High-throughput screening para pequenas moléculas Moduladores de canais de potássio Interiores retificador

O objetivo geral deste procedimento é descobrir novos compostos que modulam a atividade dos canais de potássio retificadores internos. Isso é feito primeiro pelo revestimento de células induzíveis por tetraciclina, HK 2 9 3, expressando um canal KIR de interesse em uma placa de 384 poços. O segundo passo é carregar as células com um corante repórter de tálio fluorescente chamado gripe em dois.

Em seguida, o corante não incorporado é lavado das células e substituído por tampão de ensaio contendo um controle de veículo ou compostos de teste. A etapa final é a adição de um tampão de estímulo aos poços para iniciar o fluxo de tálio. Em última análise, um leitor de placa de fluorescência é usado para identificar os compostos que alteram o movimento dos íons tálio através do canal KIR. Pobre.

A principal vantagem desse método sobre as técnicas existentes, como a eletrofisiologia manual do patch clamp, é que ele permite que o investigador realize centenas de experimentos simultaneamente e milhares de experimentos diariamente. Este método permite que o investigador rastreie bibliotecas de milhares de pequenas moléculas para descobrir moduladores de canais de potássio retificadores internos: Um dia antes do experimento de fluxo de tálio, dissocie as células e quantifique a densidade da suspensão celular, conforme descrito no manuscrito anexo. Em seguida, use o meio BH contendo 10% de placa FBS dialisada 20.000 células monoclonais transfectadas de forma estável com um gene de canal KIR de interesse em cada poço de uma placa de 384 poços revestida com Amin de revestimento puro BD usando um combi termocolorido multigota ou um pipetador multicanal no dia seguinte, inspecione a placa sob um microscópio para garantir que as células estejam aderentes e uniformemente distribuídas no fundo dos poços.

Em seguida, use uma arruela de microplacas ELX 4 0 5 para substituir o meio de cultura celular pelo ensaio HBSS. Tampão a 20 microlitros por poço. Depois disso, prepare as gripes em uma solução de carregamento D às 2:00 da manhã, centrifugando brevemente o tubo para dissolver 50 microgramas de gripes em dois pó em 100 microlitros de DMSO anidro.

Agora adicione 50 microlitros de uma solução de 20% de peso por volume de F1 27 DMSO onic ao corante. Misture-os pipetando suavemente. Em seguida, adicione 150 microlitros de gripes em 2:00 AM onic F1 27 a 35 mililitros de ensaio HBSS, tampone e misture suavemente.

Em seguida, adicione 20 microlitros de tampão de carga de corante a cada poço que já contém 20 microlitros de ensaio HBSS. Buffer. Incube as células em temperatura ambiente por aproximadamente uma hora enquanto as células estão carregando com corante. Prepare uma placa de estímulo de tálio dissolvendo 0,5 gramas de bicarbonato de sódio em 50 mililitros de cinco x tampão de estímulo de tálio.

Em seguida, adicione 50 microlitros da solução a cada poço de uma placa de polipropileno de 384 poços Depois que as células foram carregadas com gripes às 2:00 da manhã. Lave a placa com uma lavadora de microplacas ELX 4 0 5. Em seguida, adicione 20 microlitros ou 40 microlitros de ensaio HBSS. Buffer de volta para cada poço e a placa está pronta para os experimentos.

Carregue o tálio e as placas celulares em um sistema de triagem funcional de drogas Hema Matsu ou leitor de placa de imagem cinética equivalente com recursos integrados de distribuição de líquidos e use filtros apropriados para corantes à base de fluoresceína, como gripe oh four. Depois disso, configure um único protocolo de adição para adicionar 10 microlitros de cinco séries X Thallium aos poços correspondentes da placa celular contendo 40 microlitros de tampão de ensaio HBSS. Em seguida, registar a fluorescência de base a uma frequência de amostragem de um hertz durante, pelo menos, 10 segundos.

A fluorescência poço a poço deve ser uniforme e estável em toda a placa, uma vez que as condições ideais de revestimento celular, lavagem e carga d sejam estabelecidas. Enquanto isso, use o pipetador de 384 canais integrado para adicionar o tampão de estímulo de tálio a cada poço simultaneamente e continue a gravação por pelo menos dois minutos para que a taxa e o pico do aumento induzido pelo tálio na fluorescência sejam capturados para análise off-line. Na próxima série de experimentos, avalie a uniformidade e reprodutibilidade do ensaio plaqueando um inibidor de controle em todos os outros poços de cada coluna e linha de uma placa de 384 poços e adicione DMSO aos outros poços como um controle de veículo.

Use um pipetador multicanal. Faça a placa composta de DMSO pipetando um inibidor do canal KIR alvo na concentração determinada anteriormente em 80 microlitros por poço e 0,1% de veículo DMSO em uma placa de polipropileno de 384 poços. Isso é feito adicionando um inibidor conhecido começando no poço A um e alternando para o poço B dois e assim por diante até o poço B 24.

Repita este procedimento com DMSO começando no poço, B um e assim por diante até o poço A 24. Agora carregue a célula, o composto e as placas de estímulo de tálio no leitor de placas. Em seguida, configure um protocolo de adição de dois para adicionar 20 microlitros das duas séries de compostos de concentração X aos poços correspondentes da placa celular contendo 20 microlitros de tampão de ensaio HBSS.

Adicione os compostos à placa celular e incube-os por até 20 minutos em temperatura ambiente. Registre as gripes basais em duas fluorescências por pelo menos 10 segundos. Em seguida, adicione 10 microlitros de cinco tampão de tálio a cada poço da placa celular.

Repetir a experiência nos três dias subsequentes para determinar a reprodutibilidade dos resultados. Use o fluxo de tálio em DMSO e células tratadas com drogas para calcular um valor para Z primo. Uma medida estatística da variabilidade entre poços entre as duas populações de poços calcula Z prime usando esta fórmula com base nas médias e desvios padrão de P e N, onde P é o valor de fluxo desinibido e N é o valor de fluxo totalmente inibido.

Um ensaio com valores de ZPrime maiores ou iguais a 0,5 em três dias separados é considerado adequado para triagem de alto rendimento. Essas figuras são alguns exemplos dos mapas de revestimento celular usados em diferentes tipos de experimentos. As posições dos poços contendo células não induzidas ou induzidas por tetraciclina são indicadas em cores diferentes.

Esta figura mostra o mapa da placa de origem usado para determinar a concentração ideal de tálio para o desenvolvimento do ensaio e triagem do composto. O gradiente de cor representa a série de diluição tripla variando de 100% a 0,002% de tálio, e aqui está um mapa de intensidade de fluorescência representativo com cores frias a quentes, indicando valores de fluxo de tálio baixos a altos. O mapa de revestimento celular mostrado aqui com um ajuste de quatro parâmetros função logística para o CRC de tálio é usado para determinar um valor EEC 80 de 15% de tálio.

Esta figura mostra o mapa da placa de origem usado para determinar a tolerância DMSO de um ensaio. As colunas um e 24 contêm apenas tampão de ensaio, enquanto o gradiente de cor indica a série de diluição dupla variando de 10% a 0,01% DMSO e aqui está um mapa de intensidade de fluorescência representativo com baixos valores de fluxo de tálio indicados com azul mais escuro. Os valores médios de fluxo de tálio registrados nos poços contendo as concentrações indicadas de DMSO são resumidos aqui.

Agora, esta figura mostra o mapa da placa de origem usado para estabelecer curvas de resposta de concentração para os inibidores conhecidos de um canal KIR. Cada composto é indicado com uma cor diferente e é normalmente revestido como uma série de diluição tripla. Um mapa de intensidade de fluorescência representativo é mostrado aqui, e esta figura mostra a inibição dependente da dose do inibidor de fluxo de tálio após seu desenvolvimento e otimização.

O ensaio de fluxo de tálio também pode ser usado para realizar uma variedade de ensaios farmacológicos de rotina. O ensaio de fluxo de tálio foi previamente adaptado para uso com canais de potássio ligados e de voltagem, canais catiônicos não seletivos e até mesmo transportadores de potássio. Não se esqueça que trabalhar com telólio pode ser extremamente perigoso e precauções como o uso de luvas e descarte adequado de resíduos devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.