Name: High-throughput screening para pequenas moléculas Moduladores de canais de potássio Interiores retificador (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Aprenda a desenvolver um ensaio de fluorescência quantitativo para medir a atividade de canais de potássio retificadores internos (Kir) em células HK293. Este método permite triagem de alta vazão para descobrir novos moduladores de canais iônicos com potencial terapêutico.

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Este trabalho foi suportado por financiamento do Instituto Nacional de Saúde concede 1R21NS073097-01 e 1R01DK082884 (JSD) e Fundação para o National Institutes concessão PIER11VCTR.

<ol><li>Ehrlich, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inward+rectifier+potassium+currents+as+a+target+for+atrial+fibrillation+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cardiovasc.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Inward rectifier potassium currents as a target for atrial fibrillation therapy.</a> J. Cardiovasc. Pharmacol. 52 (2), 129(2008).</li>
<li>Bhave, G., Lonergan, D., Chauder, B. A., Denton, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+modulators+of+inward+rectifier+K%2B+channels%3A+recent+advances+and+future+possibilities%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Small-molecule modulators of inward rectifier K+ channels: recent advances and future possibilities.</a> Future Med. Chem. 2 (5), 757(2010).</li>
<li>Swartz, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tarantula+toxins+interacting+with+voltage+sensors+in+potassium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicon%22%5BJournal%5D)">Tarantula toxins interacting with voltage sensors in potassium channels.</a> Toxicon. 49 (2), 213(2007).</li>
<li>Jin, W., Lu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+high-affinity+inhibitor+for+inward-rectifier+K%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A novel high-affinity inhibitor for inward-rectifier K+ channels.</a> Biochemistry. 37 (38), 13291(1998).</li>
<li>Jin, W., Lu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+a+stable+form+of+tertiapin%3A+a+high-affinity+inhibitor+for+inward-rectifier+K%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Synthesis of a stable form of tertiapin: a high-affinity inhibitor for inward-rectifier K+ channels.</a> Biochemistry. 38 (43), 14286(1999).</li>
<li>Roy, A., McDonald, P. R., Sittampalam, S., Chaguturu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+access+high+throughput+drug+discovery+in+the+public+domain%3A+a+Mount+Everest+in+the+making%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Pharm.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Open access high throughput drug discovery in the public domain: a Mount Everest in the making.</a> Curr. Pharm. Biotechnol. 11 (7), 764(2010).</li>
<li>Weaver, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thallium-sensitive%2C+fluorescence-based+assay+for+detecting+and+characterizing+potassium+channel+modulators+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">A thallium-sensitive, fluorescence-based assay for detecting and characterizing potassium channel modulators in mammalian cells.</a> J. Biomol. Screen. 9 (8), 671(2004).</li>
<li>Lewis, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+reveals+a+small-molecule+inhibitor+of+the+renal+outer+medullary+potassium+channel+and%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening reveals a small-molecule inhibitor of the renal outer medullary potassium channel and.</a> 76 (5), 1094(2009).</li>
<li>Bhave, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+selective+small-molecule+inhibitor+of+Kir1.1%2C+the+renal+outer+medullary+potassium+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Development of a selective small-molecule inhibitor of Kir1.1, the renal outer medullary potassium channel.</a> Mol. Pharmacol. 79 (1), 42(2011).</li>
<li>Raphemot, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery%2C+characterization%2C+and+structure-activity+relationships+of+an+inhibitor+of+inward+rectifier+potassium+%28Kir%29+channels+with+preference+for+Kir2.3%2C+Kir3.x%2C+and+Kir7.1%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Discovery, characterization, and structure-activity relationships of an inhibitor of inward rectifier potassium (Kir) channels with preference for Kir2.3, Kir3.x, and Kir7.1.</a> Front Pharmacol. 2, 75(2012).</li>
<li>Niswender, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+assay+of+Gi%2Fo-linked+G+protein-coupled+receptor+coupling+to+potassium+channels+provides+new+insights+into+the+pharmacology+of+the+group+III+metabotropic+glutamate+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">A novel assay of Gi/o-linked G protein-coupled receptor coupling to potassium channels provides new insights into the pharmacology of the group III metabotropic glutamate receptors.</a> Mol. Pharmacol. 73 (4), 1213(2008).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Tratamento de dados: Uma vez que os dados são recolhidos, um passo comum na análise envolve a normalizar resposta da fluorescência de cada poço, F, ao seu valor inicial no início da experiência, F 0. Isto é vulgarmente referido como o &quot;índice estático&quot; e simbolizado &quot;F / F 0&quot;. Nos casos em que F 0 é dominado pelo corante indicador de operação estática proporção substancialmente corrigir por muitos factores tais como desuniformidades em ilum...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/4209/high-throughput-screening-for-small-molecule-modulators-inward">High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels</a>. The Protocol section has been updated.
The formula in step 7.1 of the Protocol has been updated from:
Z prime = 1- (3SDp + 3SDn)/|meanp + meann |
to:
Z prime = 1- (3SDp + 3SDn)/|meanp - meann |

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/4209/high-throughput-screening-for-small-molecule-modulators-inward">High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels</a>. The Protocol section has been updated.

Erratum: High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> pcDNA5/TO </td><td> Invitrogen </td><td> V1033-20 </td><td> Tetraciclina-vector de expressão indutível </td></tr><tr><td> T-rex-células HEK293 </td><td> Invitrogen </td><td> R71007 </td><td> Tetraciclina induzível por linha celular </td></tr><tr><td> Lipofectamine Reagente LTX / Plus </td><td> Invitrogen </td><td> 15338100 </td><td> Reagente de transfecção </td></tr><tr><td> FBS </td><td> ATLANTA Biologicals </td><td> S11550 </td><td> Meios de cultura de células </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11965 </td><td> Meios de cultura de células </td></tr><tr><td> Higromicina B </td><td> Invitrogen </td><td> 10687-010 </td><td> Meios de cultura de células </td></tr><tr><td> Blasticidina S </td><td> Invitrogen </td&gt; <td> R210-01 </td><td> Meios de cultura de células </td></tr><tr><td> Penicilina / estreptomicina </td><td> Invitrogen </td><td> 15140 </td><td> Meios de cultura de células </td></tr><tr><td> HBSS-bivalente livre </td><td> Mediatech </td><td> 21022CV </td><td> Lavagem de células </td></tr><tr><td> Tripsina 0,25% </td><td> Mediatech </td><td> 25053CI </td><td> Dissociação celular </td></tr><tr><td> Tetraciclina-HCl </td><td> Sigma </td><td> T9823 </td><td> Reagente indução </td></tr><tr><td> FBS dialisado </td><td> ATLANTA Biologicals </td><td> S12650 </td><td> Meios seletivos </td></tr><tr><td> FluoZin-2 </td><td> Invitrogen </td><td> F24189 </td><td> Corante fluorescente </td></tr><tr><td> Pluronic F-127 </td><td> Invitrogen </td><td> P-3000MP </td><td> Corante de carga </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Invitrogen </td><td> 14175 </td><td> Tampão de ensaio </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Invitrogen </td><td> 15630 </td><td> Tampão de ensaio </td></tr><tr><td> NaHCO3 </td><td> Sigma </td><td> S6297 </td><td> Tl + estímulo tampão </td></tr><tr><td> MgSO4 </td><td> Sigma </td><td> M2643 </td><td> Tl + estímulo tampão </td></tr><tr><td> CaSO 4 • 2H 2 O </td><td> Sigma </td><td> C3771 </td><td> Tl + estímulo tampão </td></tr><tr><td> D-Glucose </td><td> Sigma </td><td> G7528 </td><td> Tl + estímulo tampão </td></tr><tr><td> Sulfato de tálio </td><td> Aldrich </td><td> 204625 </td><td> Tl + estímulo tampão </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma </td><td> H4034 </td><td> Tl + estímulo tampão </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Sigma </td><td> D4540 </td><td> Solvente </td></tr><tr><td> Oito canais pipetador eletrônico </td><td> Biohit </td><td> E300 </td><td> Chapeamento de celular em 384 -placas de poços </td></tr><tr><td> BD PureCoat amina revestidos 384 poços </td><td> BD Biosciences </td><td> 356719 </td><td> Microplacas de ensaio </td></tr><tr><td> Eco qualificados 384-Bem polipropileno microplaca (384PP) </td><td> Labcyte </td><td> P-05525 </td><td> Fonte microplacas compostos </td></tr><tr><td> 384-poços de microplacas de polipropileno </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 781280 </td><td></td></tr><tr><td> Dispensador de reagente Multidrop Combi </td><td> Thermo Scientific </td><td> 5840300 </td><td></td></tr><tr><td> ELx405 lavadora </td><td> BioTek </td><td> ELx405HT </td><td> Lavagem de células automatizado </td></tr><tr><td> Echo manipulador líquido </td><td> Labcyte </td><td> Labcyte Eco 550 </td><td></td></tr><tr><td> Bravo plataforma automatizado de manuseamento de líquidos </td><td> Agilent Technologies </td><td> Modelo padrão </td><td></td></tr><tr><td> Hamamatsu 6000 FDSS </td><td> Hamamatsu </td><td></td><td> Cinética de imagem placa leitor </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Lista de materiais e reagentes.

high-throughput screening para pequenas moléculas moduladores de canais de potássio interiores retificador

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

Membros específicos da família retificador de potássio para o interior do canal (Kir) são postuladas alvos terapêuticos para uma variedade de doenças, incluindo a hipertensão, a fibrilação atrial, e de 1,2 a dor. Para a maior parte, no entanto, os avanços na compreensão do seu potencial terapêutico, ou mesmo funções fisiológicas básicas foi retardado pela falta de boas ferramentas farmacológicas. Na verdade, a farmacologia molecular da família rectificador de entrada tem ficado muito aquém do da superfamília S4 de potássio dependentes da voltagem (Kv) canais, para o qual um número de afinidade nanomolar e moduladores de toxinas peptídicas altamente selectivos foram descobertos 3. A toxina de veneno de abelha tertiapin e seus derivados são inibidores potentes da Kir1.1 Kir3 e canais de 4,5, mas os péptidos são de uso limitado terapeuticamente bem como experimentalmente devido às suas propriedades antigénicas e de biodisponibilidade pobre, a estabilidade metabólica e a penetrância do tecido. O desenvolvimento de potentese selectivos de pequenas moléculas sondas com propriedades farmacológicas melhoradas será a chave para a plena compreensão da fisiologia e potencial terapêutico de canais Kir. O Molecular Libraries Sondas de Produção Centro de Rede (MLPCN), apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) Fundo Comum criou oportunidades para os cientistas acadêmicos para iniciar campanhas de sonda de detecção de alvos moleculares e vias de sinalização que necessitam de melhor farmacologia 6. O MLPCN fornece aos pesquisadores acesso aos centros de indústria em escala de triagem e química medicinal e informática de apoio para desenvolver moléculas pequenas sondas para elucidar a função dos genes e redes de genes. O passo crítico para a admissão ao MLPCN é o desenvolvimento de um ensaio de meta-ou via específica robusto que é tratável através de rastreio de alto rendimento (HTS). Aqui, descrevemos como desenvolver uma fluorescência baseada em tálio (Tl +) fluxo assay de Kir função do canal de rastreio de alto rendimento composto 7,8,9,10. O ensaio é baseado sobre a permeabilidade do canal de K + de poro para o composto aparentado + K + Tl. A comercialmente disponível fluorescente Tl + corante repórter é utilizado para detectar o fluxo transmembranar de Tl + através do poro. Existem pelo menos três corantes disponíveis comercialmente que são adequados para os ensaios de fluxo de Tl +: BTC, FluoZin-2, e FluxOR 7,8. Este protocolo descreve o desenvolvimento do ensaio usando FluoZin-2. Embora originalmente desenvolvidos e comercializados como um indicador de zinco, FluoZin-2 apresenta um aumento robusto e dose-dependente, na emissão de fluorescência após a ligação Tl +. Começamos a trabalhar com FluoZin-2 antes FluxOR estava disponível 7,8 e continuaram a fazê-lo 9,10. No entanto, os passos no desenvolvimento do ensaio são essencialmente idênticas para todas as três corantes, e os utilizadores devem determinar quais corante é mais apropriada para o seu n específicoeeds. Discutimos, também, referência do ensaio de desempenho que devem ser alcançados a ser considerado para a entrada no MLPCN. Desde Tl + facilmente permeia a maioria dos canais de K +, o ensaio deve ser adaptável para a maioria dos objectivos de K + channel.

A utilização de um sistema de expressão induzível por tetraciclina fornece um controle interno conveniente para distinguir Tl + fluxo através de vias endógenos e do canal Kir de interesse. Figura 1 mostra alguns exemplos de mapas de células de revestimento utilizados em diferentes tipos de ensaios. As posições dos poços que contêm as células não induzidas ou induzida por tetraciclina são indicados com cores diferentes. Figura 2A mostra o mapa da placa de base utilizados para ...

Os métodos para o desenvolvimento e validação de um ensaio quantitativo de fluorescência para medir a actividade de potássio rectificador de entrada (Kir) canais de rastreio de alto rendimento composto é apresentado.

High-throughput screening para pequenas moléculas Moduladores de canais de potássio Interiores retificador

Membros específicos da família de canais de potássio retificadores intrínsecos (Kir) são postulados como alvos terapêuticos para diversos distúrbios, incluindo a hipertensão, ...

O objetivo geral deste procedimento é descobrir compostos novos que modulam a atividade de canais de potássio retificadores internos. Isso é realizado primeiramente semeando células HK 2 9 3, induzíveis por tetraciclina e expressando um canal KIR de interesse, em uma placa de 384 poços. O segundo passo é carregar as células com um corante fluorescente repórter de tálio denominado flu in two.Em seguida, o corante não incorporado é removido das células por lavagem e substituído por tampão de ensaio contendo um controle veículo ou compostos em teste. O passo final é a adição de um tampão estimulante aos poços para iniciar o fluxo de tálio. Por fim, um leitor de placas de fluorescência é utilizado para identificar os compostos que alteram o movimento de íons de tálio através do canal KIR.Poor.A principal vantagem deste método em relação a técnicas existentes, como a eletrofisiologia com patch clamp manual, é que ele permite ao pesquisador realizar centenas de experimentos simultaneamente e milhares de experimentos diariamente. Este método possibilita ao pesquisador triar bibliotecas de milhares de moléculas pequenas para descobrir moduladores de canais de potássio retificadores interno

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Biologia

Um procedimento de triagem em tempo real para identificação de drogas que interagem com a proteína G-gate dentro retificador...

Um ensaio de rastreio fluorescente para identificação Moduladores de Canais GIRK

Técnicas de biossensor ópticos podem detectar alterações na massa perto da membrana plasmática em células vivas e permite que se siga as respostas celulares em ambas as células individuais e as populações de células. Este protocolo descreve a detecção da modulação de canais de potássio de L-receptores acoplados à proteína em células intactas utilizando este método.

O uso de biossensores ópticos sem etiqueta para detectar modulação dos canais de potássio por G receptores acoplados à proteína

Aqui descrevemos um ensaio de gene repórter baseado em células como uma ferramenta valiosa para rastrear bibliotecas químicas em busca de compostos que modulam os mecanismos de controle pós-transcricional exercidos por meio de 3' UTR.

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Método para a identificação de molécula pequena inibidores da interacção proteína-proteína entre HCN1 e TRIP8b

Estudar canais iônicos através de um sistema heterólogo expressar tornou-se uma técnica nuclear em pesquisa biomédica. Neste texto, apresentamos um método eficiente tempo para conseguir uma expressão de canal iónico com força controlada através da realização de transfecção transiente, sob o controlo de um promotor indutível.

Controlável Expressão Ion Canal através de transfecção transiente Induzível

Aqui, apresentamos um protocolo quantitativo e escalável para realizar telas de moléculas pequenas direcionadas para os reguladores de cinase da transição pluripotente iniciada na primitiva.

Um método simples para identificar quinases que regulam a pluripotência de células estaminais embrionárias por meio de triagem de inibidores de alto rendimento

Um ensaio de ATPase acoplado a nicotinamida adenina dinucleotídeo (NADH) foi adaptado à triagem de taxa de transferência semialta de inibidores de miosina de pequena molécula. Este ensaio cinético é executado em um formato de microplaca de 384 poços com volumes de reação total de apenas 20 μL por poço. A plataforma deve ser aplicável a praticamente qualquer enzima produtora de ADP.

Uma adaptação semi-high-throughput do ensaio ATPase NADH-acoplado para a seleção de inibidores pequenos da molécula

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Ensaio de Potencial de Membrana Baseado em Fluorescência para Estudo Funcional de Alto Rendimento de Dois Canais Iônicos Endógenos em Duas Linhagens Celulares Epiteliais

O presente protocolo destaca a aplicação da técnica de western blotting para estudar as funções e atividades do co-transportador neuronal K-Cl KCC2. O protocolo descreve a investigação da fosforilação de KCC2 em sítios reguladores de quinase Thr906/1007 via western blotting. Além disso, métodos adicionais para confirmar a atividade do KCC2 são brevemente destacados neste texto.

Estudo das Funções e Atividades do Co-Transportador Neuronal K-Cl KCC2 Usando Western Blotting

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Uma Técnica de Alto Rendimento Baseada em Citometria de Fluxo para Triagem de Drogas Inibidoras de Integrinas

O direcionamento farmacológico dos canais iônicos é uma abordagem promissora para o tratamento de tumores sólidos. Protocolos detalhados são fornecidos para caracterizar a função de canais iônicos em células cancerosas e avaliar os efeitos de moduladores de canais iônicos na viabilidade do câncer.

Rastreamento de Canais Iônicos em Células Cancerosas

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High-throughput screening para pequenas moléculas Moduladores de canais de potássio Interiores retificador

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