Richard-Allan Scientific </td><td> 8310-4 </td><td></td></tr><tr><td> Lamelas </td><td> Corning </td><td> 2940-245 </td><td></td></tr><tr><td> Câmara de umidade </td><td> Sigma </td><td> H6644 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabela 1. Reagentes e equipamentos. </td></tr></tbody></table>

a coloração imuno-histoquímica de b7-h1 (pd-l1) na histológicos em parafina lâminas de tecido adenocarcinoma do pâncreas

Immunohistochemical Staining of B7-H1 (PD-L1) on Paraffin-embedded Slides of Pancreatic Adenocarcinoma Tissue

B7-H1/PD-L1, um membro da família B7 de imuno-regulação de superfície celular de proteínas, tem um papel importante na regulação negativa de respostas mediadas por células imunitárias através da sua interacção com o seu receptor, a morte programada-1 (DP -1) 1,2. A sobre-expressão de B7-H1 por células tumorais foi observado em vários cancros humanos, incluindo o melanoma, glioblastoma, e carcinomas do pulmão, mama, cólon, ovário e células renais, e tem sido mostrado para danificar anti-tumorais T- imunidade celular 3-8. Recentemente, a expressão B7-H1 por tecidos de adenocarcinoma do pâncreas foi identificado como um potencial marcador de prognóstico 9,10. Além disso, o bloqueio de B7-H1, em um modelo de rato de cancro pancreático foi mostrado para produzir uma resposta anti-tumor 11. Estes dados sugerem a importância de B7-H1 como um potencial alvo terapêutico. Anticorpos anti-B7-H1 bloqueio são, portanto, está sendo testado em ensaios clínicos para multiple tumores sólidos humanos, incluindo melanoma e cancros do pulmão, do cólon, estômago, rim e pâncreas 12. A fim de, eventualmente, ser capaz de identificar os doentes que irão beneficiar de B7-H1 terapias com alvo, é crítico para investigar a correlação entre a expressão e localização de B7-H1 e a resposta do paciente ao tratamento com os anticorpos B7-H1 bloqueio. Examinando a expressão de B7-H1 em tecidos pancreáticos humanos através de adenocarcinoma imunohistoquímica dará um melhor entendimento de como esta molécula de sinalização co-inibidor contribui para a supressão da imunidade antitumoral em microambiente do tumor. O anticorpo anti-B7-H1 monoclonal (clone 5H1), desenvolvido por Chen e colaboradores demonstrou produzir resultados fiáveis ​​em criocortes de coloração de vários tipos de tecidos neoplásicos humanos 4,8, mas a coloração de lâminas embebidas em parafina tinha sido um desafio até Recentemente, 13-18. Temos devfugiu do protocolo de coloração B7-H1 para os slides incluídos em parafina de tecidos de adenocarcinoma do pâncreas. O protocolo de coloração B7-H1 descrito aqui produz a coloração das membranas e citoplasmática consistente de B7-H1 com pouco fundo.

A coloração imuno-histoquímica de sucesso de B7-H1 irá demonstrar a expressão heterogénea de B7-H1 (castanho sinais de desenvolvimento de cor DAB) em adenocarcinoma pancreático. Algumas células de adenocarcinoma do pâncreas têm uma expressão predominantemente membranosas de B7-H1 (Figura 1A) enquanto que outros têm uma expressão ou predominantemente citoplasmática de B7-H1 ou pouca expressão de B7-H1 (Figura 2 e 3). Epitélio pancreático normal duto expressa pouco B7-H1 (Figura 4...

B7-H1 (PD-L1) e a sua ligação ao PD-1 fornece um sinal induzida por tumor principal imunossupressor no microambiente do tumor. Uma técnica de coloração imuno-histoquímica para caracterizar a expressão e localização de B7-H1 em adenocarcinoma pancreático é descrito aqui.

A coloração imuno-histoquímica de B7-H1 (PD-L1) na histológicos em parafina lâminas de tecido adenocarcinoma do pâncreas

B7-H1/PD-L1, um membro da família B7 de proteínas de superfície celular reguladoras do sistema imune, desempenha um papel importante na regulação negativa da resposta mediada por células...

O objetivo geral deste procedimento é utilizar técnicas de coloração imunohistoquímica para avaliar a expressão de B sete H um PD L um em cortes de tecido de adenocarcinoma pancreático humano em parafina. Isso é realizado primeiramente removendo a parafina e reidratando os cortes de tecido. O segundo passo do procedimento é a recuperação de antígeno, que envolve o uso de uma panela de pressão para colorir o tecido.Um procedimento de coloração com anticorpo é seguido por etapas de amplificação do sinal e desenvolvimento da cor com DAB. Os passos finais são desidratar e montar o tecido. Uma vez concluído.A microscopia e a análise de imagem podem ser utilizadas para visualizar a B sete H um membranosa e citoplasmática. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no estudo do carcinoma endócrino pancreático, proporcionando uma melhor compreensão de como a B sete um BTL um contribui para a supressão da imunidade anti-tumoral no microambiente tumoral. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como a coloração em cortes criostáticos, é que ela foi otimizada para o uso de cortes de tecido embebidos em parafina, que geralmente são mais acessíveis e

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Este vídeo demonstra os procedimentos para caracterização de ilhotas pancreáticas humanas com hematoxilina e eosina (H &amp; E) e imuno-histoquímica (IHQ). Seções pancreáticas de cabeça, corpo e regiões da cauda estão manchadas por tanto H &amp; E e IHC para determinar a composição endócrino ilhéu (insulina, glucagon e polipeptídeo pancreático), a replicação celular (Ki67), e infiltrado inflamatório (H &amp; E, CD3). A região uncinado está localizado usando IHC para polipeptídeo pancreático.

Protocolos de coloração de ilhotas pancreáticas humanas

Aqui, apresentamos um passivo de protocolo para seções de pâncreas humano imagem em três dimensões (3D) usando otimizado métodos de compensação. Este manuscrito demonstra estes procedimentos para compensação de óptica passiva seguido por imunofluorescência múltiplas coloração para identificar os elementos-chave das redes neurais sensoriais e autonômicas, que inervam ilhotas humanas.

Imagens 3D de alta resolução da rede Neuro-insular pâncreas humano

O procedimento experimental sobre o immunophenotyping de stent de murino ortotópico PDAC visa perfilação a imuno-microambiente do tumor. Os tumores são orthotopically implantado através de cirurgia. Tumores de 200-600 mm3 no tamanho foram colhidos e dissociados para preparar suspensões de célula única, seguidas de análise multi imune marcador FACS usando diferentes anticorpos fluorescente-etiquetadas.

Immunophenotyping de ortotópico Homograft (Syngeneic) de murino KPC primário de Adenocarcinoma Ductal do pâncreas por citometria de fluxo

Ex vivo estudos de ilhotas pancreáticas são importantes para a pesquisa da diabetes. Técnicas existentes para estudar ilhotas cultivadas em sua arquitetura nativa 3-dimensional são demorados, ineficientes e raramente usado. Este trabalho descreve um método novo, simples e eficiente para a geração de cortes de parafina de alta qualidade de todo cultos Ilhéus.

Ilhota pancreatic incorporação para cortes de parafina

Um protocolo detalhado para um painel de seis-marcador multiplex imunofluorescência é otimizado e executado, usando um corante automatizado para resultados mais consistentes e um menor tempo de procedimento. Esta abordagem pode ser adaptada directamente por qualquer laboratório de estudos imuno-oncologia.

Painel de imunofluorescência Multiplex automatizada para estudos imuno-oncologia em amostras de Carcinoma fixada em formol

Aqui, apresentamos um protocolo para implante de células de câncer de mama para a almofada de gordura mamária de forma simples, menos invasiva e fácil de manusear de maneira, e este modelo de câncer de mama ortotópico rato com um ambiente adequado do tecido mamário pode ser usado para investigar vários aspectos da câncer.

Ortotópico injeção de células de câncer de mama para a almofada de gordura mamária de ratos

Este protocolo experimental descreve e otimiza um método de coloração por imunoistoquímica multiplex (IHQ), principalmente otimizando as condições de incubação de anticorpos de canal único e ajustando as configurações de anticorpos e canais para resolver os problemas de autofluorescência e crosstalk de canais em tecidos de câncer de pulmão de origem clínica.

Coloração por imunohistoquímica multiplex para tecido de câncer de pulmão embebido em parafina

A imunohistoquímica cíclica multiplex permite a detecção in situ de múltiplos marcadores simultaneamente usando incubação antígeno-anticorpo repetida, varredura de imagens e alinhamento e integração de imagens. Aqui, apresentamos o protocolo operacional para identificação de substratos de células imunes com essa tecnologia em amostras de câncer de pulmão e metástases cerebrais pareadas.

Imunohistoquímica Fluorescente Cíclica Multiplex

Para desvendar são desesperadamente necessários os primeiros mecanismos moleculares subjacentes câncer de próstata iniciação, romance e sistemas de modelos humanos e abordagens inovadoras. O potencial de pré-prostática seio urogenital mesênquima (UGSM) para induzir as populações de células estaminais pluripotentes para formar o epitélio da próstata humana é uma ferramenta poderosa na investigação experimental próstata.

Formação de Epithelium próstata humano utilizando Tissue Recombinação de Rodent Urogenital Mesênquima Sinus e células-tronco humanas

Uma melhor compreensão da biologia do câncer de pâncreas é criticamente necessário para permitir o desenvolvimento de melhores opções terapêuticas para o tratamento de câncer no pâncreas. Para atender a essa necessidade, nós demonstramos um modelo ortotópico de câncer pancreático que permite o monitoramento não-invasivo de progressão do câncer...

Modelo ortotópico bioluminescente de progressão do câncer de pâncreas

Aprenda a técnica de coloração imuno-histoquímica para avaliar a expressão de B7-H1 (PD-L1) em tecidos de adenocarcinoma pancreático. Este método permite visualizar a localização proteica no microambiente tumoral.

A coloração imuno-histoquímica de B7-H1 (PD-L1) na histológicos em parafina lâminas de tecido adenocarcinoma do pâncreas

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