Name: Não-plasma Colagem de PDMS para Fabricação barato e de dispositivos microfluídicos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-11-01T00:41:54.000+00:00
Duration: 4 min 45 s
Description: Aprenda a colar dispositivos microfluídicos de neurônios em vidro sem plasma usando forças eletrostáticas entre PDMS e vidro tratado com poli-L-lisina. Este método reversível e econômico forma selos estanques adequados para cultura celular em laboratórios sem equipamento de plasma.

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Preparar dispositivos microfluídicos para Neuron Cultura de Células 1) Limpe Corning No.1 24 milímetros X 40 milímetros lâminas de vidro <ul><li> Sonicate as lâminas de vidro em uma sonicador banho-maria durante 30 minutos </li><li> Enxaguar as lâminas de vidro com EtOH 70% </li><li> Lavagem das lâminas três vezes com dH 2 O </li><li> Slides seco em uma capa de cultura de tecido por várias horas, preferencialmente durante a noite </li></ul> Nota: Temos bandejas de metal especial que nós carregamos com os slides. Os slides são separados individualmente e colocados em ranhuras neste rack de metal. Podemos, então, colocá-las nas bandejas de metal em um prato de vidro que se enchem de água local, no sonicador banho de água e sonicado por 30 minutos. Lavagens subseqüentes serão realizadas neste prato. 2) Preparar os dispositivos PDMS <ul><li> Recorte o molde PDMS do wafer de silício, furos no elenco PDSM e do bairro que </li><li> Limpe os dispositivos PDMS pelo primeiro sopro de gás inerte (argônio ou nitrogênio) através deles. Em seguida, use 3M Scotch 471 Marca fita para retirar todos os restos remanescentes </li></ul> Nota: É importante manter os dispositivos de face para cima. Inicialmente, quando cortamos o PDMS longe do wafer de silício, o lado em contato com o wafer é o lado limpo: contém os canais microfluídicos. Tentamos ser tão cuidadoso quanto podemos para não danificar o dispositivo e mantenha a face limpa até estamos prontos para colagem plasma. <ul><li> Dispositivos autoclave em recipientes de plástico </li><li> Após autoclavagem, limpa No. 1 lâminas de vidro Corning e plasma tratar de dispositivos usando um aspirador Harrick plasma da marca, <a href="http://www.harrickplasma.com/" target="_blank">www.harrickplasma.com</a> </li><li> Colocar os dispositivos limpa lado de baixo na lâmina de vidro. </li></ul> O dispositivo está ligado ao plasma lâmina de vidro. 3) Revestimento Dispositivos com Poly L-lisina (PLL) <ul><li> PLL é adicionado a um poço em cada lado do dispositivo e permitiu a fluir através de dentro do poço próximo </li></ul> =&gt; 150 mL de PLL para os poços grandes e 30 μ l PLL para os poços menores. Ele não tem que ser exato, desde que os poços estão cheios. Nota: Se você olhar para um dispositivo você verá 4 poços: a cada dois estão ligados. Você quer colocar o PLL em um bem de modo que ele irá fluir através do dispositivo no poço próximo. <ul><li> Permitir que o PLL a fluir através do dispositivo por cerca de 10 minutos e depois adicionar mais PLL aos poços para preenchê-los </li><li> Coloque dispositivos que contêm PLL em uma incubadora a 37 ° C por um mínimo de 4 horas (overnight é preferível) </li><li> Vácuo o PLL excesso após o tratamento, mas tome cuidado para não sugar todo o líquido para fora do dispositivo </li></ul> Nota: Você não quer introduzir bolhas de ar para os canais ou câmara. Apenas o vácuo PLL excesso nos poços. <ul><li> Adicionar autoclavado dH 2 O a cada poço de cada lado do dispositivo, e permitir a fluir para o bem outras por ação capilar </li></ul> A Figura 1 é um diagrama de um dispositivo micro. Observe como o Blue (Soma lado) está conectado ea Red (lado axonal) são ligados. Quando dizemos que colocar o PLL, água ou ou mídia, em um poço em cada lado do dispositivo, o que queremos dizer, por exemplo, é: Coloque 150 ul de autoclavado dH 2 O em um Poço Azul em seguida, coloque 150 mL de autoclavado dH 2 0 em um Red Well. A água (ou PLL, ou Media, ou células) irá fluir através do dispositivo para o bem outras correspondente. <img src="/files/ftp_upload/old/410_2008_8_27_3/410_Figure-01.png" alt="Figura 1" width="362" height="216" /> Figura 1 Nota: Por favor note que, de agora em diante, quando eu digo &quot;mídia local, as células, a água ou PLL nos poços TOP&quot;, refiro-me ao diagrama acima onde o Soma seria à esquerda e os axônios vai crescer para o direita. <ul><li> Aspirar a água (mais uma vez tomando cuidado para não remover completamente todo o líquido do dispositivo), em seguida, adicione outro mL 150 de autoclavado dH 2 O para uma de cada bem ligado e deixe-a fluir através de correspondentes bem. </li><li> Coloque o dispositivo contendo dH 2 O em uma incubadora a 37 ° C por 1 hora, em seguida, repita a etapa de lavagem de novo. Lavar os dispositivos três vezes com dH 2 O de uma hora cada, que é o total. </li></ul> Nota: Devido à possibilidade de que borato do PLL pode absorver no PDMS, alguns no laboratório de incubação Jeon recomendo os dispositivos durante a noite com autoclavado dH 2 O após um par de initial lavagens rápidas. Isso irá garantir que todas as borato livre arbítrio vaza das PDMS antes do carregamento de células. Se isso não for feito, pode haver uma liberação de borato na mídia ao longo do tempo, o que pode levar à toxicidade. <ul><li> Adicionar Neural Mídia Basal (NBM), com os fatores necessários (Glutamax, B27, PenStrep) para os poços topo </li></ul> Nota: Os dispositivos podem ser incubadas durante a noite e revestida com as células no dia seguinte, ou incubadas um mínimo de três horas com fatores NMB + antes do plaqueamento das células. Preparar os neurônios Para Carregando nos dispositivos Nós usamos 18 dias córtex de ratos velhos fetal que quer comprar de uma empresa chamada Bits cérebro ou que é preparado aqui no campus para nós. Nós preferimos pegar o tecido fresco. <ol><li> Obter uma fetal córtex cerebral (2 pedaços de tecido) armazenados em Hibernate E </li><li> Tome 3 pipetas de vidro de comprimento e demiti-los cada um em tamanhos sucessivamente menores usando uma lâmpada de álcool </li><li> remoção dos tecidos do Hibernate E com uma pipeta de vidro e coloque em 2 ml de Fatores NMB + em um tubo estéril ml 15. </li><li> Trituração: Com uma pipeta de vidro do bulbo e córtex é passado para cima e para baixo cerca de 5 a 10 vezes. Então, a pipeta próximo menor é usado para pipeta cima e para baixo do tecido. Finalmente, o menor pipeta é usado para pipeta cima e para baixo do tecido. Nós gostamos de ter certeza de que não há pedaços visíveis. Nota: Recentemente, o Laboratório de Jeon começaram a comparar as células do tecido armazenado em Hibernate E às células que foram preparadas a partir do tecido inicialmente tratados com tripsina a 0,125% em 50% Ca + + livre e Mg + + buffer de dissecção livre. O consenso é que o tecido preparado com tripsina produzir células mais viável do que o tecido colocado inicialmente em Hibernate E. Se você NÃO vai usar o tecido imediatamente, então você precisa para armazenar o tecido em Hibernate E. Se você estiver indo para usar o tecido imediatamente e gostaria viabilidade aumentada, depois de tratar o tecido com tripsina antes da trituração mecânica da seguinte forma: 1) diluir 1 ml de tripsina 0,25% (Gibco, Invitrogen) com 1 ml de Ca + + livre Mg + + livre buffer de dissecção (Tripsina final = 0,125%) em um tubo de 15 ml (manter o frio do gelo), 2) de tecido lugar no buffer e imediatamente incubar a 37 ° C por 8 minutos, 3) adicionar 10 ml DMEM/10% FBS para parar o tripsina reação e continuar protocolo abaixo. </li><li> Células Centrifugar a 1100 rpm por 1 minuto </li><li> Media aspirado cuidadosamente fora o pellet celular </li><li> Adicionar 1 ml de fatores NMB + ao sedimento e re-suspenso-lo por pipetagem cima e para baixo </li><li> Passe as células re-suspenso por fluxo de gravidade através de um filtro para remover quaisquer grumos (BD célula Falcon 40 coador de nylon um) </li><li> Contagem e células da placa: <ul><li> Em um tubo de microcentrífuga, adicionar 60 mL + NMB fatores, 20 l da suspensão celular, e 20 l de azul de tripano em seguida, misture </li><li> Adicionar cerca de 10 ml desta solução para um hemocitômetro e contar as células vivas (não azul) </li><li> Ajuste a concentração de 2,5-4,5 x10 6 células / ml Nota: Em geral, obtemos uma concentração de cerca de 2,5-4,5 x 106 células / ml. dependendo do volume das células são ressuspendidas em (normalmente 1 ml + NBM B27/Glutamax/PenStrep percortex). Se o tecido foi preparado com tripsina, o rendimento será provavelmente maior. </li></ul></li></ol> O revestimento de Dispositivos <ol><li> Carga células (neurônios primário) em um poço do dispositivo </li><li> ML placa 5 por dispositivo pequeno e 20 l por equipamento grande Nota: Você pode carregar 10 ml de células na parte superior do dispositivo e 10 ml na parte inferior do dispositivo (volume total de metade), ou diretamente todos os 20 mL de células no bem superior Somal (5 mL na Somal top bem para os dispositivos de pequeno porte). </li><li> Incubar por 10 minutos em uma incubadora de 37 ° C para as células pode começar a anexar </li><li> Adicionar mL aproximadamente 150/30 de fatores + NMB a cada poço, dependendo do tamanho do dispositivo Nota: Os volumes podem variar dependendo da espessura do PDMS. Tudo o que importa é que os poços estão cheios. </li></ol> Em suplementar usando os dispositivos Sem Plasma Bonding Sem tratamento de plasma, Christina Tu, um técnico, que faz sucesso a cada semana, sem plasma, diz apenas carregar as células imediatamente. Lembre-se de remover a mídia de ambos os poços no lado soma (lado axônio não importa se você deixar a mídia in). É o fluxo de fluido que permite que as células a entrar no canal principal. Se você tiver a mídia nos poços, você não vai ter fluxo de fluido.

<ol><li>Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+culture+platform+for+neuroscience+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Microfluidic culture platform for neuroscience research.</a> Nat Protoc. 1 (4), 2128-2136 (2006).</li>
<li>Taylor, A. M., Blurton-Jones, M., Rhee, S. W., Cribbs, D. H., Cotman, C. W., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+culture+platform+for+CNS+axonal+injury%2C+regeneration+and+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport.</a> Nat Methods. 2 (8), 599-605 (2005).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a declarar.

Aqui demonstramos como usar o dispositivo neurônio microfluídicos sem a necessidade de um aspirador de plasma. Referimo-nos a essa ligação como não-plasma.

<table><tbody><tr><td>PDMS</td><td>Reagente</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>Sylgard 184 com agente de cura. Consulte a Dow Corning para encontrar um fornecedor próximo a você</td></tr><tr><td>Cornig No. 1 Cover Glass</td><td>Cobertura de vidro</td><td>Corning</td><td>Corning No. X2935 244</td><td>Disponível através da Fisher Scientific, número do catálogo Fish 12-531D</td></tr><tr><td>B27</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>O B27 é um suplemento proprietário disponível pela Invitrogen em sua linha Gibco de reagentes para cultura celular.</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td>O Glutamax está disponível pela Invitrogen em sua linha Gibco de reagentes para cultura celular.</td></tr><tr><td>Placa de Petri de 60 mm</td><td>Ferramenta</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-13A</td><td>Placas de Petri estéreis de poliestireno de 60 mm são usadas para acomodar o dispositivo ligado ao vidro.</td></tr><tr><td>Polilisina</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-1274</td><td></td></tr><tr><td>Tubo BD Falcon de 50 ml</td><td>Ferramenta</td><td>BD Biosciences</td><td>Falcon No. 352098</td><td>Disponível através do número do catálogo da Fisher Scientific 14-959-49A</td></tr><tr><td>Tubo BD Falcon de 15 ml</td><td>Ferramenta</td><td>BD Biosciences</td><td>Falcon No. 352097</td><td>Disponível através do número do catálogo da Fisher Scientific 14-959-70C</td></tr></tbody></table>

não-plasma colagem de pdms para fabricação barato e de dispositivos microfluídicos

Non-plasma Bonding of PDMS for Inexpensive Fabrication of Microfluidic Devices

Neste vídeo, que demonstram como usar o dispositivo neurônio microfluídicos sem ligação plasma. Em alguns casos pode ser desejável para dispositivos reversivelmente vínculo com a tampa de vidro Corning No. 1. Isto pode ser devido, talvez, para um aspirador de plasma não estar disponível. Em outros casos, pode ser desejável para remover o dispositivo a partir do vidro após a cultura de neurônios para certos tipos de microscopia ou para imunomarcação, embora não seja necessário remover o dispositivo para a imunocoloração desde os neurônios podem ser marcadas no dispositivo. Alguns pesquisadores, no entanto, ainda preferem remover o dispositivo. Neste caso, a ligação reversível do dispositivo para a tampa de vidro torna isso possível. Existem algumas desvantagens para não-plasma de ligação dos dispositivos em que não tão apertado de um selo é formado. Em alguns casos, os axônios podem crescer sob os sulcos, em vez de através deles. Além disso, como o vidro e PDMS são hidrofóbicos, os líquidos não são facilmente entrar no dispositivo tornando-se necessário, por vezes, à força da mídia e outros reagentes para o dispositivo. Líquidos entrará no dispositivo através de ação capilar, mas leva muito mais tempo, em comparação com dispositivos que foram coladas plasma. O limpador de plasma cria taxas temporárias hidrofílica sobre o vidro e um dispositivo que facilitam o fluxo de líquidos através do dispositivo após a ligação dentro de segundos. Para não-dispositivos de plasma ligada, o fluxo de líquidos através dos dispositivos leva alguns minutos. Também é importante notar que os dispositivos a serem utilizados com os não-plasma de ligação precisam ser esterilizados em primeiro lugar, enquanto que os dispositivos de plasma tratados não precisam ser esterilizados antes de usar, pois o limpador de plasma vai esterilizá-los.

Neste vídeo mostramos como usar o dispositivo neurônio microfluídicos sem ligação plasma.

Não-plasma Colagem de PDMS para Fabricação barato e de dispositivos microfluídicos

Neste vídeo, demonstramos como utilizar o dispositivo microfluídico de neurônios sem a colagem por plasma. Em alguns casos, pode ser desejável realizar a colagem reversível...

Os laboratórios que rotineiramente realizam fotolitografia e litografia mole geralmente possuem o que se chama de limpador de plasma. Um limpador de plasma possui uma bobina elétrica, que cria um gás parcialmente ionizado composto por elétrons, íons, átomos e moléculas neutros. O plasma gera espécies reativas na superfície do vidro e do dispositivo, que, quando colocados juntos, formarão uma ligação permanente.O plasma também torna a superfície do dispositivo hidrofílica, o que facilita a adição de líquidos. Em alguns casos, no entanto, uma ligação permanente e irreversível não é desejável. Além disso, muitos laboratórios não têm acesso a um limpador de plasma.Para abordar essa preocupação hoje, demonstraremos a ligação reversível, não plasmática, do dispositivo neuronal ao vidro de cobertura; as forças eletrostáticas entre o PDMS e o vidro formam uma ligação impermeável e adequada para o cultivo celular. Gostaria de apresentar a você Kiana Lee. Ela fará as demonstrações hoje.Lâminas de microscopia Corning número 1, com dimensões de 24 milímetros por 40 milímetros, são limpas utilizando uma banho ultrassônico com água. Os vidros são colocados em uma grade de aço inoxidável, que é então posicionada em um recipiente de vidro preenchido com água desionizada. O recipiente de vidro é, em seguida, colocado na banho ultrassônico com água.As lâminas de vidro são então sonicadas por 30 minutos. Após a sonicação, a água desionizada é descartada do recipiente de vidro. É colocado no recipiente de vidro com as lâminas de vidro etanol a 70%, que é então levado para dentro de uma cabine de segurança biológica padrão para mantê-las estéreis.Após a lavagem com etanol 70%, a grade de aço inoxidável é removida do recipiente de vidro e as lâminas de vidro são deixadas secar completamente por várias horas ou durante a noite. Em seguida, dentro da cabine de segurança biológica, as lâminas de vidro são revestidas com PLL mediante imersão em um recipiente contendo solução de PLL. As lâminas de vidro permanecem em imersão na solução de PLL por no mínimo três horas ou durante a noite.Após o revestimento com PLL, o líquido de PLL é removido da placa e, em seguida, as lâminas de vidro são lavadas cuidadosamente com água desionizada. Após a lavagem da lâmina revestida com PLL com água várias vezes, a placa é preenchida com água e as lâminas de vidro permanecem em imersão por várias horas. Após a imersão por várias horas em água desionizada, a água é aspirada da placa.As lâminas de vidro serão enxaguadas rapidamente e, em seguida, removidas da placa e colocadas em uma grade de aço inoxidável, sendo deixadas secar durante a noite. Em uma cabine de segurança biológica, os dispositivos neuronais são levados para dentro da cabine e lavados cuidadosamente com etanol 70% para esterilizá-los. O etanol em excesso é então aspirado do dispositivo. Os dispositivos são então deixados secar durante a noite dentro da cabine de segurança biológica no dia seguinte.Esse dispositivo estéril para neurônios é simplesmente colocado sobre o vidro limpo, estéril e tratado com PLL. O PDMS forma um selo reversível com o vidro, impermeável a líquidos. Um dispositivo é ligado ao vidro com pressão suave; em seguida, células ou meio são imediatamente adicionados ao dispositivo.Esperar muito tempo para adicionar meio ou células ao dispositivo após a montagem pode dificultar a entrada do líquido no dispositivo. É importante observar que o líquido não entra prontamente nos dispositivos não tratados com plasma tão rapidamente quanto nos dispositivos tratados com plasma. Os dispositivos tratados com plasma são inicialmente hidrofílicos logo após o tratamento com plasma, permitindo que os líquidos fluam facilmente para dentro do dispositivo hidrofílico, enquanto o fluxo através dos dispositivos não ligados por plasma é muito mais lento.Em alguns casos, pode ser necessário usar uma pipeta para forçar o líquido para dentro do dispositivo. Neste vídeo, mostramos como ligar não plasmaticamente o dispositivo neuronal ao vidro de cobertura. Este é um método eficiente e econômico para ligar reversivelmente PDMS a superfícies de vidro.Esperamos que você tenha encontrado este vídeo informativo e útil. Assim sendo, é só isso do John Lab. Obrigado por assistir.

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