Name: Cirurgia estereotáxica para lesão excitotóxica de áreas específicas do cérebro do rato adulto (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 45 s
Description: Aprenda a realizar cirurgia estereotáxica para lesões excitotóxicas em áreas específicas do cérebro de ratos adultos. Este método permite estudar funções de regiões cerebrais discretas em neurociência.

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Este trabalho foi apoiado ya CIRM comunhão predoctoral (EDK), NARSAD Young Investigator Award (DK) e do NIMH prêmio CÉREBROS (R01MH087495) (DK).

Anestesia e analgesia: Trinta minutos antes da anestesia, injectar no rato com 0,05 mg / kg por via subcutânea a buprenorfina para analgesia. Inicie a anestesia com sódio mg / kg 30-40 intraperitoneal de pentobarbital. Neste ponto, também injectar atropina para evitar a insuficiência respiratória (0,4 mg / kg, subcutânea) e meloxicam como analgésico mais (2 mg / kg por via subcutânea). Se depois de 5 minutos, o rato é ainda móvel ou responsiva à pitada dedo do pé, dar as doses subsequentes de pentobarbital de sódio a 5 mg / kg (via intraperitoneal), até que o rato é insensível à dor. Antes de realizar a primeira incisão, injectar lidocaína (5 mg / kg, intradérmica) no local da incisão para anestesia local. Seis a oito horas após a injecção inicial, injectar no rato com 0,05 mg / kg por via subcutânea a buprenorfina para analgesia. A buprenorfina pode ser injetado a cada 6-8 horas depois, se necessário, embora este geralmente não é necessário. É importante notar que as outras formas de c anestesiaum interferir com lesões excitotóxicas. Por exemplo, embora a cetamina é uma forma geralmente usado de anestesia em roedores, pode interferir com lesões induzidas com NMDA, porque é um antagonista do receptor de NMDA. É importante seleccionar um método de indução de anestesia que não reduz o tamanho da lesão. Se a anestesia de gás for desejado, a maioria dos dispositivos estereotáxicas, incluindo os descritos aqui podem acomodar placas de máscara de gás. Nota: Os materiais são descritos mais na Tabela de reagentes específicos e equipamentos abaixo. 1. Preparação da bomba e Stereotax <ol><li> Encher uma seringa de Hamilton 10 ul com água estéril e montá-lo para o transportador de uma bomba de seringa 6 programável. Fixar a extremidade do êmbolo da seringa no suporte fixada na bomba. </li><li> Prefill gás-esterilizado PE20 tubagem com água estéril usando uma agulha e seringa 1 ml. Deslizar a extremidade aberta do tubo para a seringa de Hamilton, sendo o cuidadoful para evitar a criação de quaisquer bolhas de ar no tubo. </li><li> Prender a 30ga, plana de corte, ponta de agulha 1 polegada de infusão da tubagem para o braço de um dispositivo estereotáxico utilizando um manipulador eléctrodo barril de estilo. Inserir a agulha de infusão entre a braçadeira eo cano estriado. Coloque a braçadeira ao longo de um pedaço de tubo contendo agulha de metal no seu interior, para evitar o achatamento da tubagem e restringindo o fluxo de fluido. </li><li> Ajustar a taxa de bomba para&gt; 5 ul / min e ligar a bomba. Uma gota de água deve aparecer na ponta da agulha de infusão. Verifique o comprimento da tubulação e suas articulações para se certificar de que não há vazamentos. </li><li> Limpe a água do cordão, com um cotonete estéril e definir a bomba para retirar. Retirar a 2 bolha de ar ul. A parte superior da bolha deve ser visível na tubagem. </li><li> Mergulha-se o ponta da agulha de perfusão em uma solução de 20 mg / ml de NMDA no estéril 0,1 M PBS e retirar uL 4-5. Uma bolha de ar deve ser visível entre a água estéril ea solução NMDAna ponta. É importante notar que NMDA é um potente neurotoxina e cuidado deve ser usado na preparação e manuseamento desta solução. Luvas e proteção para os olhos são aconselhados em todos os momentos. </li></ol> 2. Monte o rato no dispositivo Estereotáxica <ol><li> A Figura 1 mostra as partes básicas do dispositivo estereotáxico. Depois de raspar a cabeça do rato a partir da linha dos olhos para as orelhas, coloque os dentes da frente do rato sobre a barra de mordida, com o corpo do rato repousa sobre uma almofada de aquecimento definida em médio prazo. A língua deve ficar abaixo da barra de mordida, com o maxilar inferior. Se disponível, uma temperatura almofada de aquecimento gabarito seria preferível. Monitorar a temperatura retal também seria ideal. </li><li> Segurando o pescoço do rato com o polegar eo indicador, mova o canal do ouvido direito sobre a barra horizontal orelha direita. A barra deve sentir como ele está descansando em um lugar sólido, não como ele afunda muito na cabeça. Segurando o lado direito da cabeça constante, deslize da orelha esquerdabarrar no canal do rato orelha esquerda horizontal. Deve sentir como ele está descansando em um lugar sólido. O orelhas deve olhar simétrico e deve aparecer para deitar-se as barras de ouvido. Upward queima de orelhas indica um posicionamento inadequado das barras de ouvido. A cabeça não deve oscilar em resposta à pressão no pescoço. </li><li> Aparafuse a barra de nariz. Seja gentil. Os ossos do nariz são delicadas e barra de nariz não precisa ser apertado. Verifique se o rato é ainda anestesiado antes de prosseguir. </li></ol> 3. Preparando o Rato para a cirurgia <ol><li> Usando uma zaragatoa estéril, suavemente colocar uma pequena quantidade de pomada oftálmica veterinária lubrificante em cada um dos olhos do rato para protegê-los a partir de secagem e detritos. </li><li> Concentricamente a partir do local da incisão planeada para a borda da região raspada, limpe couro cabeludo do rato com uma solução de clorexidina 2%, seguido de etanol a 70%, três vezes. Esfrega clorexidina pode também ser utilizados se desinfectante mais eficaz for desejado.Termine limpando com solução a 10% iodopovidona. O couro cabeludo é preparada agora estéril e só deve ser tocado com materiais estéreis. </li><li> Luvas estéreis para Don novas medidas porque você vai lidar com o próximo local preparado cirúrgico. </li><li> Colocar uma cortina estéril de modo que a fenestração expõe o local cirúrgico. </li></ol> 4. Criando a janela cirúrgica <ol><li> Usando uma lâmina de bisturi # 10, fazer uma incisão (aproximadamente 2 cm de comprimento) ao longo da linha mediana longitudinal do couro cabeludo. A incisão deve começar posterior em relação à linha dos olhos. Com o polegar eo dedo indicador da mão não-dominante, segurar o couro cabeludo em perpendicular à direcção da tensão da incisão. </li><li> Puxar o fáscia que recobre a superfície do crânio para as bordas do local cirúrgico utilizando estéreis de algodão-dicas. Vai levar um pouco de força para limpar o crânio para que ele possa ser visualizado. </li><li> Use quatro curvas, hemostats estéreis para criar uma janela cirúrgica. Fáscia braçadeira (não de pele) em EAch lado dos aspectos anteriores e posteriores da incisão e, em seguida colocar os grampos ao lado do animal, fazendo assim avançar o incisão aberta e inteiramente expondo o crânio. </li></ol> 5. Nivelamento da Caveira e Criando o orifício piloto <ol><li> Localizar bregma, o ponto anterior em que as três placas principais do crânio se encontram, como representado na Figura 2. Mova a agulha da infusão para a ponta da agulha só toca o crânio, bregma. Observe o dorso-ventral Figura coordenadas. 3 demonstra como ler coordenadas em um dispositivo Stoelting estereotáxica. Nota, neste ponto, as luvas são já não estéril e não deve tocar no local da cirurgia estéril directamente. Nota: Depois de tocar o dispositivo não estéril estereotáxico, o cirurgião não é mais estéril e não deve tocar no local cirúrgico, nem partes do equipamento que irá tocar o local cirúrgico. </li><li> Localizar lambda, o ponto posterior onde os três placas principais do crânio se encontram, como depicted na Figura 2. Levante a agulha da infusão ligeiramente e movê-lo para trás para lambda. Baixe a agulha até que toque o crânio em lambda. Leia a coordenada dorso-ventral. Se o crânio é nível, será de 0,1 mm da leitura bregma. Se for mais longe do que isso, mover a agulha para cima (fora do caminho), solte a barra de nariz, aumentar ou reduzir tanto a plataforma barra de mordida, dependendo do final da cabeça é muito alto, e então re-medida. </li><li> Mova a agulha da infusão sobre bregma e gravar as coordenadas ântero-posterior e medial-lateral. Calcular onde a agulha deve ser movido com base nas coordenadas de a área do cérebro de interesse de acordo com um cérebro atlas 12. Para o BLA, subtraia 2,8 milímetros a partir da coordenada ântero-posterior e adicionar ou subtrair 5,1 mm a / a partir da coordenada medial-lateral, dependendo se você deseja atingir a esquerda ou direita. Mover a agulha de infusão para a posição calculada. </li><li> Balance o needle fora do caminho, tomando cuidado para manter o controle de onde foi localizado e, em seguida, faça um furo de aproximadamente 2 mm de diâmetro em que local usando uma Dremel moto-ferramenta com uma broca dental estéril anexado. Fure com cuidado, quando a broca rompe o crânio, ele tenderá a puxar para baixo, podendo danificar o tecido cerebral e dura por baixo. Resma do buraco para ampliá-la. </li><li> Absorver todo o sangue com um cotonete estéril. </li></ol> 6. A infusão de neurotoxina <ol><li> Balance a agulha de volta para a posição. Baixe a agulha até tocar a superfície do cérebro. Registre a coordenada dorso-ventral. Este é o nível de dura. Subtrair o valor apropriado para alcançar a região do cérebro de seu interesse. Para a amígdala basolateral, subtrair 6,7 mm. </li><li> Baixar a agulha de perfusão para o nível calculado lentamente. Em seguida, levantar-lo de volta, bem acima do crânio. Use um fio de Hamilton limpeza seringa para desobstruir a ponta da agulha de infusão, tomando cuidado para não tai a extremidade do fio que entra em contacto com a agulha de perfusão com não-estéreis luvas. </li><li> Executar a bomba em&gt; 5 uL / ​​min e certifique-se ver uma gota de líquido sair da agulha da infusão. Se não, desentupir com o fio e tente novamente. </li><li> Abaixe a agulha da infusão para o nível desejado dorsal / ventral lentamente. </li><li> Definir a taxa sobre a bomba de infusão a 0,1 ul / min e iniciar a infusão. Infundir durante 2 min. </li><li> Uma vez que a infusão foi iniciado, marcar as duas extremidades da bolha de ar na tubagem com um marcador preto. Se ambas as extremidades não se movem, a agulha está obstruída. Parar a infusão, levantar a agulha, desentupir com o fio, para verificar fluxo com uma taxa de fluxo elevado, re-diminuir a agulha e tentar de novo. </li><li> Uma vez que a infusão está completa, parar a bomba e esperar 5 min para o NMDA para difundir para longe da ponta da agulha. </li><li> Levantar a agulha de 0,5 mm, e infundir novamente durante 1 min. Espere 2,5 min para o NMDA para difundir para longe da ponta da agulha. Esta infusão extra que eleLPS assegurar todo o BLA é coberta pela infusão. Se isto é necessário para outras regiões do cérebro deve determinada experimentalmente. </li><li> Levante a agulha para fora do cérebro lenta e balançar o braço estereotáxico para fora do caminho. </li></ol> 7. Fechamento da incisão <ol><li> Don novas luvas estéreis para fechar a incisão. </li><li> Limpe qualquer excesso de sangue no crânio com algodão estéril de dicas e remover os grampos da fáscia. </li><li> Utilizando uma pinça de Londres, empurrar os dois lados da incisão em conjunto. As arestas interiores da pele deve satisfazer ea borda exterior da pele não deve ser permitido para enrolar na incisão. Enquanto pressiona a incisão fechada, aplicar grampos de sutura para fechar a protrusão firmemente. Continuar a empurrar a pele em conjunto e grampo ao longo do comprimento da incisão. Isso normalmente leva 3-5 grampos de sutura. </li><li> Depois de colocar todos os clipes da ferida, use a pinça para prender os grampos novamente, certificando-se que eles são seguros. O t mais seguroele clips, menor a probabilidade de um rato vai retirá-los antes da incisão tenha cicatrizado. </li><li> Swab a incisão grampeada com solução a 10% iodopovidona e retornar o rato para sua gaiola e monitor até que a mobilidade é restaurada (normalmente 1-2 horas após a anestesia, tempo total de cirurgia de indução ao fechamento sendo 30-45 min). Neste ponto, o rato pode ser retornada para a sala de colónia. Após uma semana, remover grampos com uma ferramenta de removedor de grampos, sob anestesia com isoflurano. </li><li> Use um esterilizador quente talão para esterilizar as superfícies da ponta de todos os instrumentos antes da utilização no rato seguinte. Os instrumentos devem ser imersos nas pérolas para não mais do que 15 segundos, ou podem tornar-se demasiado quente para manipular. Os instrumentos devem ser totalmente resfriado antes usada em outro animal. </li></ol> 8. Recuperação <ol><li> É possível que os ratos serão exibem actividade convulsiva, nos dias após a lesão. Dependendo da região do cérebro danificadas, outros comportamentos, tais como consumo de alimentos ou grooming pode ser afetada. É importante que os animais ser monitorizado numa base diária para assegurar que eles permanecem saudáveis ​​durante a recuperação. O tratamento de suporte, tais como alimentos líquidos, de alto teor calórico dos alimentos, ou analgesia adicional pode ser necessária. A mortalidade por anestesia ocorre em uma baixa percentagem de ratos, geralmente inferior a 5%. A mortalidade por outras causas (infecções, hemorragias) é extremamente raro. Quaisquer sinais de angústia após a recuperação da anestesia pode ser motivo de exclusão a partir de estudos futuros, mas são extremamente raros. Figura 4 mostra a perda de peso durante os primeiros dias após a cirurgia como deveria ser esperado. O peso corporal deve se recuperar dentro de 1 semana. </li></ol> 9. Os resultados representativos Uma semana ou mais após a infusão de NMDA, a lesão pode ser visualizada usando um contracorante cresilo-violeta e microscopia de campo claro. Cérebros deve ser perfundidos com paraformaldeído gelada 4%, equilibrada em sacarose a 30% em 0,1 M de PBS e frozen. Eles devem, então, ser cortado em 30-60 mM, de uma série de 01:06 - 1:12 e montada em lâminas de gelatina revestidos de vidro antes de sofrer uma contracorante violeta de cresilo padrão. A lesão deve corresponder a uma &quot;careca&quot;, ou uma área de diminuição cresil violeta mancha devido à morte celular após lesão. Figuras 5A e B mostram uma lesão representante da AML e CeA. Esta imagem foi obtida utilizando um scanner de mesa com uma varredura de alta resolução (1200 dpi). Para visualizar a lesão, ele ajuda a contracoloração uma série de seções com grande parte do tecido que circunda a área alvo para uma lesão mal colocada pode ser localizado. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/4079/4079fig1.jpg" /> Figura 1. Configuração estereotáxica. Esta figura mostra a estereotáxica rato com as partes pertinentes rotulados. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/4079/4079fig2.jpg" /> Figura 2. Bregma e lambda na sku ratoll. Esta ilustração mostra os locais de bregma e lambda. Todas as coordenadas são medidas em relação à bregma. Lambda é usado para assegurar que o crânio é nível. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/4079/4079fig3.jpg" /> Figura 3. Lendo coordenadas estereotáxicas. Este desenho representa uma leitura padrão estereotáxica. Para obter os dígitos para a esquerda da casa decimal, utilizar os marcadores do lado direito. O dígito rotulado corresponde ao local dezenas (isto é, 1 = 10, 2 = 20). As marcas de hash entre os dígitos marcados correspondem às unidades individuais (1-9). A linha zero indica o que o inteiro stereotax está definido. Aqui, a linha de zero é entre os 10 e 11 marcadores, indicando que a leitura está entre 10 e 11. Para determinar os números para a direita da casa decimal, utilizar os marcadores do lado esquerdo. As marcas de hash à esquerda são numerados de 0 a 10, com cada hash não marcado que representa uma diferença unidade deaqueles ao lado dele. Qualquer que seja o das marcas de hash sobre as linhas de esquerda melhor até com as marcas de hash à direita indica a primeira casa decimal da leitura de coordenadas. Aqui, a marca hash na esquerda correspondente ao número 9 linhas até melhor com as marcas do lado direito de hash para a casa decimal é 9. A leitura final é de 10,9 mm. <img alt="A Figura 4" src="/files/ftp_upload/4079/4079fig4.jpg" /> Figura 4. Alteração de peso após a cirurgia. Este gráfico mostra o peso (± SEM) média de ratos submetidos a cirurgia estereotáxico (n = 17) ou não ter a cirurgia (n = 6). Dia 0 é o dia da cirurgia. Após a cirurgia, o peso de ratos diminuiu durante 2-3 dias após a cirurgia e, em seguida, aumentou cerca de 5-6 dias. <img alt="A Figura 5" src="/files/ftp_upload/4079/4079fig5.jpg" /> Figura 5. Exemplo lesão excitotóxica. A) Esta imagem mostra uma violeta cresil contracoloração em uma fatia 30 um coronal com o careca &quot;mancha &quot;de lesão de NMDA da amígdala basolateral. As setas brancas delinear a lesão. Ele pode ser comparado com o lado contralateral da fatia do cérebro que não tem nenhuma lesão. B) Uma lesão semelhante do núcleo central da amígdala.

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Não há conflitos de interesse declarados.

O método aqui apresentado estereotáxico permite lesão excitotóxica de áreas específicas do cérebro através de infusão de NMDA. Os métodos básicos estereotáxicas pode ser adaptado para infundir uma variedade de agentes farmacológicos e biológicos de um modo específico do local. Ele também pode ser adaptado para orientar uma variedade de áreas do cérebro, definida pelas suas coordenadas estereotáxicas no cérebro atlas 12. Adaptação a outras espécies tais como ratos pode ser feita com um equipamento similar cons...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> N-Metil-D-aspártico Ácido 98% </td><td> Fisher Scientific </td><td> AC32919-0500 </td><td></td></tr><tr><td> Dupla Laboratório Padrão Estereotáxica w/45 graus. Barras de ouvido </td><td> Stoelting </td><td> 51653 </td><td> Fornecedor alternativo: Kopf * nota de cautela: garantir a compatibilidade de acessórios estereotáxicas se comprar de vários fornecedores </td></tr><tr><td> 10 ul SYR ESPECIAL (* / * / *) </td><td> Hamilton </td><td> 701SN </td><td></td></tr><tr><td> Dremel Moto-Ferramenta </td><td> Stoelting </td><td> 58600 </td><td> Fornecedor alternativo: Kopf </td></tr><tr><td> Carbide brocas, peça de mão HP, tamanho 2 </td><td> Schein Dental </td><td> 2284578 </td><td></td></tr><tr><td> Stoelting 6 Programa SeringaBomba programável </td><td> Stoelting </td><td> 53140 </td><td> Fornecedor alternativo: Kopf </td></tr><tr><td> Aço Inoxidável Hypodermic 316 Tubulação parede regular calibre 30 0,0123 &quot;OD x 0,00625&quot; ID x .003 &quot;Wall (agulha de infusão) </td><td> Peças pequenas </td><td> HTXX-30R-06-05 </td><td></td></tr><tr><td> Intramedic PE 20 tubagem (tubo de infusão) </td><td> VWR </td><td> 63019-025 </td><td></td></tr><tr><td> Clipes Reflex, 9mm, não-estéril </td><td> Kent Scientific Corp </td><td> INS500346 </td><td> Vendedor Alternativa: Ferramentas de Ciência Belas </td></tr><tr><td> Aplicador Clipe Reflex para clipes de 9mm </td><td> Kent Scientific Corp </td><td> 12031-09 </td><td> Vendedor Alternativa: Ferramentas de Ciência Belas </td></tr><tr><td> Hemostat Hartman Curvo </td><td> Belas Ferramentas Ciência </td><td> 13003-10 </td><td></td></tr><tr><td> Londres fórceps </td><td> Belas Ferramentas sceince </td><td> 11080-02 </td><td></td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> Solução de clorexidina a 2% </td><td> Allivet </td><td> 30159 </td><td> Fornecedor alternativo: PetSolutions </td></tr><tr><td> Solução de iodo de 10% povidona </td><td> CVS </td><td> SKU # 739575 </td><td></td></tr><tr><td> Hot talão esterilizador </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 610183 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabela 1. Tabela de reagentes específicos e equipamentos.

cirurgia estereotáxica para lesão excitotóxica de áreas específicas do cérebro do rato adulto

Stereotaxic Surgery for Excitotoxic Lesion of Specific Brain Areas in the Adult Rat

Muitas funções comportamentais em mamíferos, incluindo roedores e humanos, são mediados principalmente pelos regiões do cérebro discretos. Um método comum para a função o discernimento de várias regiões do cérebro para o comportamento ou outros resultados experimentais é implementar uma ablação localizada da função. Em humanos, as populações de pacientes com lesões cerebrais localizadas são frequentemente estudadas para os défices, na esperança de revelar a função subjacente da área danificada. Em roedores, pode-se induzir experimentalmente lesões de regiões específicas do cérebro. Lesão pode ser realizado de várias maneiras. Lesões electrolíticas pode causar danos localizados mas irá prejudicar uma variedade de tipos de células, bem como fibras que atravessam a partir de outras regiões do cérebro que acontecem para ser próximo do local da lesão. Induzível técnicas genéticas utilizando células tipo promotores específicos pode também ativar site-specific segmentação. Estas técnicas são complexos e nem sempre é prático, dependendo da área do cérebro alvo. Excitotóxico lesão através de cirurgia estereotáxica, pelo contrário, é um dos métodos mais confiáveis ​​e práticos da lesioning neurônios excitatórios sem danificar locais células gliais ou atravessando fibras. Aqui, nós apresentamos um protocolo para infusão estereotáxico do excitotoxina, N-metil-D-aspartato (NMDA), no complexo amígdala basolateral. Usando indicações anatômicas, aplicamos coordenadas estereotáxicas para determinar a localização da nossa região do cérebro alvo e baixar uma agulha de injeção no local um pouco acima do alvo. Em seguida, infundir nosso excitotoxina no cérebro, resultando em morte excitotóxica de neurônios próximos. Embora o nosso sujeito experimental de escolha é um rato, os mesmos métodos podem ser aplicados a outros mamíferos, com os ajustes apropriados em equipamentos e coordenadas. Este método pode ser usado em uma variedade de regiões do cérebro, incluindo a amígdala basolateral 1-6, os núcleos amígdala outro 6, 7, 8 hipocampo, entorhinal córtex 9 e córtex pré-frontal 10. Também pode ser utilizado para infundir compostos biológicos, tais como vectores virais 1, 11. A técnica básica estereotáxico poderia também ser adaptado para a implantação de mais permanentes bombas osmóticas, permitindo a exposição mais prolongada a um composto de interesse.

Ablação alvo de região específica do cérebro (s) por infusão de uma excitotoxina utilizando coordenadas estereotáxico é descrito. Esta técnica pode também ser adaptado para infusão de outros produtos químicos para o cérebro de rato.

Cirurgia estereotáxica para lesão excitotóxica de áreas específicas do cérebro do rato adulto

Muitas funções comportamentais em mamíferos, incluindo roedores e humanos, são mediadas principalmente por regiões cerebrais discretas. Um método comum para discernir a ...

O objetivo geral deste procedimento é lesar uma área específica do cérebro de rato utilizando infusão estereotáxica de uma toxina excitatória. Isso é realizado primeiramente posicionando corretamente um rato no aparelho estereotáxico. O segundo passo é localizar a posição de infusão com base nas coordenadas estereotáxicas.Em seguida, infunde-se a excitotoxina e permite-se que ela difunda a partir da ponta da agulha. O passo final consiste em remover a agulha e fechar a incisão. Por fim, utiliza-se coloração contraste imunohistoquímica em cortes de tecido fixado para demonstrar a lesão efetiva e corretamente localizada.Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no campo da neurociência, como as funções de áreas cerebrais discretas. A demonstração visual deste método é essencial porque, para montar corretamente a cabeça de modo que fique nivelada e segura, é necessário saber como é a posição adequada. Para preparar o experimento, preencha primeiro uma seringa Hamilton de 10 microlitros com água estéril.Em seguida, acople a seringa cheia no suporte de uma bomba programável de seis seringas e fixe a extremidade do êmbolo da seringa no suporte preso na bomba. Insira uma agulha de infusão plana de calibre 30 e um polegada, previamente preparada, em cerca de dois pés de tubo PE 20 esterilizado por gás. A seguir, use uma agulha de calibre 25 e uma seringa de um mililitro para encher previamente o tubo com água estéril.Deslize a extremidade aberta da tubulação na seringa Hamilton. Tenha cuidado para evitar a formação de bolhas de ar no tubo. Agora, prenda a extremidade da tubulação com a agulha de infusão no braço de um dispositivo estereotáxico utilizando um manipulador de eletrodos do tipo cilíndrico.Em seguida, insira a agulha de infusão entre o grampo e o cilindro ranhurado, garantindo que o grampo esteja fixado sobre um trecho de tubo contendo a agulha em seu interior para evitar o achatamento do tubo. Ajuste então a bomba para uma taxa superior a cinco microlitros por minuto e ligue a bomba. Assim que a bomba estiver em funcionamento, uma gota de água deverá aparecer na ponta da agulha de infusão.Aproveite esta oportunidade para verificar as conexões e tubos, garantindo que não haja vazamentos. Use um swab estéril para remover a gota de água. Em seguida, configure a bomba para recuar e aspirar uma bolha de ar de dois microlitros.O topo da bolha deve estar visível no interior do tubo. Agora, mergulhe a ponta da agulha de infusão em uma solução de 20 miligramas por mililitro de NMDA em PBS estéril 0,1 molar e aspire de quatro a cinco microlitros do líquido. Certifique-se de que a bolha de ar separe a água estéril e a solução de NMDA.Uma vez que um volume adequado da solução de NMDA tenha sido aspirado, o recipiente contendo a solução estoque pode ser removido e, em seguida, o aparato estará pronto para a cirurgia. Após fixar a rata na estrutura estereotáxica, cada haste auricular deve parecer estar apoiada em um ponto firme, sem afundar profundamente na cabeça. A moeda deve parecer simétrica e deverá parecer estar plana sobre as hastes auriculares.O alargamento ascendente do cone indica colocação inadequada das hastes auriculares. A cabeça não deve oscilar em resposta à pressão no pescoço. Utilize um cotonete estéril para aplicar pomada oftálmica nos olhos.Aplique agora solução de clorexidina a 2% no couro cabeludo, movendo-se em círculos concêntricos a partir do local planejado para a incisão em direção à borda da região raspada. Aplique etanol a 70% da mesma maneira.Repita este processo três vezes, seguido por uma aplicação de solução de iodeto de povidona a 10%, pois agora o couro cabeludo está estéril e deve ser tocado apenas com materiais estéreis. Neste momento, coloque luvas cirúrgicas estéreis e posicione um campo estéril sobre o animal de modo que a janela cirúrgica exponha o local da operação. O animal está agora pronto para a cirurgia, após o uso de um bisturi com lâmina número 10 para fazer uma incisão longitudinal de dois centímetros ao longo da linha média do couro cabeludo, começando posteriormente à linha dos olhos.Use pontas de algodão estéreis para puxar a fáscia que recobre a superfície do crânio até as bordas do local cirúrgico. Use quatro hemostatos curvos estéreis para prender a fáscia em cada lado das regiões anterior e posterior da incisão. Para criar uma janela cirúrgica, posicione a outra extremidade dos hemostatos ao lado do animal.Para abrir a incisão e expor completamente o crânio. Primeiro, localize o bgma e o lambda conforme mostrado neste diagrama. Em seguida, mova a agulha para que a ponta toque levemente o bgma escarlate.Observe a coordenada dorsoventral de acordo com a escala venia. É recomendável familiarizar-se com a leitura da escala venia antes de iniciar o procedimento. Um guia é fornecido ao final deste vídeo.Após tocar o dispositivo estereotáxico não estéril, o cirurgião deixa de ser estéril e deve ter cuidado para não tocar o local cirúrgico estéril ou as partes de quaisquer instrumentos que entrarão em contato com o local cirúrgico. Em seguida, levante ligeiramente a agulha e mova a ponta da agulha diretamente de volta até o lambda novamente. Abaixe a ponta da agulha e anote a coordenada dorsal-ventral.Se essa coordenada estiver dentro de 0,1 milímetros da registrada para broma, então considera-se que o crânio está nivelado. Caso contrário, será necessário ajustar a barra de mordida e repetir as medições. Uma vez que a cabeça esteja nivelada no plano dorsoventral, retorne a agulha ao forame e registre as coordenadas anterior, posterior e médio-lateral.Calcule o posicionamento alvo da agulha com base nas coordenadas do atlas cerebral da estrutura de interesse e mova a agulha para a posição calculada. Marque a posição da agulha e, em seguida, afaste-a do caminho. Utilize uma ferramenta rotativa Dremel com uma broca dental estéril acoplada para perfurar cuidadosamente um orifício de aproximadamente dois milímetros no local da posição da agulha, sem danificar a dura-máter ou o tecido subjacente.Alargue o orifício para ampliá-lo e, ao finalizar, absorva qualquer sangue com um cotonete. Após perfurar o orifício, mova a agulha de volta para a posição inicial. Abaixe a agulha no orifício até que a ponta toque a dura-máter.Registre esta coordenada dorsal-ventral e subtraia o valor do vale apropriado necessário para alcançar a região cerebral de interesse. Abaixe lentamente a agulha até o nível calculado. Em seguida, eleve novamente a agulha até um nível bem acima do crânio.Use um fio de limpeza para seringa Hamilton para desentupir a ponta da agulha de infusão. Agora, execute a bomba à mesma taxa que anteriormente. Uma gota de líquido deve se formar na extremidade da agulha de infusão.Se não, repita o procedimento de desobstrução e tente novamente. Após confirmar que a agulha está livre de obstruções, abaixe lentamente a agulha de volta ao nível dorsal-ventral desejado. Marque as duas extremidades da bolha de ar com uma caneta preta.Configure a bomba de infusão para 0,1 microlitro por minuto e inicie a infusão. O movimento da bolha indica que a agulha não está entupida e que a infusão está funcionando. Deixe o neurotoxina infundir no cérebro por dois minutos.Em seguida, ao final da infusão, pare a bomba e aguarde cinco minutos para que o NMDH se difunda para longe da ponta da agulha. Dependendo da região cerebral, pode ser necessário elevar a agulha ligeiramente e infundir novamente por um período mais curto.Isso é feito para garantir que a estrutura-alvo seja coberta pela infusão. Após a conclusão da infusão do neurotoxina, levante lentamente a agulha para fora do cérebro e afaste o braço estereotáxico. Depois de colocar um novo par de luvas estéreis, use cotonetes estéreis para remover qualquer sangue em excesso sobre o crânio.Em seguida, remova as pinças da fáscia. Depois, use pinças de Londres para aproximar os dois lados da incisão, garantindo que as bordas internas da pele se encontrem. Não permita que a pele se enrole em direção à incisão.Mantenha pressionando o corte fechado e aplique clipes cirúrgicos ao longo do comprimento da incisão. Normalmente, isso requer de três a cinco clipes cirúrgicos. Após posicionar os clipes, use pinças para pinçar e fixar ainda mais os grampos.Por fim, troque a incisão grampeada por uma solução de iodo-povidona a 10%. Devolva a rata à gaiola original. Monitore a recuperação do animal e administre analgésico conforme as diretrizes institucionais.Este gráfico mostra o peso médio de 17 ratos que passaram por cirurgia e de 6 ratos que não foram submetidos à cirurgia. O dia zero corresponde ao dia do procedimento cirúrgico. Após a cirurgia, o peso dos ratos diminuiu por dois a três dias e depois aumentou por volta do dia cinco ao seis.Esta imagem mostra uma coloração contraste com violeta de genciana em uma fatia coronal de 30 mícrons com a área despigmentada de uma lesão MDA do núcleo amigdaliano lateral basal. As setas brancas delimitam a lesão. Pode ser comparada ao lado contralateral da fatia cerebral, que não apresenta lesão.Esta imagem mostra uma lesão semelhante no núcleo central da amígdala. Este desenho representa uma leitura estereotáxica padrão para obter os dígitos à esquerda da vírgula decimal. Utilize as marcas no lado direito.O dígito marcado corresponde à casa das dezenas, ou seja, um equivale a 10 e dois equivale a 20. As marcas entre os dígitos marcados correspondem às unidades simples de um a nove. A linha zero indica em qual número inteiro o estereótipo está definido.Aqui, a linha zero está entre os marcadores 10 e 11, indicando que a leitura está entre 10 e 11. Para determinar os números à direita da casa decimal, utilize os marcadores no lado esquerdo. As marcas no lado esquerdo são numeradas de zero a 10, sendo que cada marca não rotulada representa uma diferença de uma unidade em relação às adjacentes; a marca esquerda que se alinhar melhor com as marcas da direita indica o primeiro algarismo decimal da leitura de coordenada aqui.A marca de hachura à esquerda, correspondente ao número nove, alinha-se melhor com as marcas de hachura do lado direito, portanto a casa decimal é nove. A leitura final é 10,9 milímetros. Após dominada, esta técnica deve levar 30 minutos se realizada corretamente.Após este procedimento, vetores virais ou siRNA podem ser infundidos de forma específica em determinadas regiões do cérebro para responder perguntas como: como a alteração da expressão gênica em certas áreas cerebrais modifica a função cerebral?

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

O acompanhamento dos níveis de neurotransmissores extracelular em regiões distintas do cérebro de animais que circulam livremente oferece insights sobre a relação entre a liberação do neurotransmissor e comportamento. Em microdiálise in vivo juntamente com detecção eletroquímica fornece anatômicas excelentes e resolução de química; e informações sobre como a neurotransmissão basal é alterada por manipulações farmacológicas ou fisiológicas.

Cirurgia estereotáxica sobrevivência em Roedores

Fonte: Batra, V., et al. Um método geral para avaliar os efeitos da estimulação cerebral profunda na autoadministração intravenosa de metanfetamina. J. Vis. Exp. (2016).Este vídeo demonstra um modelo de dependência de drogas em ratos no qual o animal auto-administra metanfetamina intravenosa pressionando uma alavanca, levando a um comportamento compulsivo de busca de drogas impulsionado pela liberação de dopamina no núcleo accumbens. Para neutralizar isso, o rato passa por estimulação cerebral...

Estimulação cerebral profunda como tratamento para dependência de drogas em um modelo de rato

Este vídeo demonstra o registro eletroencefalográfico (EEG) de crises epilépticas em ratos induzidos por epilepsia. Um rato com eletrodos implantados no hipocampo ventral é conectado ao sistema de registro de EEG e colocado em uma câmara de plexiglass. O rato pode se mover livremente enquanto a atividade cerebral é registrada para monitorar a ocorrência de convulsões.

Registro eletroencefalográfico de crises epilépticas em ratos induzidos por epilepsia

Este vídeo demonstra um procedimento cirúrgico guiado estereotaxicamente para ablação do córtex auditivo em um rato. As etapas incluem a identificação de pontos anatômicos em um rato anestesiado preso em uma estrutura estereotáxica, criando uma janela no crânio acima do córtex auditivo, aspirando as camadas corticais e fornecendo cuidados pós-operatórios para avaliar o impacto da ablação no processamento do som.

Uma técnica de ablação guiada estereotáticamente para remoção do córtex auditivo em ratos

O mecanismo subjacente aos efeitos terapêuticos da cirurgia de Estimulação Cerebral Profunda (DBS) precisa de investigação. Os métodos apresentados neste manuscrito descrevem uma abordagem experimental para examinar os eventos celulares desencadeados pela ECP, analisando o perfil de expressão gênica de genes candidatos que podem facilitar a neurogênese pós-cirurgia de ECP.

Análise das Alterações Gene expressão no Rat Hippocampus Após Estimulação Cerebral Profunda do Anterior Thalamic Nucleus

Um método para implantar eletrodos no núcleo subtalâmico (STN) de ratos é descrito. A melhor localização do STN foi obtida usando um sistema de microregistro. Além disso, é apresentada uma configuração de estimulação caracterizada por conexões duradouras entre a cabeça do animal e o estimulador.

Microeletrodos guiada implantação de eletrodos no subtalâmica Núcleo de Ratos por longo prazo Estimulação Profunda do Cérebro

Nós descrevemos um método para a localização de guiada por estereotaxia, exposição e ablação do córtex auditivo em ratos. A localização da ablação é avaliada utilizando uma autópsia de coordenadas de mapa.

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Descreveremos um protocolo de cirurgia estereotáxica com um dispositivo caseiro de cabeça-corrigido para reagentes microinjecting para o corpo estriado do cérebro do rato neonatal. Esta técnica permite a manipulação genética em células neuronais de regiões específicas do cérebro de rato neonatal.

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Desvendando o papel das áreas discretas do cérebro de rato na regulação da ovulação através da inativação reversível por microinjeções de tetrodotoxinas

Descrevemos um método experimental pré-clínico para avaliar a neuromodulação metabólica induzida por estimulação cerebral profunda aguda com FDG-PET in vivo. Este manuscrito inclui todas as etapas experimentais, desde a cirurgia estereotáxica até a aplicação do tratamento de estimulação e a aquisição, processamento e análise de imagens PET.

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Aprenda a realizar cirurgia estereotáxica para lesões excitotóxicas em áreas específicas do cérebro de ratos adultos. Este método permite estudar funções de regiões cerebrais discretas em neurociência.

Cirurgia estereotáxica para lesão excitotóxica de áreas específicas do cérebro do rato adulto

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