Processamento de tecido primário do tumor cerebral para Ensaios de Células Tronco e Fluxo de Classificando

O objetivo geral deste procedimento é estudar células iniciadoras de tumores cerebrais in vitro. Isso é feito primeiro dissociando mecanicamente e enzimaticamente os tumores humanos primários e, em seguida, cultivando-os em condições de cultura livre de soro de células-tronco. A próxima formação de esferas é monitorada por três a cinco dias.

As esferas tumorais são então digeridas enzimaticamente novamente e seus marcadores de superfície são avaliados por citometria de fluxo. A etapa final é classificar as células desejadas em placas de 96 poços ou lâminas de grade PL para caracterização posterior. Em última análise, a capacidade de auto-renovação e a expressão gênica diferencial da população classificada podem ser avaliadas limitando a análise de diluição e o RTPC de célula única.

A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como a análise de tumores em massa, é que ela isola prospectivamente as populações de células iniciadoras de tumores cerebrais ou células-tronco cancerígenas. Tivemos a ideia para este método pela primeira vez quando aplicamos as condições de cultura originalmente usadas para células-tronco neurais normais a uma variedade de tumores cerebrais humanos e descobrimos que este método de cultura selecionado especificamente para populações semelhantes a células-tronco demonstrando o procedimento será pós-doutorado associado à pesquisa CHITRA AL estudantes de pós-graduação, bran Van Manen e Sarah Nolte, e nossa técnica de citometria de fluxo Nicole McFarland, todos de nosso laboratório Comece adicionando 200 microlitros de descongelamento a 15 mililitros de líquido cefalorraquidiano artificial ou A CSF e, em seguida, colocando o tubo em um banho-maria de 37 graus Celsius. Leve a solução de cloreto de amônio à temperatura ambiente neste momento também.

Em seguida, a cinco mililitros de A CSF para um recipiente de amostra de tecido tumoral cerebral, gire o recipiente para enxaguar e, em seguida, canalize-o para remover os glóbulos vermelhos. Agora transfira o tecido para uma placa de Petri estéril de 100 milímetros e use tesouras finas e pinças para desagregar o tecido até uma consistência de pasta. Em seguida, colete a amostra usando uma pipeta regular de 10 mililitros e fórceps e transfira os fragmentos de tecido para o tubo contendo o LCR A pré-aquecido.

Com liase, coloque o tubo em um agitador de incubadora a 30 RPM e 37 graus Celsius. E então, após 15 minutos, filtre o lisado de tecido através de um filtro de células de sete micrômetros D em um tubo cônico de 50 mililitros. Gire o filtrado para baixo por cinco minutos a 280 GS em temperatura ambiente.

Em seguida, remova cuidadosamente o snat e avalie o tamanho e a cor do pellet resultante. Em seguida, ressuspenda o pellet em um mililitro de PBS e, em seguida, adicione uma quantidade apropriada de solução de cloreto de amônio com base no tamanho do pellet e na contaminação dos glóbulos vermelhos. Então, após uma incubação de cinco minutos em temperatura ambiente, gire as células após uma segunda lavagem em PBS, ressuspenda o pellet em cinco mililitros de meio completo de células-tronco neuro e, em seguida, transfira a suspensão celular para uma placa de cultura de tecidos de 60 milímetros de ligação ultrabaixa nos primeiros dias.

Complete as culturas com um a dois mililitros de mídia conforme necessário, trocando a mídia apenas quando a cor ficar levemente amarelada. Comece transferindo a cultura esfeal do tumor para um tubo cônico de 15 mililitros. Adicione dois a três mililitros de PBS estéril para enxaguar bem a placa e, em seguida, adicione a lavagem ao tubo de saliva do tumor.

Depois de girar as células, remova o snat e ressuspenda o pellet em um a dois mililitros de PBS estéril e, em seguida, adicione 10 microlitros de liase. Um desafio dessa técnica é manter a viabilidade das células-tronco tumorais sólidas durante o processamento. Qualquer manipulação das células durante a cultura e a sação requer um toque suave.

Em seguida, incube o tubo em banho-maria a 37 graus Celsius. Após três minutos, remova e avalie visualmente a suspensão. Se vários aglomerados forem vistos, use uma ponta de pipeta de 1000 microlitros para iterar suavemente o aglomerado de células.

Agora lave as células em cinco mililitros de PBS estéril e, depois de remover o sobrenadante S, ressuspenda o pellet em 500 a 1000 microlitros de PBS estéril mais dois EDTA milimolar. Finalmente, depois de avaliar o número de células e a viabilidade usando o azul de Trian, ajuste a contagem de células para 1 milhão de células por mililitro em PBS mais EDTA. Comece transferindo 100 microlitros da suspensão celular por teste para tubos de fluxo individuais de 12 por 75 milímetros.

Depois de adicionar os anticorpos apropriados, incube as amostras no gelo por 30 minutos e, em seguida, lave qualquer anticorpo não ligado em dois mililitros de PBS mais EDTA por tubo. Agora transvase a solução de lavagem, seque os tubos e ressuspenda os grânulos celulares em mais 300 microlitros de PBS mais EDTA. Em seguida, adicione 10 microlitros do corante de viabilidade sete A a D a cada tubo.

Depois de incubar os tubos por pelo menos 15 minutos no gelo, as células estão prontas para a análise por citometria de fluxo. Depois de usar a amostra de controle negativo para ajustar os parâmetros de dispersão direta e lateral, desenhe uma região ao redor das células de interesse semelhante à mostrada neste gráfico superior representativo. Ajuste a tensão nos detectores de fluorescência utilizados para colocar as células negativas nas primeiras duas décadas, conforme necessário.

Em seguida, use o corante de viabilidade sete A a d para criar uma segunda região para a exclusão de células mortas semelhante à região mostrada neste gráfico superior representativo. Em seguida, aplique as portas de dispersão e de células vivas a todos os gráficos de fluorescência e use os controles de coloração única para subtrair qualquer sobreposição espectral. Por fim, execute os exemplos.

Comece o ensaio de diluição limitante classificando as células dissociadas em diluição variável para uma única célula por poço em poços individuais de uma placa de 96 poços contendo 200 microlitros de meios NSC, as neuroesferas geralmente se formam durante um período de sete dias e a taxa de formação de esferas subsequente nos últimos sete dias em cultura pode ser calculada para RTPC de célula única. Depois de classificar células individuais das populações de interesse nos locais de reação de uma lâmina de grade ampla, adicione um microlitro de mistura principal ao centro de cada local de reação e, em seguida, cubra imediatamente cada local com cinco microlitros de solução de teto. Em seguida, usando um ciclador de lâminas de alta velocidade, incube a lâmina por três ciclos de temperatura.

Após a transcrição reversa, adicione três microlitros de água livre de DN a rase a cada local de reação. Em seguida, transfira toda a mistura de cada local de reação para tubos de PCR individuais. Finalmente, para quantificação em tempo real, execute as amostras em um ciclador BioRad.

Esta primeira figura mostra uma ressonância magnética de um paciente representativo com glioblastoma. As células tumorais dissociadas podem ser marcadas com os marcadores de células-tronco da superfície neural, CD 1 33 e CD 15, e analisadas por citometria de fluxo, conforme mostrado neste gráfico de pontos representativo. Aqui, o gráfico de amplificação para a reação RTPCR representativa de célula única é mostrado.

Os valores de CT obtidos a partir de tal gráfico podem ser usados para calcular os níveis de expressão relativa dos genes de interesse. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como dissociar enzimaticamente e cultivar tecido tumoral cerebral primário para enriquecer as populações de células-tronco. Você também saberá como estudar a capacidade de auto-renovação e a expressão gênica diferencial de populações de células-tronco classificadas, realizando análise de diluição limitante ou RTPC de célula única.