Geração, purificação, caracterização e de Cell-invasivos espécies de proteína Disc1

O objetivo geral dos procedimentos a seguir é gerar disco purificado. Um agregado capaz de invadir as células receptoras. Dois métodos diferentes para atingir esse objetivo serão demonstrados com o primeiro método.

A proteína de fusão do disco de uma proteína fluorescente formadora de assoma é superexpressa em células doadoras de neuroblastoma humano NLF. As células são então lavadas com PBS coletado e deitado sem o uso de detergentes. O DNA é digerido e as zonas agrícolas são purificadas usando um sistema de gradiente de sacarose.

Agrios purificados por este método têm uma baixa eficiência de invasão celular. A abordagem alternativa é superexpressar os aminoácidos 5 98 a 7 85 da proteína recombinante do disco um em E coli. O fragmento de proteína é então marcado com DITE 5 94 dialisado e purificado usando uma matriz NI NTA que remove qualquer disco multimérico de corante não ligado restante.

Um fragmento gerado por este método tem uma alta eficiência de invasão celular para avaliar a invasão da célula hospedeira. Ou o disco de proteína fluorescente purificado, um risomes ou o disco recombinante marcado. Um fragmento é incubado com as células receptoras de interesse.

O azul triano é então adicionado para extinguir a fluorescência extracelular e a invasão é visualizada por microscopia confocal. Até agora, a agregação de proteínas não tem sido uma característica reconhecida das doenças mentais crônicas como a esquizofrenia. Onde a proteína interrompida na esquizofrenia é uma célula candidata, a invasão de agregados de proteínas é uma característica marcante para doenças de confirmação de proteínas.

Aqui mostramos com dois métodos que os agregados de proteínas do disco um são invasivos por células e, portanto, que os distúrbios relacionados ao disco um ou as neuropatias do disco um são distúrbios de confirmação de proteínas. Os dois métodos são, em primeiro lugar, a purificação do disco de comprimento total, um ASOS de linhagens celulares de neuroblastoma e, em segundo lugar, a expressão de um disco multimérico C terminal. Um fragmento em e coli, bem como a purificação e rotulagem com o corante fluorescente.

Enquanto o primeiro método leva apenas a uma invasão celular de baixa eficiência de oh 0,3% das células que absorvem os microssomas purificados, o fragmento de proteína recombinante pur infecta até 20% das células expostas. Os métodos aqui descritos devem ser transferíveis para outras proteínas em que a formação de acrossomas ou a montagem multimérica tenham sido demonstradas de forma convincente. Em cada um dos 10 pratos de 10 centímetros.

Semeie 1,5 vezes 10 para os seis neuroblastoma humano e células LF em meio RPMI 1640 suplementado e cresça durante a noite. No dia seguinte, as células devem ser 70 a 80% confluentes, rotular cinco placas para transfecção com PC DNA 3.1, MRFP e EGFP marcado com disco humano de comprimento total um e cinco para transfecção apenas com plasmídeo EGFP. Para cada prato de 10 centímetros, combine 15 microgramas de DNA de plasmídeo 30 microlitros encontrados afetando e 750 microlitros.

Opti MEM em um tubo de microcentrífuga e faz pipetagem para cima e para baixo, incubar em temperatura ambiente por 20 minutos. Em seguida, para transfectar as células, adicione a solução reagente de transfecção de DNA, gota a gota às células, incube as células a 37 graus Celsius com 5%CO 2 48 horas após a transfecção, monitorou a expressão do disco de comprimento total MRFP um e confirmou a formação de zonas agrícolas sob um microscópio de fluorescência. Algumas células abrigam inclusão maciça de proteínas fluorescentes, como mostrado aqui.

Este protocolo combina um método para purificar corpos de Lewy do tecido cerebral e o protocolo para isolar agregados maiores ou zonas agrícolas, uma vez que os métodos já existentes são baseados no uso de detergentes, o isolamento de proteína livre de detergente para a aplicação em ensaios de invasividade celular é crítico. Em seguida, aspire a lavagem média com PBS e adicione 400 microlitros de PBS contendo coquetel inibidor de protease. Em seguida, raspe as células e adicione um mililitro de suspensão celular e 10 contas de cerâmica a um tubo de lise de dois mililitros.

Lys as células usando três pulsos de 62º em um homogeneizador de lise 24 pré-celular. A força mecânica do processo pode aumentar a temperatura dentro da amostra para mais de 37 graus Celsius. Portanto, deve-se tomar cuidado para resfriar a amostra no gelo Após o procedimento de lise, após resfriar as células no gelo, adicione 10 milimolares de cloreto de magnésio 40 unidades por mililitro de DNAA e incube por 60 minutos a 37 graus Celsius com agitação.

Prepare 10 mililitros cada um dos 80%50% e 20% de peso de sacarose por volume em PBS. Em seguida, em um tubo cônico de 15 mililitros, prepare o gradiente de sacarose começando com dois mililitros de 80% de sacarose seguidos por dois mililitros de 50% e dois mililitros de 20% de sacarose. Despeje o gradiente lentamente e tome cuidado para não perturbar as camadas já derramadas.

Em seguida, coloque o lisado digerido no topo do gradiente e centrifugue por 15 minutos a 1000 vezes G a quatro graus Celsius. Com a interrupção, colete cuidadosamente a interface entre a camada de sacarose de 50 a 80% com uma pipeta e misture com cinco volumes de uma centrífuga de tubo cônico de 15 mililitros por 15 minutos a 1000 vezes G a quatro graus Celsius. Remova cuidadosamente o sobrenadante e mantenha a zona agrícola contendo pellets.

Repita a lavagem mais duas vezes nesta interface. As zonas agrícolas são fluorescentes e podem ser visualizadas no microscópio sob luz ultravioleta após a última lavagem, descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 250 a 500 microlitros de PBS. Este pellet contém as zonas agrícolas purificadas.

Adicione 10 microlitros de disco MRFP, uma suspensão asome a cada poço de uma placa de 24 poços contendo células de neuroblastoma humano SHSY cinco Y. Expressão constitutiva do disco de GFP solúvel um terminal C em lamínulas de vidro estéril e incubação durante 48 a 72 horas após a incubação. Lave as células três vezes com PBS e apague a fluorescência extracelular com 0,04% de azul triano por cinco minutos.

Em seguida, lave com PBS para remover o azul trian. Em seguida, coloque o prato no gelo e adicione 4% de PFA e PBS por 10 minutos para fixar as células. Em seguida, lave uma vez com água estéril e monte as lamínulas em lâminas de vidro com ouro prolongado com meio de montagem DPI.

Confirme a absorção na invasão de exógena. Zonas aggro aplicadas por colocalização com proteínas recrutadas expressas por células receptoras em imagens Zack. Este Zack abrange aproximadamente seis micrômetros de profundidade.

24 fotos tiradas em etapas de 200 nanômetros. A fluorescência do disco MRFP uma zona agrícola mostrada em vermelho recruta o disco terminal GFPC citosólico. Um fragmento mostrado na colocalização verde apresenta-se como amarelo e indica que as zonas agrícolas entraram no citosol receptor e recrutaram a proteína do disco um anteriormente solúvel.

Nesta parte do protocolo, o disco humano será rotulado com DITE 5 94. Este D permite o monitoramento direto da proteína recombinante sem a necessidade de imunocoloração adicional. Comece liberando a proteína preparada conforme descrito no documento anexo do mercaptoetanol de feixe, dialisando-a três vezes em dois litros de PBS em uma diluição de um a 2000.

Em seguida, rotular um disco de miligrama, um com DITE 5, 94 IDE, dissolver um miligrama por mililitro de proteína em PBS e adicionar cinco TCEP milimolar para recuperar grupos TH livres, adicionar 20 microlitros do corante dissolvido DMF à reação e incubar por duas horas em temperatura ambiente usando um de diálise SLI com um corte de peso molecular de 10, 000. Daltons dialisam a proteína três vezes em PBS na proporção de um para 2000 por duas horas de cada vez. Em seguida, para aumentar ainda mais a pureza da proteína marcada.

Uma purificação de afinidade baseada em tag de chiado em uma coluna NI NTA é realizada. Lave um mililitro de matriz NI NTA com 10 mililitros. O PBS então aplica a proteína dialisada marcada na coluna e deixa-a correr sobre a coluna.

Lentamente, a solução perderá uma parte de sua cor azul devido à ligação da proteína à matriz NTA, o corante livre não marcado permanecerá no fluxo. Uma vez que a solução proteica é inserida. A coluna, lave a coluna três vezes com 20 mililitros de PBS para eluir a proteína, adicione dois mililitros de PBS contendo 500 milimolares ole à coluna.

Defina a válvula para velocidade lenta e elua gota a gota enquanto monitora a faixa colorida na coluna N NI NTA. Para ser aludido, esta fração colorida do eluato contém uma proteína recombinante marcada, transfira o EIT para um de diálise SLI e dialise o EIT três vezes para 10 NAPI milimolares em uma diluição de um a 2000 por duas horas cada em dois litros após a diálise. Empurre o EIT através de um filtro de seringa estéril de 0,45 micrômetro, depois alíquota em amostras de cinco vezes 100 microlitros e congele em nitrogênio líquido.

A quantidade total de proteína deve ser de 0,5 a um micrograma por mililitro em cada alíquota de 100 microlitros. Para avaliar a invasividade da proteína, adicione um meio contendo cinco a 10 microgramas por mililitro de proteína de disco recombinante marcada com uma proteína a cada poço de uma placa de 24 poços contendo células receptoras de neuroblastoma humano SH SY cinco Y. Expressando constituintemente o disco de marcação GFP solúvel um terminal C em lamínulas de vidro estéreis, incubar por 48 a 72 horas.

Extinguir, fixar a fluorescência extracelular e montar as células como feito para as células tratadas com a zona agri, confirma a invasão da proteína recombinante aplicada exogenamente pela Zack Imaging. Quando a proteína marcada é absorvida, ela é detectada dentro do perímetro das células receptoras em imagens geradas por microscopia confocal. Este Zack abrange aproximadamente cinco micrômetros de profundidade em 24 passos de 220 nanômetros.

Aqui, o fragmento de disco recombinante um 5 98 a 7 85 mostrado em vermelho é ocupado por células receptoras que expressam o disco marcado com GFP do terminal C solúvel um mostrado em verde para determinar a invasividade do disco. Um agregado de proteína agro zonas consistindo de MRFP marcado com disco de comprimento total um foram purificados de células NLF e aplicados ao receptor SH SY cinco células Y, conforme descrito nesta foto, conforme mostrado aqui. A-M-R-F-P marcou disco um acrossoma invadiu um neuroblastoma humano SH SY cinco células Y expressando GFP solúvel marcado C disco terminal um.

Além disso, o disco marcado com MRFP um asome foi capaz de recrutar o disco um marcado com GFP solúvel em agregados insolúveis para determinar a invasividade do disco recombinante marcado com luz DIA um foi aplicado a células de neuroblastoma SH SY cinco Y expressando disco GFP solúvel um, como mostrado aqui. Os alterdores de proteína do disco recombinante um mostrados em vermelho invadiram a célula receptora pontos amarelos indicam um recrutamento de disco terminal C marcado com GFP solúvel em agregados rotulados como disco recombinante expresso e purificado de e coli também foi invasivo para neurônios in vivo quando a proteína multimérica foi injetada estereotaticamente no córtex pré-frontal medial de um rato. A imagem de Zack confirma a presença da proteína recombinante do disco um no neurônio cortical de rato corado com um anticorpo contra núcleos neuronais.

Acabamos de mostrar dois métodos para gerar agregados de disco um para estudar a invasão celular. Usando qualquer um desses métodos, podemos investigar os efeitos celulares da captação de agregados do disco um sem as variáveis potencialmente confusas da expressão gênica recombinante por transfecção de DNA estranho. Essas técnicas podem ser aplicadas para investigar os efeitos biológicos da patologia da proteína do disco um in vitro em células e in vivo por inoculação intracerebral ou outra administração em modelos animais.

Estamos confiantes de que essas técnicas também podem ser transferidas para outros agregados de proteínas, eventualmente, com pequenas modificações no protocolo adotado para cada proteína em particular. Ao fazer este procedimento, certifique-se de dedicar tempo para uma análise diligente das imagens de microscopia confocal.