Name: Geração, purificação, caracterização e de Cell-invasivos espécies de proteína Disc1 (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 33 s
Description: Aprenda a gerar e purificar agregados de proteína DISC1 capazes de invadir células receptoras usando duas metodologias distintas. Este protocolo demonstra a invasão celular em culturas de neuroblastoma e em neurônios in vivo.

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Este trabalho foi financiado pelo neurônio-ERANET descobrir (BMBF 01EW1003) para CK e JPH, DFG (Ko 1679/3-1; GRK1033) para CKVB é suportado por uma concessão do Forschungskommission da Faculdade de Medicina da Universidade de Düsseldorf.

1. Preparação de células doadoras Aggresome: transfecção de proteína monomérica Vermelho Fluorescente (MRFP) ou proteína verde fluorescente melhorada (EGFP)-marcado Comprimento Humanos completa (FL) DISC1 <ol><li> Semente de 1,5 x 10 6/10 cm prato neuroblastoma humano NLF (NLF; Hospital Infantil da Filadélfia, Philadelphia, PA) células em 10 placas de 10 cm e crescer durante a noite. Células NLF são cultivadas em RPMI-1640 suplementado com FBS 10%, penicilina / Strepomycin, L-Glutamina. No dia seguinte, as células devem estar a 70-80% de confluência. </li><li> Transfectar transitoriamente cada prato de 10 cm com 15 ug de DNA de plasmídeo e o reagente de transfecção Metafectene (Biontex, Martinsried, Alemanha). Em resumo, para um prato de 10 cm, 15 ug de ADN plasmídico e 30 Metafectene ul foram adicionados a 750 ul de Opti-MEM, misturadas e incubadas à temperatura ambiente durante 20 min. 5 pratos foram transfectadas com pcDNA3.1 MRFP / eGFP-tagged humanos (FL) Disc1 e 5 pratos com a sós eGFP-plasmídeo. </li></ol> 2. AggresomeA purificação a partir de células do doador Transfectadas O protocolo aqui descrito é uma combinação de um método para purificar-Lewy Bodies a partir de tecido cerebral 13 e um protocolo para isolar grandes agregados e aggresomes 14. Uma vez que os métodos já existentes baseiam-se no uso de detergentes, o isolamento de detergente livre de proteínas para a aplicação em ensaios de células-invasividade é crítica. <ol><li> 48 h após a transfecção, monitorizar a expressão de eGFP e mRFP/eGFP-DISC1 e confirme a formação de aggresomes sob um microscópio de fluorescência (Figura 1). </li><li> Lavar as células com PBS, pH 7,4, com 400 scrape ul de PBS cada, adicionar cocktail inibidor 1X Protease (Roche, Indianapolis, IN) e romper as células utilizando um homogeneizador Precellys24 (Bertin tecnologias, França). Resumidamente, adicionar 1 ml de suspensão de células para um tubo de lise 2 ml e adicionar 10 contas de cerâmica. Lisar as células com 3 x 60 pulsos seg. A força mecânica do processo podeaumentar a temperatura no interior da amostra acima de 37 ° C de modo deve ser tomado cuidado para refrigerar a amostra em gelo, após o procedimento de lise. </li><li> Arrefecer as células sobre gelo e adicionam-se 10 mM de MgCl 2, 40 U / ml de ADNase A e incubar durante 60 min a 37 ° C </li><li> Preparam-se soluções de 80%, 50%, sacarose a 20% (w / v) em PBS pH 7,4 (10 ml cada). </li><li> Preparar o gradiente de sacarose em 15 ml de tubo falcon, começando com 2 ml de sacarose a 80%, seguido de 50% e 20%. Despeje o gradiente devagar e ter cuidado para não perturbar as camadas já derramadas. Camada do ligado digerido no topo do gradiente e centrifugar durante 15 minutos a 1000 xg, a 4 ° C. </li><li> Recolher cuidadosamente a interfase entre a camada de sacarose a 50-80% com uma pipeta e misture com 5 volumes de PBS, pH 7,4. Centrifugar durante 15 minutos a 1000 xg, a 4 ° C. Repetir a lavagem duas vezes. Neste interfase, aggresomes são fluorescentes e podem ser visualizadas ao microscópio sob luz UV. </li><li> Descartar o sobrenadante eressuspender o sedimento em 250-500 ul de PBS pH 7,4. Este pellet contém o aggresomes purificado (Figura 2). </li></ol> 3. Tratamento de destinatário SH-Sy5y Células com mRFP/eGFP-DISC1 Aggresomes <ol><li> Semente de 5 x 10 4 receptoras SH-Sy5y células de neuroblastoma humano constitutivamente expressando GFP-DISC1 (598-854), em lamelas de vidro estéreis em cada poço de uma placa de 24 poços. SH-Sy5y células são cultivadas em meio suplementado com DMEM/F-12 de penicilina / estreptomicina e não-aminoácidos essenciais (NEAA) e FBS a 10%. </li><li> 24 horas mais tarde, adicionam-se 10 ul a cada poço e incubar durante 48-72 horas. </li><li> Lavar as células 3 x com PBS pH 7,4 e extinguir a fluorescência extracelular com 0,04% de azul de tripano durante 5 min. </li><li> Fixar as células com PFA a 4% em PBS, pH 7,4, durante 10 min em gelo, lava-se uma vez com H2O estéril e montar as lamelas sobre lâminas de vidro com prolongar ouro com DAPI meio de montagem (Invitrogen, EUA). </li><li> Confirme a captação /invasão de exogenamente aggresomes aplicadas pela co-localização com proteínas recrutados expressas por células receptoras no Z-stack imagens. </li></ol> No entanto, a absorção / invasão de proteína exógena pode não ser detectada essencialmente em paralelo com o recrutamento de proteínas da célula hospedeira. No nosso exemplo MRFP-tagged DISC1 aggresomes recruta solúvel GFP-tagged DISC1 (598-854) da proteína expressa pela célula hospedeira (ver Figura 3). Fotos foram tiradas em um LSM Zeiss 510 a Zeiss confocal ou Axiovision Microscópio Apotome2. 4. Geração de DISC1 recombinante (598-785) Numa publicação anterior, foi analisada a capacidade de vários fragmentos de proteína Disc1 a auto-interagir com base na presença de auto-associação de domínios. Entre todos os fragmentos de proteína testada humano DISC1 (598-785) mostrada a propensão mais forte multimerização 4 (Figura 4). Portanto, DISC1 humana (598-785) foi clonado em pET15b (nVagen, Madison, Wisconsin), contendo um grupo N-terminal 6 histidina-tag, expressa em E. coli BL21-(lDE3) Rosetta (Novagen, EUA), e purificada em condições desnaturantes em ureia 8 mol / l, como descrito 4. Em resumo, o protocolo é descrito a seguir. <ol><li> BL21-(ide3) Rosetta E. coli foram cultivadas em 2 x 500 ml, contendo 5 mM de 2YT-arginina-HCl, 5 mM de MgSO4, 100 mg / ml carbencillin, 35 ug / ml de cloranfenicol até uma OD 600: 0,6-0,8 e DISC1 (598-785) a expressão foi induzida com IPTG 1 mM. </li><li> DISC1 (598-785) foi expresso durante 4 hr a 37 ° C, a expressão foi terminada pela colheita das bactérias por centrifugação. </li><li> O sedimento bacteriano foi ressuspenso em 50 ml de tampão TE (50 mM de TRIS-HCl pH 8,0, EDTA 5 mM) mais 2 mM de PMSF, 1% de TX-100, 250 ug / ml de lisozima, 20 mM de MgCl2 e 400 ml U/50 DNase I. A fim de garantir uma lise completa, a mistura reaccional foi incubada durante 30 min à temperatura ambiente com agitação suave. </li><li> Adicionar 10 mM β-mercaptoethanol (ME) e 500 mM de NaCl, e incubar durante mais 30 minutos. </li><li> Girar corpos de inclusão bacterianos em 20,000 g durante 30 min a 4 ° C. </li><li> Ressuspender o granulado em 50 ml de tampão de extracção contendo 50 mM de Tris pH 8,0, 5 mM de imidazole, 500 mM NaCl, ureia 8 M e 10 mM β-ME e remover detritos por centrifugação a 20,000 g durante 30 min a 4 ° C. </li><li> Lava-se a Ni-NTA agarose matriz com tampão de extracção. Incubar o sedimento, o extracto de proteína precleared com matriz de Ni-NTA durante 2 h à RT. </li><li> Lava-se a matriz de Ni-NTA, com tampão de extracção contendo 12 mM de imidazole. </li><li> Eluir a proteína lentamente com 15 ml de tampão de eluição contendo 50 mM de Tris, 500 mM NaCl, 300 mM de imidazole, 8 M de ureia, 1 mM PMSF, 5 mM de EDTA e 10 mM β-ME. </li><li> Dialisar a proteína de passo a passo para PBS pH 7,4 contendo 10 mM de β-ME. </li></ol> A partir de 1 L de cultura bacteriana de partida, é possível isolar-se a 50 mg de DISC1 recombinante (598-785) protein. α-sinucleína redobragem Para experiências com α-sinucleína, 500 ug da proteína recombinante (Sigma-Aldrich, EUA) foi dissolvido em PBS a uma concentração de 1 mg / ml. Para obter oligómeros, a redobragem foi realizada durante a noite a 37 ° C, tal como descrito numa publicação anterior 10. 5. Rotulagem de DISC1 recombinante (598-785) com DyLight594 <ol><li> Antes do processo de marcação posterior, DISC1 (598-785) proteína tem a ser libertado de β-ME. Portanto, a proteína é dialisada três vezes com PBS pH 7,4 a uma diluição de 1:2000. </li><li> Etiqueta de 1 mg DISC1 (598-785) com maleimida DyLight 594 (Thermo Scientific, EUA), de acordo com as instruções do fabricante. Em suma, dissolver 1 mg / ml de proteína em PBS pH 7,4 e adicionam-se 5 mM TCEP para recuperar grupos tiol livres. Adicionar 20 ul de corante dissolvido DMF à mistura reaccional e incuba-se durante 2 h à RT. </li><li> Dialisar a proteína de 3 x de PBS pH7,4 a uma razão de 1:2000, durante 2 horas cada. </li></ol> Para aumentar ainda mais a pureza da proteína marcada a sua 6-tag de afinidade baseada purificação sobre uma coluna de Ni-NTA é executada. <ol start="4"><li> Lavar 1 ml de Ni-NTA de matriz (Qiagen, Alemanha) com 10 ml de PBS pH 7,4. </li><li> Aplicar a proteína marcada, dialisado para a coluna e deixá-lo funcionar lentamente ao longo da coluna. </li><li> Lava-se a proteína com 3 x 20 ml de PBS pH 7,4 </li><li> Eluir a proteína com PBS pH 7,4, 500 mM de imidazole, gota a gota enquanto se monitorizava a banda colorida na coluna de Ni-NTA para reduzir o volume de eluato. </li><li> Dialisar o eluato a 3 x 10 mM NaPi pH 7,4 a uma diluição de 1:2000, durante 2 horas cada. </li><li> Use uma seringa estéril 0,45 uM de filtro para filtrar o eluato, alíquota de 5 x 100 uL de amostras de encaixe e congelar em azoto líquido. A quantidade total de proteína deve ser 0,5-1 mg / ml, em cada alíquota de 100 ul. </li></ol> Concentr opcionalção passo <ol start="10"><li> Para injecções de rato stereotactical, a proteína foi concentrada 10 vezes num speed-vac (Concentrador de Eppendorf 5301). A condição de tampão final foi de 100 mM de NaPi. </li></ol> α-sinucleína Labeling A rotulagem e purificação (coluna de Ni-NTA), do recombinante α-sinucleína foi realizada em paralelo com DISC1 (598-785). O total de material de partida foi 500 ug em vez de 1 mg por DISC1 (598-785). 6. Tratamento de destinatário SH-Sy5y Células com rotulada DISC1 recombinante (598-785) Proteína <ol><li> Semente 5x10 4 receptor SH-Sy5y células de neuroblastoma humano constitutivamente expressando GFP-DISC1 (598-854), em lamelas de vidro estéreis em cada poço de uma placa de 24 poços. </li><li> Adicionar proteína marcada para o meio de cultura celular numa concentração de 5-10 ug / ml e incubar durante 48-72 horas. </li><li> Lavar as células 3 x com PBS pH 7,4 e extinguir extracçãofluorescência ellular com 0,04% de azul de tripano durante 5 min. </li><li> Fixar as células com PFA a 4% em PBS, pH 7,4, durante 10 min em gelo, lava-se uma vez com H2O estéril e montar as lamelas sobre lâminas de vidro com prolongar ouro com DAPI meio de montagem (Invitrogen, EUA). </li><li> Confirme a captação / invasão de exógena aplicada proteína recombinante por co-localização com proteínas recrutados expressas por células receptoras no Z-stack imagens geradas por laser microscopia confocal. No entanto, o recrutamento de proteína endógena pode não ser detectada, essencialmente em paralelo com a invasão de proteína da célula hospedeira, Z-stack imagens pode ainda confirmar a natureza invasiva da proteína. </li></ol> No nosso exemplo, rec. DISC1 (598-785) * pelo menos em parte solúvel recrutas GFP-tagged DISC1 (598-854) da proteína expressa pela célula hospedeira (ver Figura 5A). Para recombinante invasão α-sinucleína, mas não o recrutamento é mostrado (Figura 5B). Fotos foram tiradasnum Zeiss LSM 510 confocal ou um microscópio Zeiss Axiovision Apotome2. A injecção do concentrado (ca. 4 ul de 2,5 ug / uL), rotulada DISC1 (598-785) * para os resultados CPFm na difusão da proteína em volta do local de injecção, que pode ser detectada mesmo após a perfusão dos animais com 4% PFA em PBS, pH 7,4, com uma filterset rodamina. No nosso exemplo DISC1 (598-785) é ocupada por um número diferente de neurónios e pode ser monitorizado com Z-stack de imagem (Figura 6). Em geral, a injecção de outras proteínas, em seguida, os usados ​​aqui não conduzem necessariamente a invasão celular. O evento de invasão é essencialmente dependente da natureza da proteína, não obstante uma purificação limpa é um pré-requisito para análise posterior. 7. Resultados representativos Aggresomes recombinante consistindo de DISC1-eGFP FL purificada a partir de células invadidas NLF destinatário SH-Sy5y cells em baixa eficiência (cerca de 0,3 a 5%), como visto por co-localização com microscopia confocal (Figura 3). Como relatado anteriormente, DISC1 (598-785) expressa e purificada a partir de E. coli formadas multímeros 4 foram igualmente célula-invasiva com uma eficiência de aproximadamente 20% 5 (Figura 5A), semelhante ao de α-sinucleína, que foi utilizado em paralelo, como controlo positivo (Figura 5B). Rotulado DISC1 recombinante (598-785) expressa e purificada a partir de E. coli foi também célula-invasivo para neurónios in vivo, quando a proteína multimérica foi estereotaxicamente injectados no córtex pré-frontal de um rato (Figura 6; Pum, Bader, Huston, Korth, não publicado). <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Células de neuroblastoma que expressam transitoriamente NLF FP-DISC1 (vermelho). Red aggresomes fluorescentes pode ser deteCTED dentro das células. <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Purificada MRFP-tagged Disc1 aggresomes após a purificação em gradiente de sacarose. <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Imagem fluorescente de aggresomes invadidas. MRFP-tagged flDISC1 aggresomes foram purificados e incubados com as células de neuroblastoma SH-Sy5y overexpressing solúvel GFP-tagged DISC1 (598-854). Uma absorção de aggresomes rotulados é monitorado por Z-pilha de imagens em um microscópio Laser-Scan (Zeiss LSM 510). <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. SEC-perfil de rec. DISC1 (598-785), contendo o S704 e os C704 polimorfismos de nucleotídeo único (SNP). Ambas as variantes apresentam uma ruptura de oligomerização e ordenou a formação de alto peso molecular multIMers (seta vermelha). Esta imagem é modificada a partir da publicação do Leliveld et al., Bioquímica 2009. <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Imagem Z-stack Fluorescente de invasivo DISC1 DyLight marcado recombinante (598-785). As células de neuroblastoma SH-Sy5y expressando GFP-DISC1 solúvel (598-854) foram incubadas com etiquetado, a proteína recombinante a uma concentração de 5 ug / ml. (A) agregados vermelha mostra a invasão de rec. DISC1 proteína (598-785) e pontos amarelos indicam um recrutamento de GFP-DISC1 solúvel (598-854) em agregados. (B) recombinante α-sinucleína (vermelho) invade as células sem recrutamento, com uma frequência de cerca de 20%. <a href="/files/ftp_upload/4132/4132fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig6.jpg" alt="Figura 6" /> Figura figura 6. Imunofluorescência dea injectado rotulado DISC1, recombinante (598-785) da proteína. Z-stack de imagem confirma a presença de rec. DISC1 proteína (598-785), em neurónios corticais de rato coradas com um anticorpo contra núcleos neuronal (NeuN, verde).

<ol><li>Millar, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+two+novel+genes+by+a+translocation+co-segregating+with+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Disruption of two novel genes by a translocation co-segregating with schizophrenia.</a> Hum. Mol. Genet. 9, 1415-1423 (2000).</li>
<li>St Clair, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+within+a+family+of+a+balanced+autosomal+translocation+with+major+mental+illness%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Association within a family of a balanced autosomal translocation with major mental illness.</a> Lancet. 336, 13-16 (1990).</li>
<li>Leliveld, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insolubility+of+disrupted-in-schizophrenia+1+disrupts+oligomer-dependent+interactions+with+nuclear+distribution+element+1+and+is+associated+with+sporadic+mental+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Insolubility of disrupted-in-schizophrenia 1 disrupts oligomer-dependent interactions with nuclear distribution element 1 and is associated with sporadic mental disease.</a> J. Neurosci. 28, 3839-3845 (2008).</li>
<li>Leliveld, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligomer+assembly+of+the+C-terminal+DISC1+domain+%28640-854%29+is+controlled+by+self-association+motifs+and+disease-associated+polymorphism+S704C%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Oligomer assembly of the C-terminal DISC1 domain (640-854) is controlled by self-association motifs and disease-associated polymorphism S704C.</a> Biochemistry. 48, 7746-7755 (2009).</li>
<li>Ottis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergence+of+two+independent+mental+disease+genes+on+the+protein+level%3A+recruitment+of+dysbindin+to+cell-invasive+disrupted-in-schizophrenia+1+aggresomes%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Convergence of two independent mental disease genes on the protein level: recruitment of dysbindin to cell-invasive disrupted-in-schizophrenia 1 aggresomes.</a> Biol. Psychiatry. 70, 604-610 (2011).</li>
<li>Meyer-Luehmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exogenous+induction+of+cerebral+beta-amyloidogenesis+is+governed+by+agent+and+host%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Exogenous induction of cerebral beta-amyloidogenesis is governed by agent and host.</a> Science. 313, 1781-1784 (2006).</li>
<li>Frost, B., Jacks, R. L., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+of+tau+misfolding+from+the+outside+to+the+inside+of+a+cell%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Propagation of tau misfolding from the outside to the inside of a cell.</a> J. Biol. Chem. 284, 12845-12852 (2009).</li>
<li>Frost, B., Ollesch, J., Wille, H., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+diversity+of+wild-type+Tau+fibrils+specified+by+templated+conformation+change%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Conformational diversity of wild-type Tau fibrils specified by templated conformation change.</a> J. Biol. Chem. 284, 3546-3551 (2009).</li>
<li>Clavaguera, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+and+spreading+of+tauopathy+in+transgenic+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Transmission and spreading of tauopathy in transgenic mouse brain.</a> Nat. Cell Biol. 11, 909-913 (2009).</li>
<li>Desplats, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inclusion+formation+and+neuronal+cell+death+through+neuron-to-neuron+transmission+of+alpha-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Inclusion formation and neuronal cell death through neuron-to-neuron transmission of alpha-synuclein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 13010-13015 (2009).</li>
<li>Ren, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+penetration+and+persistent+infection+of+mammalian+cells+by+polyglutamine+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic penetration and persistent infection of mammalian cells by polyglutamine aggregates.</a> Nat. Cell Biol. 11, 219-225 (2009).</li>
<li>Munch, C., O'Brien, J., Bertolotti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-like+propagation+of+mutant+superoxide+dismutase-1+misfolding+in+neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Prion-like propagation of mutant superoxide dismutase-1 misfolding in neuronal cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 3548-3553 (2011).</li>
<li>Iwatsubo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+Lewy+bodies+from+the+brains+of+patients+with+diffuse+Lewy+body+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of Lewy bodies from the brains of patients with diffuse Lewy body disease.</a> Am. J. Pathol. 148, 1517-1529 (1996).</li>
<li>Meriin, A. B., Wang, Y., Sherman, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+aggresomes+and+other+large+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of aggresomes and other large aggregates.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 3, 1-9 (2010).</li>
<li>Korth, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DISCopathies%3A+brain+disorders+related+to+dysfunctional+DISC1%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">DISCopathies: brain disorders related to dysfunctional DISC1.</a> Rev. Neurosci. 20, 321-330 (2009).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Neste estudo, descrevemos a purificação de mRFP/eGFP-DISC1 aggresomes a partir de uma linha celular transfectada neuroblastoma, a preparação e marcação de uma espécie de proteínas recombinantes Disc1 e sua aplicação na célula-invasão de células receptoras experiências in vitro e in vivo. A purificação dos nativos mRFP/eGFP-DISC1 aggresomes foi desenvolvido a partir de protocolos para isolar o corpo de Lewy estruturas semelhantes e agregados maiores 13, 14, mas modificada para evitar a utilização de detergentes e de minimizar o risco de falso positivo invasão celular, que pode ocorrer devido ao detergente facilitada a penetração da membrana. Uma melhoria possível futuro poderia ser o de aumentar ainda mais o grau de pureza dos aggresomes por sonicação para separar completamente as membranas remanescentes e do citoesqueleto dos aggresomes. Ao aumentar a pureza total, o número de eventos de invasão totais do registado para grande aggresomes may ser aumentado 5. Se a definição limitada do nosso sugerido sacarose de 3 fases seja suficiente para aggresomes de espécies outra proteína deve ser testado, neste sentido, o protocolo descrito aqui deve ser considerada como um ponto de partida para a optimização individual. Os aggresomes purificados provaram ser bastante robusta nas nossas mãos, os passos de lavagem adicionais (sem detergente) para eliminar vestígios de sacarose não reduzem significativamente o rendimento global. Numa publicação anterior, descrevemos que a montagem de oligómero de DISC1 é dependente de multimerização domínios distintos na extremidade C-4 (Figura 4). Nós escolhemos este fragmento de expressão recombinante solúvel em E. coli e subsequentes e Ni-NTA purificação. Para controlar a sua multimerização e para comparar a sua capacidade de invasão das células com uma proteína de célula descrita invasivo como α-sinucleína, que rotulado DISC1 (598-785) com o corante fluorescente DyLight594, e sua comparaçãoinvasividade de células-com a do igualmente marcado α-sinucleína. A célula de capacidade de invasão do fragmento DISC1 recombinante foi dramaticamente aumentada em comparação com a de comprimento, nativa total Disc1 aggresomes, provavelmente devido ao seu menor tamanho e pureza muito mais elevada. Mais uma vez, a pureza parece desempenhar um papel decisivo na célula invasão. Em nosso exemplo, os aggresomes invasivos recrutados proteína solúvel homólogo da linha de células alvo de forma recombinante, que foi expressa num solúvel, forma celular disperso ie. A expressão de uma proteína fluorescente (por exemplo, GFP ou RFP) na linha de célula receptora é uma vantagem uma vez que permite a co-localização de aggresomes invasivos e proteínas recombinantes dentro do limite da célula receptora através de Z-stack de imagem. Aggresomes células invasivas Disc1 e fragmentos multiméricas expressas e purificadas a partir de E. coli pode ser uma característica definidora de uma proteína de conformação doenças relacionadas com DISC1, DISC1opathies 15. Resolução de problemas: Rendimento aggresome baixo após purificação em gradiente de sacarose: O gradiente de sacarose apresentou neste protocolo funciona bem com eGFP/mRFP-DISC1 (FL) aggresomes. Aggresomes consistindo de outras proteínas podem ser de dimensões variáveis, por conseguinte, as concentrações de sacarose deve ser optimizada por outros utilizadores. Purificação insuficiente de proteínas recombinantes: Quaisquer contaminantes bacterianos no processo de purificação da proteína recombinante também será rotulada em passos posteriores do protocolo. Para evitar a contaminação, executar a proteína em um SDS-PAGE e confirmar que a proteína recombinante é de pelo menos 95% de pureza por coloração com Coomassie-Blue. Para assegurar a mais alta qualidade e rendimento, o protocolo tem de ser otimizado para cada proteína individual. Baixa rotulagem efência de proteínas recombinantes: Quaisquer contaminações que contêm grupos SH livres irá diminuir rotulagem eficiente da proteína. Por conseguinte, a diálise extensa e Ni-NTA de purificação baseado é obrigatório.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 11875-093 </td><td> Médio é dependente da linha celular hospedeira. A linha celular óptima destinatário deve ser determinada pelo utilizador. </td></tr><tr><td> DMEM/F-12 </td><td> Invitrogen </td><td> 11320-033 </td><td> Médio é dependente da linha celular do destinatário. A linha celular óptima destinatário deve ser determinada pelo utilizador. </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190-250 </td><td></td></tr><tr><td> Metafectene </td><td> Biontex </td><td> T020-1.0 </td><td> Outros reagentes de transfecção pode funcionar tão bem, mas não foram testadas com nosso protocolo. </td></tr><tr><td> Ni-NTA agarose </td><td> Qiagen </td><td> 30210 &lt;/ Td&gt; <td> Os experimentos foram realizados com Ni_NTA agarose da Qiagen, outros fornecedores devem funcionar tão bem. </td></tr><tr><td> DNase I </td><td> Roche </td><td> 04716728001 </td><td> Não há necessidade de uma RNase livre de DNase no processo de purificação aggresomes. </td></tr><tr><td> Sacarose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S0389 </td><td></td></tr><tr><td> Opti-MEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31985-062 </td><td> Meio isento de soro funciona tão bem </td></tr><tr><td> Penicilina / estreptomicina </td><td> Invitrogen </td><td> 15140122 </td><td> Suplemento SH-Sy5y e médio NLF </td></tr><tr><td> Não essencial-amino-ácidos (NEAA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M7145 </td><td> Suplemento SH-Sy5y médio </td></tr><tr><td> Trypan Blue 0,4% </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T8154 </td><td> Reagente tóxico </td></tr><tr><td> DyLight 594 Maleimide </td><td> Thermo Fisher Scientific- </td><td> 46608 </td><td> Reduzido corante reactivo de cisteína para formar ligações tioéter estáveis. Também disponível em outras cores. </td></tr><tr><td> Prolongar ouro com DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> P36935 </td><td> Esta montagem líquido Antifade deu resultados superiores em nossas mãos. </td></tr><tr><td> Cocktail inibidor da protease; </td><td> Roche </td><td> 11873580001 </td><td> Dissolve-se 1 em 500 ul de tabela H 2 O para solução 100X. </td></tr><tr><td> Sintética a-sinucleína </td><td> Sigma </td><td> S7820 </td><td> Redobragem tal como descrito no texto. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabela de reagentes específicos. </td></tr><tr><td> Precellys 24 </td><td> Bertin Technologies </td><td> 03119.200.RD000 </td><td> Nós não testamos homo mecânico outronizers outros do que isso. Outros detergente método de homogeneização livre pode funcionar tão bem, mas não foram testados para esse protocolo. </td></tr><tr><td> 5301 Concentrador (SpeedVac) </td><td> Eppendorf </td><td> 5301 000.210 </td><td> Apenas necessária se a proteína tem de ser concentrado. </td></tr><tr><td> LSM 510 e Axiovision Apotome2 </td><td> Zeiss </td><td> Veja o catálogo fabricantes </td><td> Os dois microscópios abrigar a capacidade de executar Z-stack imagens. Este é um pré-requisito para a avaliação sólido e grave de eventos de invasão. </td></tr><tr><td> Célula de material plástico de cultura </td><td> Nunc </td><td> Placas de 10 cm # 172958, placas de 24 poços # 142475 </td><td> O uso de material plástico diferente pode influenciar a interacção de proteínas recombinantes ou aggresomes e as superfícies de plástico. Nós não testamos outros materiais que não os descritos aqui. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabela de material específico e equipamentos. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> Número </td><td> Nome tampão </td><td> conteúdo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> 1. </td><td> Meio de crescimento bacteriano </td><td> 16 g / l de Bacto triptona 10 g / l de extracto de levedura Bacto, 5 g / l de NaCl, 5 mM-arginina-HCl, 5 mM de MgSO4, 100 mg / ml carbencillin, 35 ug / ml de cloranfenicol </td><td> Crescer as bactérias a OD 600: 0,6-0,8 induzir a expressão com IPTG 1 mM. </td></tr><tr><td> 2. </td><td> Tampão de ressuspensão bacteriana </td><td> 50 mM TRIS-HCl pH 8,0, 5 mM EDTA, 2 mM de PMSF, 1% de TX-100, 250 ug / ml de lisozima, 20 mM de MgCl2 e 400 ml de ADNase I U/50 </td><td> Resuspender sedimento bacteriano a partir de 1 L overnight cultura em 50 ml de tampão de ressuspensão. </td></tr><tr><td> 3. </td><td> Tampão de extracção de proteínas </td><td> 50 mM Tris pH 8,0, 5 mM de imidazole, 500 mM NaCl, ureia 8 M e 10 mM b-ME </td><td></td></tr><tr><td> 4. </td><td> Ni-NTA de coluna de tampão de lavagem </td><td> 50 mM Tris pH 8,0, 5 mM de imidazole, 500 mM NaCl, ureia 8 M e 10 mM b-ME, 12 mM de imidazole </td><td> Tampão de extracção modificado com imidazole 12 mM adicionado. </td></tr><tr><td> 5. </td><td> Ni-NTA de tampão de eluição em coluna </td><td> 50 mM Tris, 500 mM NaCl, 300 mM de imidazole, 8 M de ureia, 1 mM PMSF, 5 mM de EDTA e 10 mM b-ME </td><td> O tampão de eluição contém 10 mM b-ME, o qual é depois dialisada. </td></tr><tr><td> 6. </td><td> PBS </td><td> 8 g / l de NaCl, 0,2 g / l de KCl, 1,44 g / l de Na 2 HPO 4, 0,24 g / l KH 2 PO 4, ajustar a pH 7,4 </td><td></td></tr><tr><td>7. </td><td> Rotulagem tampão </td><td> PBS contendo 5 mM TCEP </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Tabela de receitas. </td></tr></tbody></table></td></tr></tbody></table>

geração, purificação, caracterização e de cell-invasivos espécies de proteína disc1

Generation, Purification, and Characterization of Cell-invasive DISC1 Protein Species

Agregação de proteínas é visto como uma característica geral de crónicas, doenças cerebrais degenerativas, como, por exemplo, nas doenças neurodegenerativas doença de Alzheimer (Ap, tau), a doença de Parkinson (α-sinucleína), doença de Huntington (poliglutamina, huntingtina), e outros. Agregação de proteínas é pensado para ocorrer devido a proteostasis perturbado, ou seja, o desequilíbrio entre o surgimento e degradação de proteínas deformadas. É de notar que as mesmas proteínas são encontradas em formas agregadas esporádicos destas doenças, que são mutantes em variantes raros de formas familiares. A esquizofrenia é uma doença cerebral progressiva crónica que, em muitos casos vai junto com um défice cognitivo permanente e irreversível. Numa abordagem de gene candidato, foi investigado se Disrupted-in-1 esquizofrenia (DISC1), um gene clonado de uma família escocesa com ligação à doença mental crónica 1, 2, podem ser encontrados na forma de agregados insolúveis no brain de casos esporádicos de esquizofrenia 3. Usando o CC SMRI, identificou em aproximadamente 20% dos casos com CMD mas não controlos normais ou pacientes com doenças neurodegenerativas imunorreactividade DISC1 sarcosil insolúvel após fraccionamento bioquímico. Estudos posteriores, in vitro revelaram que a propensão a agregação de DISC1 foi influenciado pela doença associada à polimorfismo S704C 4, e que Disc1 aggresomes gerados in vitro de células-invasiva foram 5, semelhante ao que tinha sido mostrado para Ap 6, tau 7-9, α -sinucleína 10, polyglutamine 11, ou SOD1 agregados 12. Estas constatações levaram-nos a propor que pelo menos um subconjunto de casos de CMD, aqueles com DISC1 agregado podem ser doenças conformacionais da proteína. Aqui descrevemos como gerar Disc1 aggresomes em células de mamíferos, purificá-los em um gradiente de sacarose e usá-los para invasão de células-studies. Da mesma forma, nós descrevemos como gerar um exclusivamente multimérica C-terminal DISC1 fragmento de etiqueta, e purificá-la para estudos invasividade celular. Usando os multímeros recombinantes de DISC1 conseguimos invasividade celular semelhante como para um fragmento marcado de forma semelhante α-sinucleína sintético. Além disso, mostramos que este fragmento é absorvido in vivo, quando injectados estereotaxicamente no cérebro de animais receptores.

A geração de purificação, e invasão de células citoplasmáticos intracelulares, a todo o comprimento aggresomes Disc1 proteínas a partir de culturas de células e de um fragmento de proteína marcada, multimérica recombinante em DISC1<em&gt; E. coli</em&gt; São descritos. Invasividade celular é mostrado para células receptoras em cultura de células e para os neurónios<em&gt; In vivo</em&gt; Após a inoculação cérebro stereotactical.

Geração, purificação, caracterização e de Cell-invasivos espécies de proteína Disc1

A agregação proteica é vista como uma característica geral de condições cerebrais degenerativas crônicas, como, por exemplo, nas doenças neurodegenerativas Alzheimer (Aβ, tau), Parkinson (α-sinucleína), Huntington (poliglutamina, huntingtina), entre outras. Considera-se que a agregação proteica ocorra devido ao distúrbio da proteostase, ou seja, ao desequilíbrio entre a síntese e a degradação de proteínas mal dobradas. Vale notar que as mesmas proteínas são encontradas agregadas em formas esporádicas dessas doenças que são mutantes em variantes raras de formas familiares. A esquizofrenia é uma condição cerebral progressiva crônica que, em muitos casos, vem acompanhada de um déficit cognitivo permanente e irreversível. Por meio de uma abordagem de gene candidato, investigamos se a proteína Disrupted-in-schizophrenia 1 (DISC1), um gene clonado em uma família escocesa com ligação a doenças mentais crônicas1, 2, poderia ser encontrada como agregados insolúveis no cérebro de casos esporádicos de esquizofrenia3. Utilizando o SMRI CC, identificamos em aproximadamente 20% dos casos com CMD, mas não em controles normais ou pacientes com doenças neurodegenerativas, a imunorreatividade de DISC1 insolúvel em sarkosyl após fracionamento bioquímico. Estudos subsequentes in vitro revelaram que a propensão à agregação da DISC1 era influenciada pelo polimorfismo S704C associado à doença4, e que os aggresomos de DISC1 gerados in vitro eram invasivos celulares5, semelhante ao que havia sido demonstrado para agregados de Aβ6, tau7-9, α-sinucleína10, poliglutamina11 ou SOD112. Essas descobertas nos levaram a propor que pelo menos um subgrupo de casos com CMD, aqueles com DISC1 agregada, poderiam ser distúrbios conformacionais proteicos. Aqui descrevemos como geramos aggresomos de DISC1 em células de mamíferos, purificamo-los em um gradiente de sacarose e os utilizamos para estudos de invasividade celular. Da mesma forma, descrevemos como geramos um fragmento C-terminal de DISC1 exclusivamente multimérico, marcamo-lo e purificamo-lo para estudos de invasividade celular. Utilizando os multímeros recombinantes de DISC1, alcançamos uma invasividade celular semelhante à de um fragmento sintético de α-sinucleína marcado de forma análoga. Também mostramos que este fragmento é absorvido in vivo quando injetado estereotacticamente no cérebro de animais receptores.

O objetivo geral dos procedimentos a seguir é gerar discos purificados. Um agregado capaz de invadir células receptoras. Dois métodos diferentes para alcançar esse objetivo serão demonstrados com o primeiro método.A proteína fluorescente disc uma fusão formadora de asomo é superexpressa em células doadoras de neuroblastoma humano NLF. As células são então lavadas com PBS, coletadas e lisadas sem o uso de detergentes. O DNA é digerido e as zonas de agregação são purificadas utilizando um sistema de gradiente de sacarose.Agrios purificados por este método apresentam baixa eficiência de invasão celular. A abordagem alternativa consiste em superexpressar os aminoácidos 598 a 785 da proteína disc recombinante em *E. coli*. O fragmento proteico é então marcado com DITE 594, diálise é realizada e a purificação é efetuada utilizando uma matriz NI-NTA, que remove qualquer corante não ligado remanescente e disc multimérico.Os fragmentos gerados por este método apresentam alta eficiência de invasão celular para avaliar a invasão de células hospedeiras. Pode-se utilizar o disco purificado de proteína fluorescente, os risossomos ou o disco recombinante marcado. Os fragmentos são incubados com as células receptoras de interesse.O azul de trian é então adicionado para extinguir a fluorescência extracelular e a invasão é visualizada por microscopia confocal. Até agora, a agregação proteica não foi reconhecida como uma característica das doenças mentais crônicas, como a esquizofrenia. Onde a proteína um interrompida na esquizofrenia é um candidato à invasividade celular, os agregados proteicos são uma característica marcante das doenças por desdobramento proteico.Aqui demonstramos com dois métodos que agregados da proteína disc um são invasivos para as células e, portanto, que distúrbios relacionados ao disc um ou neuropatias associadas ao disc um são doenças conformacionais de proteínas. Os dois métodos são, em primeiro lugar, a purificação do disc completo, um ASOS, de linhagens celulares de neuroblastoma e, em segundo lugar, a expressão de um fragmento multimérico do disco um na extremidade C em *E. coli*, bem como a purificação e marcação com o corante fluorescente.Embora o primeiro método resulte apenas em uma baixa eficiência de invasão celular de cerca de 0,3% das células que incorporam os microsomas purificados, o fragmento proteico recombinante puro infecta até 20% das células expostas. Os métodos descritos aqui devem ser transferíveis para outras proteínas nas quais a formação do acrossoma ou a montagem multimérica tenham sido convincentemente demonstradas. Em cada um dos 10 pratos de 10 centímetros.Plante 1,5 vezes 10 elevado a seis células de neuroblastoma humano e células LF em meio RPMI 1640 suplementado e cultive durante a noite. No dia seguinte, as células devem estar de 70 a 80% confluentes. Rotule cinco placas para transfeção com PC DNA 3.1 MRFP e disc humano completo marcado com EGFP e cinco para transfeção com plasmídeo EGFP isoladamente. Para cada placa de 10 centímetros, combine 15 microgramas de DNA plasmidial, 30 microlitros de metafectina e 750 microlitros.Opti MEM em um tubo de microcentrífuga e prepara pipetando para cima e para baixo, incuba à temperatura ambiente por 20 minutos. Em seguida, para transfectar as células, adiciona-se gota a gota a solução do reagente de transfeção de DNA às células, incubando-as a 37 graus Celsius com 5% de CO₂. Após 48 horas da transfeção, monitora-se a expressão da proteína fluorescente vermelha (MRFP) completa do disco um e confirma-se a formação de zonas de agregação em microscópio de fluorescência. Algumas células abrigam inclusões maciças de proteína fluorescente, conforme mostrado aqui.Este protocolo combina um método para purificar corpos de Lewy a partir de tecido cerebral e o protocolo para isolar agregados maiores ou zonas de agregação, já que os métodos já existentes baseiam-se no uso de detergentes; por isso, o isolamento de proteínas livres de detergentes para aplicação em ensaios de invasividade celular é essencial. Em seguida, aspire o meio e lave com PBS, adicionando 400 microlitros de PBS contendo coquetel de inibidores de protease. Depois, raspe as células e adicione um mililitro de suspensão celular e 10 esferas cerâmicas a um tubo de lise de dois mililitros.Lise as células usando três pulsos de 62º em um homogeneizador pre-cell lyse 24. A força mecânica do processo pode aumentar a temperatura dentro da amostra acima de 37 graus Celsius. Portanto, deve-se tomar cuidado para resfriar a amostra em gelo. Após o procedimento de lise, depois de resfriar as células em gelo, adicione cloreto de magnésio 10 milimolar e 40 unidades por mililitro de DNAA e incube por 60 minutos a 37 graus Celsius com agitação.Prepare 10 mililitros de cada solução de sacarose a 80%, 50% e 20% (peso por volume) em PBS. Em seguida, em um tubo cônico de 15 mililitros, prepare o gradiente de sacarose começando com dois mililitros de sacarose a 80%, seguidos por dois mililitros de sacarose a 50% e dois mililitros de sacarose a 20%. Despeje o gradiente lentamente e tenha cuidado para não perturbar as camadas já adicionadas.Em seguida, sobreponha o lisado digerido sobre o gradiente e centrifugue por 15 minutos a 1000 vezes G a quatro graus Celsius. Com a quebra, colete cuidadosamente a interface entre as camadas de sacarose de 50 a 80% com uma pipeta e misture com cinco volumes em um tubo cônico de 15 mililitros; centrifugue por 15 minutos a 1000 vezes G a quatro graus Celsius. Remova cuidadosamente o sobrenadante e mantenha a zona opaca contendo o pellet.Repita a lavagem mais duas vezes nesta interface. As agrizonas são fluorescentes e podem ser visualizadas ao microscópio sob luz ultravioleta após a última lavagem; descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 250 a 500 microlitros de PBS. Este pellet contém as agrizonas purificadas.Adicione 10 microlitros da suspensão de disco MRFP a cada poço de uma placa de 24 poços contendo células de neuroblastoma humano SHSY-5Y. Expresse constitutivamente GFP solúvel no disco um na extremidade C sobre lamínulas de vidro estéreis e incube por 48 a 72 horas após a incubação. Lave as células três vezes com PBS e quenche a fluorescência extracelular com azul de trian a 0,04% por cinco minutos.Em seguida, lave com PBS para remover o azul de trian. A seguir, coloque a placa sobre gelo e adicione PFA a 4% em PBS por 10 minutos para fixar as células. Depois, lave uma vez com água estéril e monte as lamínulas em lâminas de vidro com meio de montagem prolongado dourado com DPI.Confirme a captação na invasão de forma exógena. Aplique zonas de agressão por meio da colocalização com proteínas recrutadas expressas por células receptoras em imagens Zack. Este Zack abrange aproximadamente seis micrômetros de profundidade.24 imagens capturadas em intervalos de 200 nanômetros. A fluorescência do disco MRFP em uma zona agri mostrada em vermelho recruta o disco GFPC terminal citosólico. Um fragmento mostrado em verde apresenta colocalização em amarelo, indicando que as zonas agri entraram no citosol do receptor e recrutaram a proteína do disco um anteriormente solúvel.Nesta parte do protocolo, o disco humano um será marcado com DITE 5 94. Este D permite o monitoramento direto da proteína recombinante sem a necessidade de coloração imunoadicional. Comece liberando a proteína preparada conforme descrito no documento anexo do beta-mercaptoetanol, realizando três diálises em dois litros de PBS em uma diluição de um para 2000.A seguir, rotule um disco de um miligrama com DITE 5 94 IDE, dissolva um miligrama por mililitro de proteína em PBS e adicione TCEP a cinco milimolares para recuperar grupos SH livres; adicione 20 microlitros do corante dissolvido em DMF à reação e incube por duas horas à temperatura ambiente. Utilizando uma cassete de diálise SLI com limite de peso molecular de 10.000 daltons, realize a diálise da proteína três vezes em PBS numa proporção de 1 para 2000, durante duas horas a cada vez. A seguir, para aumentar ainda mais a pureza da proteína marcada.Realiza-se uma purificação por afinidade baseada em marcação com etiqueta hiss em uma coluna de NI NTA. Lave um mililitro de matriz de NI NTA com 10 mililitros de PBS, em seguida, aplique a proteína dialisada marcada à coluna e deixe-a passar pela coluna.Lentamente, a solução perderá parte de sua cor azul devido à ligação da proteína à matriz NTA; o corante livre não marcado permanecerá no fluxo que passa. Uma vez que a solução proteica tenha passado pela coluna, lave a coluna três vezes com 20 mililitros de PBS para eluir a proteína e adicione dois mililitros de PBS contendo 500 milimolares de ole à coluna.Regule a válvula para baixa velocidade e elua gota a gota, monitorando a banda colorida na coluna N NI NTA. Para ser referida, esta fração colorida do eluato contém uma proteína recombinante marcada; transfira o EIT para um cassete de diálise SLI e realize diálise do EIT três vezes contra 10 milimolares de NAPI, com diluição de 1 para 2000, durante duas horas cada, em dois litros. Após a diálise, empurre o EIT através de um filtro estéril de seringa de 0,45 micrômetros, em seguida alíquota em cinco amostras de 100 microlitros e congele rapidamente em nitrogênio líquido.A quantidade total de proteína deve ser de 0,5 a um micrograma por mililitro em cada alíquota de 100 microlitros. Para avaliar a invasividade da proteína, adicione meio contendo cinco a dez microgramas por mililitro da proteína disc um recombinante marcada a cada poço de uma placa de 24 poços contendo células de neuroblastoma humano SH-SY5Y receptoras, expressando constitutivamente a etiqueta GFP solúvel na extremidade C-terminal de disc um, sobre lamínulas de vidro estéreis, e incube por 48 a 72 horas.Quenche a fluorescência extracelular, fixe e monte as células como feito para as células tratadas com a zona agri, confirmando a invasão da proteína recombinante aplicada exogenamente por meio da imagem Zack. Quando a proteína marcada é internalizada, ela é detectada dentro do perímetro das células receptoras nas imagens geradas por microscopia confocal. Este Zack abrange aproximadamente cinco micrômetros de profundidade em 24 etapas de 220 nanômetros.Aqui, o fragmento recombinante do disco um, de 5 98 a 7 85, mostrado em vermelho, é incorporado por células receptoras que expressam a forma solúvel do disco um, marcada com GFP na extremidade C, mostrada em verde, para determinar a invasividade do disco um. Agregados proteicos de disco um completo marcados com MRFP, denominados zonas agro, foram purificados de células NLF e aplicados a células SH-SY5Y receptoras conforme descrito nesta foto, conforme mostrado aqui. O disco um marcado com A-M-R-F-P no acrossoma invadiu uma célula de neuroblastoma humano SH-SY5Y que expressa a forma solúvel do disco um marcada com GFP na extremidade C.Além disso, o disco um asomo marcado com MRFP foi capaz de recrutar o disco um marcado com GFP solúvel em agregados insolúveis para determinar a invasividade. O disco um recombinante marcado com luz DIA foi aplicado a células de neuroblastoma SH-SY5Y que expressam disco um GFP solúvel, conforme mostrado aqui. A proteína recombinante disco um, mostrada em vermelho, invadiu a célula receptora; pontos amarelos indicam o recrutamento do disco um C-terminal marcado com GFP solúvel em agregados. O disco um recombinante expressado e purificado de E. coli também demonstrou ser invasivo às células em neurônios in vivo, quando a proteína multimérica foi injetada estereotaxicamente na córtex pré-frontal medial de uma rata. A imagem de Zack confirma a presença da proteína recombinante disco um em neurônios corticais de rato, corados com um anticorpo contra núcleos neuronais.Acabamos de mostrar a você dois métodos para gerar agregados da disc one para o estudo da invasão celular. Utilizando qualquer um desses métodos, podemos investigar os efeitos celulares da captação de agregados da disc one sem as variáveis potencialmente confundidoras da expressão gênica recombinante por transfeção de DNA estranho. Essas técnicas podem ser aplicadas para investigar os efeitos biológicos da patologia proteica da disc one in vitro em células, e in vivo por inoculação intracerebral ou outra administração em modelos animais.Estamos confiantes de que essas técnicas também poderão ser transferidas para outros agregados proteicos eventualmente, com pequenas modificações no protocolo adotado para cada proteína específica. Ao realizar este procedimento, certifique-se de dedicar tempo para uma análise cuidadosa das imagens de microscopia confocal.

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Descrevemos uma abordagem para detectar e capturar subpopulações celulares invasivas em tempo real. O projeto experimental utiliza a Análise Celular em Tempo Real monitorando mudanças na impedância elétrica das células. Podem ser capturados câncer invasivo, células endoteliais ou estromais em tecidos complexos, e o impacto das co-culturas pode ser avaliado.

Detecção e Captura em Tempo Real de Subpopulações celulares invasoras de co-culturas

Aprenda a gerar e purificar agregados de proteína DISC1 capazes de invadir células receptoras usando duas metodologias distintas. Este protocolo demonstra a invasão celular em culturas de neuroblastoma e em neurônios in vivo.

Geração, purificação, caracterização e de Cell-invasivos espécies de proteína Disc1

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