Name: High-throughput screening para pequenas moléculas Moduladores de canais de potássio Interiores retificador (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Aprenda a desenvolver um ensaio de fluorescência quantitativo para medir a atividade de canais de potássio retificadores internos (Kir) em células HK293. Este método permite triagem de alta vazão para descobrir novos moduladores de canais iônicos com potencial terapêutico.

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Este trabalho foi suportado por financiamento do Instituto Nacional de Saúde concede 1R21NS073097-01 e 1R01DK082884 (JSD) e Fundação para o National Institutes concessão PIER11VCTR.

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<li>Raphemot, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery%2C+characterization%2C+and+structure-activity+relationships+of+an+inhibitor+of+inward+rectifier+potassium+%28Kir%29+channels+with+preference+for+Kir2.3%2C+Kir3.x%2C+and+Kir7.1%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Discovery, characterization, and structure-activity relationships of an inhibitor of inward rectifier potassium (Kir) channels with preference for Kir2.3, Kir3.x, and Kir7.1.</a> Front Pharmacol. 2, 75(2012).</li>
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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Tratamento de dados: Uma vez que os dados são recolhidos, um passo comum na análise envolve a normalizar resposta da fluorescência de cada poço, F, ao seu valor inicial no início da experiência, F 0. Isto é vulgarmente referido como o &quot;índice estático&quot; e simbolizado &quot;F / F 0&quot;. Nos casos em que F 0 é dominado pelo corante indicador de operação estática proporção substancialmente corrigir por muitos factores tais como desuniformidades em ilum...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/4209/high-throughput-screening-for-small-molecule-modulators-inward">High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels</a>. The Protocol section has been updated.
The formula in step 7.1 of the Protocol has been updated from:
Z prime = 1- (3SDp + 3SDn)/|meanp + meann |
to:
Z prime = 1- (3SDp + 3SDn)/|meanp - meann |

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Erratum: High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> pcDNA5/TO </td><td> Invitrogen </td><td> V1033-20 </td><td> Tetraciclina-vector de expressão indutível </td></tr><tr><td> T-rex-células HEK293 </td><td> Invitrogen </td><td> R71007 </td><td> Tetraciclina induzível por linha celular </td></tr><tr><td> Lipofectamine Reagente LTX / Plus </td><td> Invitrogen </td><td> 15338100 </td><td> Reagente de transfecção </td></tr><tr><td> FBS </td><td> ATLANTA Biologicals </td><td> S11550 </td><td> Meios de cultura de células </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11965 </td><td> Meios de cultura de células </td></tr><tr><td> Higromicina B </td><td> Invitrogen </td><td> 10687-010 </td><td> Meios de cultura de células </td></tr><tr><td> Blasticidina S </td><td> Invitrogen </td&gt; <td> R210-01 </td><td> Meios de cultura de células </td></tr><tr><td> Penicilina / estreptomicina </td><td> Invitrogen </td><td> 15140 </td><td> Meios de cultura de células </td></tr><tr><td> HBSS-bivalente livre </td><td> Mediatech </td><td> 21022CV </td><td> Lavagem de células </td></tr><tr><td> Tripsina 0,25% </td><td> Mediatech </td><td> 25053CI </td><td> Dissociação celular </td></tr><tr><td> Tetraciclina-HCl </td><td> Sigma </td><td> T9823 </td><td> Reagente indução </td></tr><tr><td> FBS dialisado </td><td> ATLANTA Biologicals </td><td> S12650 </td><td> Meios seletivos </td></tr><tr><td> FluoZin-2 </td><td> Invitrogen </td><td> F24189 </td><td> Corante fluorescente </td></tr><tr><td> Pluronic F-127 </td><td> Invitrogen </td><td> P-3000MP </td><td> Corante de carga </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Invitrogen </td><td> 14175 </td><td> Tampão de ensaio </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Invitrogen </td><td> 15630 </td><td> Tampão de ensaio </td></tr><tr><td> NaHCO3 </td><td> Sigma </td><td> S6297 </td><td> Tl + estímulo tampão </td></tr><tr><td> MgSO4 </td><td> Sigma </td><td> M2643 </td><td> Tl + estímulo tampão </td></tr><tr><td> CaSO 4 • 2H 2 O </td><td> Sigma </td><td> C3771 </td><td> Tl + estímulo tampão </td></tr><tr><td> D-Glucose </td><td> Sigma </td><td> G7528 </td><td> Tl + estímulo tampão </td></tr><tr><td> Sulfato de tálio </td><td> Aldrich </td><td> 204625 </td><td> Tl + estímulo tampão </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma </td><td> H4034 </td><td> Tl + estímulo tampão </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Sigma </td><td> D4540 </td><td> Solvente </td></tr><tr><td> Oito canais pipetador eletrônico </td><td> Biohit </td><td> E300 </td><td> Chapeamento de celular em 384 -placas de poços </td></tr><tr><td> BD PureCoat amina revestidos 384 poços </td><td> BD Biosciences </td><td> 356719 </td><td> Microplacas de ensaio </td></tr><tr><td> Eco qualificados 384-Bem polipropileno microplaca (384PP) </td><td> Labcyte </td><td> P-05525 </td><td> Fonte microplacas compostos </td></tr><tr><td> 384-poços de microplacas de polipropileno </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 781280 </td><td></td></tr><tr><td> Dispensador de reagente Multidrop Combi </td><td> Thermo Scientific </td><td> 5840300 </td><td></td></tr><tr><td> ELx405 lavadora </td><td> BioTek </td><td> ELx405HT </td><td> Lavagem de células automatizado </td></tr><tr><td> Echo manipulador líquido </td><td> Labcyte </td><td> Labcyte Eco 550 </td><td></td></tr><tr><td> Bravo plataforma automatizado de manuseamento de líquidos </td><td> Agilent Technologies </td><td> Modelo padrão </td><td></td></tr><tr><td> Hamamatsu 6000 FDSS </td><td> Hamamatsu </td><td></td><td> Cinética de imagem placa leitor </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Lista de materiais e reagentes.

high-throughput screening para pequenas moléculas moduladores de canais de potássio interiores retificador

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

Membros específicos da família retificador de potássio para o interior do canal (Kir) são postuladas alvos terapêuticos para uma variedade de doenças, incluindo a hipertensão, a fibrilação atrial, e de 1,2 a dor. Para a maior parte, no entanto, os avanços na compreensão do seu potencial terapêutico, ou mesmo funções fisiológicas básicas foi retardado pela falta de boas ferramentas farmacológicas. Na verdade, a farmacologia molecular da família rectificador de entrada tem ficado muito aquém do da superfamília S4 de potássio dependentes da voltagem (Kv) canais, para o qual um número de afinidade nanomolar e moduladores de toxinas peptídicas altamente selectivos foram descobertos 3. A toxina de veneno de abelha tertiapin e seus derivados são inibidores potentes da Kir1.1 Kir3 e canais de 4,5, mas os péptidos são de uso limitado terapeuticamente bem como experimentalmente devido às suas propriedades antigénicas e de biodisponibilidade pobre, a estabilidade metabólica e a penetrância do tecido. O desenvolvimento de potentese selectivos de pequenas moléculas sondas com propriedades farmacológicas melhoradas será a chave para a plena compreensão da fisiologia e potencial terapêutico de canais Kir. O Molecular Libraries Sondas de Produção Centro de Rede (MLPCN), apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) Fundo Comum criou oportunidades para os cientistas acadêmicos para iniciar campanhas de sonda de detecção de alvos moleculares e vias de sinalização que necessitam de melhor farmacologia 6. O MLPCN fornece aos pesquisadores acesso aos centros de indústria em escala de triagem e química medicinal e informática de apoio para desenvolver moléculas pequenas sondas para elucidar a função dos genes e redes de genes. O passo crítico para a admissão ao MLPCN é o desenvolvimento de um ensaio de meta-ou via específica robusto que é tratável através de rastreio de alto rendimento (HTS). Aqui, descrevemos como desenvolver uma fluorescência baseada em tálio (Tl +) fluxo assay de Kir função do canal de rastreio de alto rendimento composto 7,8,9,10. O ensaio é baseado sobre a permeabilidade do canal de K + de poro para o composto aparentado + K + Tl. A comercialmente disponível fluorescente Tl + corante repórter é utilizado para detectar o fluxo transmembranar de Tl + através do poro. Existem pelo menos três corantes disponíveis comercialmente que são adequados para os ensaios de fluxo de Tl +: BTC, FluoZin-2, e FluxOR 7,8. Este protocolo descreve o desenvolvimento do ensaio usando FluoZin-2. Embora originalmente desenvolvidos e comercializados como um indicador de zinco, FluoZin-2 apresenta um aumento robusto e dose-dependente, na emissão de fluorescência após a ligação Tl +. Começamos a trabalhar com FluoZin-2 antes FluxOR estava disponível 7,8 e continuaram a fazê-lo 9,10. No entanto, os passos no desenvolvimento do ensaio são essencialmente idênticas para todas as três corantes, e os utilizadores devem determinar quais corante é mais apropriada para o seu n específicoeeds. Discutimos, também, referência do ensaio de desempenho que devem ser alcançados a ser considerado para a entrada no MLPCN. Desde Tl + facilmente permeia a maioria dos canais de K +, o ensaio deve ser adaptável para a maioria dos objectivos de K + channel.

A utilização de um sistema de expressão induzível por tetraciclina fornece um controle interno conveniente para distinguir Tl + fluxo através de vias endógenos e do canal Kir de interesse. Figura 1 mostra alguns exemplos de mapas de células de revestimento utilizados em diferentes tipos de ensaios. As posições dos poços que contêm as células não induzidas ou induzida por tetraciclina são indicados com cores diferentes. Figura 2A mostra o mapa da placa de base utilizados para ...

Os métodos para o desenvolvimento e validação de um ensaio quantitativo de fluorescência para medir a actividade de potássio rectificador de entrada (Kir) canais de rastreio de alto rendimento composto é apresentado.

High-throughput screening para pequenas moléculas Moduladores de canais de potássio Interiores retificador

Membros específicos da família de canais de potássio retificadores intrínsecos (Kir) são postulados como alvos terapêuticos para diversos distúrbios, incluindo a hipertensão, ...

O objetivo geral deste procedimento é descobrir compostos novos que modulam a atividade de canais de potássio retificadores internos. Isso é realizado primeiramente semeando células HK 2 9 3, induzíveis por tetraciclina e expressando um canal KIR de interesse, em uma placa de 384 poços. O segundo passo é carregar as células com um corante fluorescente repórter de tálio denominado flu in two.Em seguida, o corante não incorporado é removido das células por lavagem e substituído por tampão de ensaio contendo um controle veículo ou compostos em teste. O passo final é a adição de um tampão estimulante aos poços para iniciar o fluxo de tálio. Por fim, um leitor de placas de fluorescência é utilizado para identificar os compostos que alteram o movimento de íons de tálio através do canal KIR.Poor.A principal vantagem deste método em relação a técnicas existentes, como a eletrofisiologia com patch clamp manual, é que ele permite ao pesquisador realizar centenas de experimentos simultaneamente e milhares de experimentos diariamente. Este método possibilita ao pesquisador triar bibliotecas de milhares de moléculas pequenas para descobrir moduladores de canais de potássio retificadores internos. Um dia antes do experimento de fluxo de tálio, dissocie as células e quantifique a densidade da suspensão celular conforme descrito no manuscrito anexo. Em seguida, utilize o meio BH contendo 10% de FBS dialisado para semear 20.000 células monoclonais estavelmente transfectadas com um gene de canal KIR de interesse em cada poço de uma placa de 384 poços revestida com amina BD PureCoat, usando um Multi Drop Combi térmico ou uma pipeta multicanal. No dia seguinte, inspecione a placa ao microscópio para garantir que as células estejam aderidas e uniformemente distribuídas no fundo dos poços.Em seguida, utilize um lavador de microplacas ELX 405 para substituir o meio de cultura celular pelo tampão HBSS de ensaio, adicionando 20 microlitros por poço. Depois disso, prepare o flus na solução de carregamento 2:00 AM D centrifugando brevemente o tubo para dissolver 50 microgramas de flus em pó em 100 microlitros de DMSO anidro.Agora, adicione 50 microlitros de uma solução de F1 27 ônico a 20% peso por volume em DMSO ao corante. Misture-os pipetando suavemente. Em seguida, adicione 150 microlitros de flus às 2:00 AM ônico F1 27 a 35 mililitros de tampão HBSS para ensaio e misture suavemente.Em seguida, adicione 20 microlitros de tampão de carregamento de corante a cada poço que já contém 20 microlitros de tampão de ensaio HBSS. Incube as células à temperatura ambiente por aproximadamente uma hora enquanto as células carregam o corante. Prepare uma placa de estímulo com tálio dissolvendo recentemente 0,5 gramas de bicarbonato de sódio em 50 mililitros de tampão de estímulo de tálio cinco vezes concentrado.Em seguida, adicione 50 microlitros da solução a cada poço de uma placa de polipropileno de 384 poços após as células terem sido carregadas com flus às 2:00 da manhã. Lave a placa com um lavador de microplacas ELX 405. A seguir, adicione 20 microlitros ou 40 microlitros do tampão de ensaio HBSS a cada poço e a placa está agora pronta para os experimentos.Carregue as placas de tálio e as placas celulares em um sistema funcional de triagem de fármacos Hema Matsu ou leitor de placas com imagem cinética equivalente com capacidades integradas de dispensação de líquidos e utilize filtros apropriados para corantes baseados em fluoresceína, como flu oh four. Em seguida, configure um protocolo de adição única para adicionar 10 microlitros de cinco X Thallium series aos poços correspondentes da placa celular contendo 40 microlitros de tampão de ensaio HBSS. Então, registre a fluorescência de linha de base com uma frequência de amostragem de um hertz por pelo menos 10 segundos.A fluorescência de poço a poço deve ser uniforme e estável ao longo da placa, uma vez que as condições ideais de semeadura celular, lavagem e carregamento forem estabelecidas. Enquanto isso, utilize o pipetador integrado de 384 canais para adicionar simultaneamente o tampão de estímulo com tálio a cada poço e continue o registro por pelo menos dois minutos, de modo que a taxa e o pico do aumento induzido por tálio na fluorescência sejam capturados para análise posterior. Na próxima série de experimentos, avalie a uniformidade e reprodutibilidade do ensaio semeando um inibidor controle em cada poço alternado de cada coluna e linha de uma placa de 384 poços e adicionando DMSO aos demais poços como controle de veículo.Utilize um pipetador multicanal. Prepare uma placa de DMSO com compostos pipetando um inibidor do canal KIR-alvo na concentração determinada previamente, com 80 microlitros por poço e veículo contendo 0,1% de DMSO, em uma placa de polipropileno de 384 poços. Isso é feito adicionando-se um inibidor conhecido começando no poço A1, alternando para o poço B2 e assim sucessivamente até o poço B24.Repita este procedimento com DMSO, iniciando no poço B1 e assim por diante até o poço A24. Agora, carregue a placa celular, a placa do composto e as placas com estímulo de tálio no leitor de placas. Em seguida, configure um protocolo de duas adições para adicionar 20 microlitros da série de compostos na concentração 2X aos poços correspondentes da placa celular contendo 20 microlitros de tampão de ensaio HBSS.Adicione os compostos à placa de células e incube-os por até 20 minutos à temperatura ambiente. Registre o sinal basal de fluorescência em dois comprimentos de onda por pelo menos 10 segundos. Em seguida, adicione 10 microlitros de tampão de tálio 5x a cada poço da placa de células.Repita o experimento em três dias consecutivos para estabelecer a reprodutibilidade dos resultados. Utilize o fluxo de tálio em células tratadas com DMSO e com fármaco para calcular um valor para o Z primo. Uma medida estatística da variabilidade de poço para poço entre as duas populações de poços, calcule o Z primo usando esta fórmula baseada nas médias e desvios padrão de P e N, onde P é o valor de fluxo não inibido e N é o valor de fluxo totalmente inibido.Um ensaio com valores de ZPrime maiores ou iguais a 0,5 em três dias distintos é considerado adequado para triagem de alto rendimento. Essas figuras são alguns exemplos dos mapas de semeadura celular utilizados em diferentes tipos de experimentos. As posições dos poços contendo células não induzidas ou células induzidas por tetraciclina são indicadas em cores diferentes.Esta figura mostra o mapa da placa original utilizado para determinar a concentração ótima de tálio para o desenvolvimento do ensaio e triagem de compostos. O gradiente de cores representa a série de diluição em triplo, variando de 100% a 0,002% de tálio, e aqui há um mapa representativo da intensidade de fluorescência com cores do frio ao quente, indicando valores baixos a altos de fluxo de tálio. O mapa de semeadura celular mostrado aqui, com o ajuste de uma função logística de quatro parâmetros à CRC do tálio, é utilizado para determinar um valor EEC 80 de 15% de tálio.Esta figura mostra o mapa da placa fonte utilizado para determinar a tolerância ao DMSO em um ensaio. As colunas um e 24 contêm apenas tampão de ensaio, enquanto o gradiente de cor indica a série de diluição em duas vezes, variando de 10% a 0,01% de DMSO, e aqui há um mapa representativo da intensidade de fluorescência com valores baixos de fluxo de tálio indicados em azul mais escuro. Os valores médios de fluxo de tálio registrados nos poços contendo as concentrações indicadas de DMSO são resumidos aqui.Agora, esta figura mostra o mapa da placa de origem utilizado para estabelecer curvas de resposta à concentração para os inibidores conhecidos de um canal KIR. Cada composto é indicado com uma cor diferente e geralmente é distribuído em série de diluição tríplice. Um mapa representativo da intensidade de fluorescência é mostrado aqui, e esta figura mostra a inibição dependente da dose do fluxo de tálio por um inibidor após seu desenvolvimento e otimização.O ensaio de fluxo de tálio também pode ser utilizado para realizar uma variedade de ensaios de rotina em farmacologia. O ensaio de fluxo de tálio já foi previamente adaptado para uso com canais de potássio dependentes de voltagem e ligados a ligantes, canais catiônicos não seletivos e até transportadores de potássio. Não se esqueça de que trabalhar com tálio pode ser extremamente perigoso, e precauções, como o uso de luvas e descarte adequado de resíduos, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.

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