Name: Humanos Linhas tumor neuroendócrino de células como um modelo tridimensional para o estudo da terapia de tumores humanos Neuroendócrino (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: Aprenda a criar esferoides 3D uniformes de células tumorais neuroendócrinas humanas usando recobrimento com agarose. Este método simples e econômico facilita a descoberta de fármacos terapêuticos.

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Agradecemos a Dr. Wenjin Chen pela ajuda com o programa MATLAB e do Instituto do Câncer de Nova Jersey e histopatologia instalação de microscopia. Agradecemos também aos revisores por seus comentários e sugestões. Este estudo é apoiado pela Raymond e Beverly Sackler Research Foundation.

1. Preparação de 1% de agarose-revestido placa de 24 poços <ol><li> Adicionar 1 g de agarose (RPI, A20090-500) a 100 ml de água desionizada num frasco ml 250-500 e autoclave para esterilizar a agarose (121 ° C, 15 psi, 15 min, em uma máquina de autoclave). Transferir a garrafa com agarose esterilizado em um banho de água 70 ° C. A agarose está pronto para ser derramado quando é arrefecida a 70 ° C, o que demora cerca de uma hora. Certifique-se de manter o estéril agarose em todos os momentos. </li><li> Obter os 24 poços de fundo plano (Falcon placas, 353,047); qualquer tipo de 24 poços de fundo plano Placas funcionaria se as placas podem ser visualizados sob um microscópio de contraste de fase. </li><li> Dispense 200 ul de agarose a cada poço com uma pipeta Eppendorf repetidor em uma cabine de segurança biológica e agite a agarose em torno do bem para torná-lo cobrir o bem de forma uniforme. 200 ul de agarose é adequado para formar uma superfície côncava de modo a que esferóides podem formar as formas consistentes esféricas. Menos de 200 ul de agarose não podecobrir o bem inteiramente, mas mais do que 200 ul de agarose não pode formar a superfície côncava e os esferóides cultivadas em que não podem formar formas esféricas. </li><li> A agarose revestidas placas de 24 poços estão prontos para ser utilizados em cerca de 10 min. (Opcional) Adicionar 100 ul de meio para equilibrar a agarose com meio de cultura antes de células de semeadura. </li><li> Alternativamente, após a agarose é totalmente solidificados, adicionar 100 meio de crescimento uL a cada poço e selar as placas com a fita de vedação estéril (Nunc, 236,366). Estas placas podem ser armazenadas a 4 ° C durante até uma semana. </li></ol> 2. Preparação de suspensões de células únicas <ol><li> Todas as experiências são realizadas utilizando as técnicas padrão assépticas num armário de segurança biológica e todas as culturas são crescidas em um 37 ° C incubadora humidificada com 5% de CO 2 em ar, a menos que especificado. </li><li> Pancreático humano NET Bon-1 células são mantidas em DMEM/F12 (Invitrogen, 10.565) com 10% de soro fetal bovino (FBS, Invitrogen,16000-044 médio) em uma de 100 mm x 20 mm prato de cultura estéril tecido (Corning, 430,167). </li><li> Quando monocamada Bon-1 das células atingirem 70-80% de confluência, o meio é removido. As células são lavadas com PBS duas vezes, e desalojado do prato por adição de 1 ml TrypLE (Invitrogen, 12.604) com 5 minutos de incubação a 37 ° C. TrypLE é semelhante à tripsina, mas é estável a 15 - 30 ° C, bem como a 4 ° C. Confira ao microscópio para se certificar de todas as células são separadas do prato. </li><li> Adicionar 9 ml de meio de crescimento das células tripsinizadas e usar uma pipeta para pipetar células para cima e para baixo algumas vezes para assegurar uma suspensão de células até único. </li><li> Use 70-iM célula coador (Fisher, 22.363.548) para filtrar as células. </li><li> Recolher células e realizar uma contagem de células utilizando goiaba PCA-96 Sistema de Base (Millipore). </li><li> Preparar uma suspensão de 5.000 células por ml em fenol livre de DMEM/F12 com meio de crescimento 10% de FBS. </li></ol> 3. Cultura esferóide <ol><li> Overlay ul 200 do únicoAs suspensões de células para a agarose revestido placa de 24 poços e selar as placas de 24 poços com a fita de vedação estéril para evitar a evaporação. </li></ol> Nota: - O número de células a serem plaqueadas deve ser determinado empiricamente com base no tamanho dos esferóides no dia 6; 300-400 diâmetro iM dos esferóides seria o tamanho ideal para o início do tratamento com drogas; 1000 BON-1 e H727 células são semeadas. - Não é recomendável partida tratamentos com drogas após o dia 6, porque a viabilidade das células 3D começa a cair a cerca de 10 dias (dados não mostrados, manuscrito em preparação). <ol start="2"><li> Colocar os acima de agarose revestidas placas de 24 poços com BON-1 células sobre um agitador orbital a uma agitação muito lenta de menos de 40 rpm durante a noite num 37 ° C incubadora humidificada com 5% de CO 2 em ar. Em seguida, estas placas mover para uma plataforma estável para manter as culturas em crescimento. </li><li> Adicionar 200 uL de meio de crescimento cada poço da placa acimas cada 3 dias. Não perturbe os esferóides. Tentar adicionar médio através da parede de cada poço, tocando a ponta da pipeta para o lado do poço, e deixando que o fluxo médio para baixo para dentro do poço. </li><li> Monitorar a formação esferóide nas placas de 24 poços sob um microscópio. </li></ol> 4. Tratamento de Drogas <ol><li> Quando os esferóides atingir cerca de 300-400 um de diâmetro no dia 6, os esferóides 3D são tratados com a droga. Este é denotado como 0 dias de tratamento da toxicodependência. </li><li> No dia 6, cada poço da placa contém cerca de 400 ul de meio. Para garantir que os tratamentos com drogas estão em concentração final 1x em cada poço, 3x diluições em série de cada dose de tratamentos são feitos a partir da reserva de fármaco em meio de crescimento 5 ml num tubo de 15 ml, o que é suficiente para 8 repetições. </li><li> Os esferóides em cada linha da placa de 24 cavidades são categorizados como veículo, a dose de 1, 2, 3, 4 e 5. Existem quatro réplicas para cada dose de tratamentos em uma placa de 24 poços (ver <strong&gt; Tabela 1). Nós geralmente tratar esferóides 3D pelo menos em 2 placas de 24 poços, que faz com que, pelo menos, 8 repetições para cada dose de tratamentos. </li><li> Girar para baixo a placa de 24 poços a 800 rpm durante 5 min a 4 ° C para se certificar de que todas as condensações sobre a fita de vedação ir para dentro do poço. Devido à característica flutuante dos esferóides 3D, o meio em cada poço não é removido para evitar a perturbação dos esferóides. </li><li> Adicionar cuidadosamente 200 ul dos tratamentos acima feita de cada dose nos poços apropriados ao longo da parede de cada poço. </li><li> Selar as placas de 24 poços com a fita de vedação e incubar as culturas no 37 ° C incubadora humidificada com 5% de CO 2 em ar. </li><li> Se necessário, recuar os esferóides em cada poço com a respectiva dose de tratamentos após 72-96 horas. </li></ol> 5. Monitor 3D Culturas esferóides <ol><li> Em cada ponto de tempo escolhido após tratamentos com drogas (0, 24, 48, 72 hr), os esferóides em cada poço de t24-ele bem placa são gravadas com um microscópio Zeiss Axiovert de contraste de fase 200/M-based usando uma objetiva de 5x. </li></ol> Nota: As imagens podem ser tomadas em qualquer microscópio de luz com uma escala calibrada entre mM e pixel. A objetiva de 5x, é ideal porque os esferóides rapidamente ultrapassar o campo de imagem com uma objetiva de 10x. <ol start="2"><li> Esferóide análise pode ser realizada manualmente, utilizando Zeiss AxioVision 4.8.2 Software com as imagens brutas. </li><li> Alternativamente, um costume desenvolvido programa MATLAB é utilizado para estimar o tamanho dos esferóides automaticamente / semi-automática. O programa automático implementa o algoritmo contorno activo 4 para localizar com precisão o contorno do esferóide em uma determinada imagem e medir a sua maior (L) e menores (W) eixos automaticamente. Uma versão semi-automática do mesmo algoritmo permite que os usuários para ajudar a iniciar o programa quando artefato forte está presente. Todas as imagens precisam ser exportada como TIFF ou JPEG de formatos de arquivoNas imagens originais para serem lidos pelo programa. O volume do esferóide é estimada como 0,5 x L x W 2. </li></ol> 6. HistoGel incorporação dos esferóides-3D Net <ol><li> 10-24 esferóides são recolhidos a partir das placas de 24 poços, lavou-se duas vezes em PBS, fixadas em formalina a 10% durante 2 horas, lavou-se em 50% e etanol a 70% durante 15 min, duas vezes, respectivamente, e estão prontos para incorporação HistoGel. Alternativamente, eles podem ser mantidos em etanol a 70%, a 4 ° C durante vários meses. </li><li> Um tubo de frio HistoGel (Thermo Scientific, HG-4000-012) é colocada num copo cheio com água. A proveta é aquecida num microondas durante 1 min ou até que o gel é completamente liquefeito, depois mantido no copo cheio de água mesma em todos os momentos. </li><li> Os esferóides em etanol a 70% a partir de cima são transferidos para um cryomold biópsia (Tissue-Tek, Sakura Finetek, 4565) usando um palito de dentes. Certifique-se de todos os esferóides são transferidos. Deixe os esferóides sentar-se por um minuto a afundar para baixo para o fundo do biopsy cryomold. Tente se livrar dos líquidos no cryomold biópsia com Kimwipes e, entretanto, muito gentilmente empurrar os esferóides ao centro na parte inferior do cryomold biópsia usando o plástico descartável pipeta Pasteur. Este passo pode ser mais fácil de ser feita sob um microscópio de dissecação. </li><li> Uma fina camada de HistoGel aquecido é adicionado à cryomold biópsia para estabilizar os esferóides, na parte inferior do cryomold biópsia; por sua vez, o palito é usado para manter os esferóides no centro, na parte inferior do cryomold biópsia muito suavemente. Não adicionar HistoGel muito, mas apenas o suficiente para estabilizar os esferóides, na parte inferior do cryomold biópsia. </li><li> Deixe os esferóides / HistoGel sentar-se por 1-2 minutos à temperatura ambiente ou até que o HistoGel é solidificado. Em seguida, preencha o resto do cryomold biópsia com o HistoGel aquecido. </li><li> Permitir que a solidificar à temperatura ambiente durante cerca de 10 min. </li><li> Pouco antes de estalar os esferóides / bloco HistoGel do cryomold biópsia, leave-lo a 4 ° C durante 1 min, o que ajuda a estalar os esferóides intacta / bloco HistoGel. Os esferóides / bloco HistoGel é então envolto em um pedaço de Bio-wraps (Surgipath, 01090) e colocar em um tecido e cassete biópsia (Fisher Scientific, 15-182-701D). O tecido e cassete biópsia é armazenado num recipiente com etanol a 70%. Em seguida, os procedimentos de tecido de rotina de processamento de parafina são seguidos. 5 </li><li> O bloco de parafina pode ser seccionado em 3-iM lâminas camada espessa. As lâminas podem ser corados com hematoxilina e eosina para determinar as alterações histológicas e também pode ser utilizado para a coloração imuno-histoquímica. </li></ol> 7. Os resultados representativos Pancreático humano linhas tumorais neuroendócrinos células BON-1 (fornecido a Verto Instituto por Kjell Oberg, Uppsala University, Suécia), QGP-1 (Japanese Health Sciences Foundation, Osaka, Japão), e neuroendócrino tumor de pulmão humano de células da linha H727 (ATCC) foram cultivados num agarose-revestido placa de 24 cavidades. Como visto na Figura 1, as três linhas de células mostram a morfologia diferente. Células BON-1 e H727 formado esferóides 3D. Sob o microscópio, as células apresentaram H727 esferóides mais apertados e mais compacto que o Bon-1 células. Nós supomos que a H727 células têm uma capacidade maior de adesão célula-célula e formam junções apertadas como resultado. QGP-1 células mostram grandes uva como massas porosas, que não são considerados esferóides. Devido ao interesse crescente de pesquisa pancreática tumor neuroendócrino nos últimos anos, BON-1 células são utilizadas para o resto das figuras. Após espalhar Bon-1 células na agarose revestido placa de 24 poços, a formação de esferóides multicelular ocorre tipicamente por º dia 3 rd ou 4 e os esferóides tornar-se mais redondo pelo dia 6 th. Devido à limitação de nutrientes e de oxigénio, as células do núcleo denso dos esferóides começam a morrer por volta do dia 10 e por dia 17, os esferóides começam a desintegrar-se, devido ao grande tamanho ou na formame os casos, a ejeção do núcleo necrótico. Os esferóides tipicamente pode crescer até 1.000 m de diâmetro. A Figura 2 mostra as secções da formação de crescimento, e desintegração do Bon-1 esferóides 3D. Os tratamentos medicamentosos foram iniciadas quando esferóides foram em torno de 300-400 mM e células retidas alta viabilidade (manuscrito em preparação). Dia 6 esferóides 3D foram escolhidos como ponto de partida para os tratamentos com medicamentos. Tem sido relatado que os inibidores da histona mostraram efeitos antiproliferativos e proapoptóticos sobre as células NET. 6 Nós escolhemos a histona-desacetilase inibidor Tricostatina-A 3A (TSA), como um exemplo para ilustrar o efeito do tratamento com drogas em 3D esferóides NET. Figura mostra a morfologia dos esferóides 3D sobre o tratamento de TSA Figura. 3B mostra o volume dos esferóides 3D sobre TSA (Sigma, T8552) de tratamento. O tamanho de cada indivíduo foi estimada esferóide automaticamente por um custom-desenvolvido MATLAB programa de computador. 4 Um passo de desenho manual foi adicionada para ajudar a obter os esferóides, que eram muito perto da extremidade de uma dada imagem. Pelo menos 8 esferóides foram medidos por dose de tratamentos de TSA em cada ponto de tempo. O volume de cada esferóide 3D ​​foi calculada como 0,5 x Comprimento x Largura 2. Como visto na Figura 3A e 3B, em relação ao veículo, todas as doses de TSA mostrados nas figuras demonstrado algum grau de inibição do crescimento de Bon-1 esferóides 3D. Entre eles, as concentrações de 125 nM e 250 nM de TSA fortemente reprimida o crescimento de esferóides 3D e levou à morte celular em 96-hr ponto de tempo. Para compreender a histologia dos esferóides NET 3D, um H e E e coloração (IHC) imuno-histoquímica foram realizados em esferóides 3D que tinha sido cultivadas durante 17 dias. Figura 4A ilustra um método para processar esferóides 3D para incorporação HistoGel, que é a chave passo para inclusão em parafina de 3D spher<html> oids. A Figura 4B mostra a coloração HE, a coloração imuno-histoquímica da clivados caspase-3 (um marcador de células apoptóticas) e Ki-67 (um marcador para a proliferação de células) em anticorpos esferóides 3D, que tinha sido cultivadas durante 17 dias . As células no interior do núcleo dos esferóides 3D são na maior parte necrótica / apoptótico e as células da camada exterior são activamente a proliferar. <img src="/files/ftp_upload/4218/4218fig1.jpg" alt="A Figura 1" /> Figura 1. A morfologia de NET Esferóides 3D. Os esferóides 3D a partir de três linhas de células humanas de tumor neuroendócrinos são formados em agarose revestidas placas de 24 poços. 1.000 células BON-1, H727 e QGP-1 foram semeados em agarose revestidas placas de 24 poços e cultivadas em uma condição fisiológica normal, conforme detalhado no protocolo. Estas são as imagens de esferóides 3D para BON-1 e H727 ou célula agregados para QGP-1, que foram cultivadas durante 10 dias. 18/4218fig2.jpg &quot;alt =&quot; Figura 2 &quot;/&gt; Figura 2. O Tracking Crescimento de BON-1 Esferóides 3D O rastreamento crescimento de esferóides Bon-3D: 1. Crescimento, formação e desintegração de esferóides 3D. Como detalhado no protocolo, 1,000 Bon-1 células são plaqueadas em um agarose revestido placa de 24 cavidades. As células são cultivadas num meio DMEM/F12 padrão com FBS a 10% sobre um agitador orbital em uma condição fisiológica durante a noite, em seguida, mudou-se sobre uma plataforma estável e cultivadas nas mesmas condições. O crescimento das células de rastreamento 3D foram seguidos por células de imagem a cada hora para o primeiro 5 horas após o plaqueamento, e depois a cada 1-3 dias com uma Axiovert Zeiss 200/M-based de contraste de fase utilizando um microscópio de objetiva de 5x. As células agregadas em massas em primeiro lugar, em seguida, formar agregados multicelulares, esferóides pequenos, esferóides maiores e, eventualmente, os esferóides se desintegram. <img src="/files/ftp_upload/4218/4218fig3.jpg" alt="A Figura 3" /> Figura 3. TSA Tratamento de BON-1Esferóides 3D. (A) Imagens de esferóides 3D sobre tratamento TSA. Tratamento grupo: V - Veículo (0,0025% DMSO); D1 dose-1 (15,625 nM TSA); dose-D2 2 (31,25 nM TSA); D3: dose 3 (62,5 nM TSA); D4: dose de 4 (125 nM TSA ); D5: dose de 5 (250 nM TSA). Tempo de tratamento: 0 H - ponto de tempo que os tratamentos iniciados no dia 6 esferóides 3D; 24 h, 48 h, 72 he 96 e H são os pontos de tempo após os tratamentos iniciado. Esferóides 3D foram visualizados em cada ponto de tempo como antes. (B) Crescimento dos esferóides 3D após tratamento TSA. Os principais (L) e menores (W) eixos dos esferóides 3D em (A) foram estimados automaticamente pelo programa Matlab em cada ponto de tempo de tratamentos (0, 24, 48, 72 e 96 h). O volume dos esferóides 3D foi estimada como sendo 0,5 x L x W 2. O volume do esferóide no gráfico foi a média de 8 repetições e da barra de erro foi estimada com base na 8 repetições. <img alt="Tabela 1" src="/files/ftp_upload/4218/4218table1.jpg" /> Tabela 1.Disposição dos tratamentos com drogas sobre uma placa de 24 poços <img src="/files/ftp_upload/4218/4218fig4A.jpg" alt="A Figura 4A" /> A Figura 4A. Ilustração de um método para processar Esferóides 3D para Embedding HistoGel. Um método para processar esferóides 3D para incorporação HistoGel e coloração imuno-histoquímica dos esferóides 3D (A) Uma visão geral de um método para processar esferóides 3D para a incorporação HistoGel. Esferóides 3D foram encapsuladas em um HistoGel de estar no mesmo nível no cryomold biópsia, em seguida, o HistoGel / bloco esferóides foi embrulhado num azul Bio-envoltórios e transferida para uma cassete de biópsia amarelo para inclusão em parafina. <img src="/files/ftp_upload/4218/4218fig4B.jpg" alt="A Figura 4B" /> Figura 4B. H &amp; E Coloração e coloração imuno-histoquímica do dia 17 Esferóides 3D. (B) coloração H &amp; E, coloração imuno-histoquímica de Ki-67 e Clivadas Caspase-3 dos esferóides 17-dia em 3D. O paraffin-incorporados lâminas seccionados foram desparafinizados e recuperação antigênica foi realizada utilizando CCI (solução de células condicionado, Verana Medical System, # 711-065-152). Anticorpo policlonal de coelho Ki-67 de anticorpos (Abcam. # Ab833) e clivado Caspase 3 anticorpo (Cell Signaling Technology, # 9661) foram aplicados a uma concentração de 1:75 e 1:200, respectivamente, durante 1 h à temperatura ambiente. O anticorpo secundário anti-coelho (Jackson Immunolab, # 711-065-152) foi aplicado a 1:500 durante 1 hora à temperatura ambiente, seguido por detecção cromogénico kit DABMap (Ventana Medicai Systems, # 760-124). As lâminas foram contrastadas com hematoxilina e desidratados e limpo antes de lamínulas de xileno.

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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Nós demonstramos um método simples, confiável e reprodutível para formar esferóide multicelular 3D a partir de células tumorais humanas neuroendócrinos utilizando agarose revestidas placas de 24 poços. O sucesso desta técnica é a capacidade de obter um esferóide único com tamanho homogéneo e forma uniforme por dia 6 a partir de um número fixo de células. O passo chave é a agitação lenta da placa com células líquidas para o primeiro hr 16-24 após o plaqueamento. Este método pode também se aplicam ao comum humano da mama linha de células MCF-7, do cólon humano linha celular de adenocarcinoma HT-29, humano de células não pequenas do pulmão linha de células de carcinoma H1299 e linha celular de rim embrionário humano HEK-293. Todos eles podem formar uniformes e compacto esferóides 3D para tela de droga terapêutico (dados não mostrados). Embora vários métodos são relatados na geração de esferóides 3D, 7-10 método aqui relatados não requer placas especializadas ou reagentes e é, portanto, simples e rentável. Nosso demonstrando dados inéditose que a NET esferóides 3D cultivadas em agarose imitar o tumor in vivo xenoenxerto NET geometricamente e molecularmente, quando comparadas com as células em monocamada 2D. Isto é semelhante ao que foi reportado para os esferóides 3D feitos a partir de sobre outras linhas de células de cancro humano. 11,12 limitação do modelo 3D de cultura de células é que ele não pode substituir completamente testar a eficácia in vivo de quaisquer medicamentos ou tratamentos terapêuticos porque os esferóides 3D são como tumores avasculares, que é diferente do de tumor in vivo neste aspecto. No entanto, este método ajudará a ponte e as avaliações da NET drogas terapêuticas a partir de, in vitro, in vivo em alguns aspectos. Coloração de imunofluorescência em esferóides multicelulares é muito difícil de realizar, devido ao grande tamanho e geometria dos esferóides flutuantes 3D e à limitação do microscópio confocal. Aqui temos ilustrar um método para processar a incorporação HistoGel para parafinaincorporação, permitindo coloração imuno-histoquímica das lâminas de série seccionados dos esferóides 3D. Além disso, o nosso costume desenvolvida programa MATLAB ajuda de forma precisa e reprodutível estimar o tamanho dos esferóides, monitorar a eficácia da droga de forma eficiente, e poderia ser incorporada uma tela de alto rendimento para o desenvolvimento de medicamentos para os pacientes NET.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> DMEM/F12 Mídia </td><td> Gibco </td><td> 10565-018 </td><td></td></tr><tr><td> TrypLE </td><td> Gibco </td><td> 12604 </td><td></td></tr><tr><td> Placas de 24 poços </td><td> Falcão </td><td> 353047 </td><td></td></tr><tr><td> 70 filtro de célula mM </td><td> Fisher Scientific </td><td> 22363548 </td><td></td></tr><tr><td> Fita de vedação estéril </td><td> Nunc </td><td> 236366 </td><td></td></tr><tr><td> Tricostatina A </td><td> Sigma </td><td> T8552 </td><td></td></tr><tr><td> Orbital Shaker </td><td> Fisher Scientific </td><td> 11-402-12 </td><td></td></tr></tbody></table>

humanos linhas tumor neuroendócrino de células como um modelo tridimensional para o estudo da terapia de tumores humanos neuroendócrino

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Os tumores neuroendócrinos (TNE) são tumores raros, com incidência de dois por 100, 000 pessoas por ano, e são responsáveis ​​por 0,5% de todos os tumores humanos. 1, com excepção da cirurgia para a minoria dos pacientes que apresentam doença localizada, há benefício de sobrevivência pouco ou nenhum tratamento sistêmico. Por conseguinte, existe uma grande necessidade de uma melhor compreensão da biologia de redes, e em particular definir novos alvos terapêuticos para pacientes com tumores não operáveis ​​ou metastático neuroendócrinos. Cultura de células em 3D está se tornando um método popular para a triagem de drogas devido à sua relevância na modelagem da organização no tecido vivo do tumor e microambiente. 2,3 Os esferóides 3D multicelulares podem fornecer informações valiosas de forma mais rápida e menos dispendiosa do que directamente provenientes de 2D experimentos de cultura de células de animais (camundongos) modelos. Para facilitar a descoberta de novas terapêuticas para pat NETients, desenvolvemos um modelo in vitro esferóides 3D multicelular utilizando as linhas de células humanas NET. As células são plaqueadas NET de uma forma não-adesiva de agarose-revestido placa de 24 cavidades e incubadas sob condições fisiológicas (5% de CO 2, 37 ° C) com uma agitação muito lenta para 16-24 horas após o plaqueamento. As células formam esferóides multicelulares a partir do dia ª 3 ª ou 4. Os esferóides tornar-se mais esférica pelo dia 6 th, ponto em que os tratamentos com drogas são iniciadas. A eficácia dos tratamentos com drogas sobre os esferóides NET é monitorizado com base na morfologia, forma e tamanho dos esferóides com um microscópio de luz de contraste de fase. O tamanho dos esferóides é estimado automaticamente usando um programa desenvolvido personalizado MATLAB baseado num algoritmo contorno activo. Além disso, demonstramos um método simples para processar a incorporação HistoGel sobre estes esferóides 3D, permitindo a utilização de técnicas padrão de histológicas e imuno-histoquímica. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Este é o primeiro relatório sobre a geração de esferóides 3D usando linhas celulares NET para examinar o efeito de drogas terapêuticas. Realizou-se também histologia sobre estes esferóides 3D, e exibido um exemplo de efeito de uma única droga sobre o crescimento e proliferação dos esferóides NET. Nossos resultados confirmam que os esferóides NET são valiosas para futuros estudos de biologia NET e desenvolvimento de medicamentos.

Nós apresentamos uma simples sobreposição de agarose plataforma para crescer 3D esferóides multicelulares utilizando linhas celulares de cancro neuroendócrino. Este método oferece uma maneira muito conveniente para examinar o efeito de drogas terapêuticas sobre as células tumorais neuroendócrinos. Também poderia ajudar-nos a estabelecer humanos esferóides tumor neuroendócrino para terapia de câncer.

Humanos Linhas tumor neuroendócrino de células como um modelo tridimensional para o estudo da terapia de tumores humanos Neuroendócrino

Tumores neuroendócrinos (TNEs) são tumores raros, com uma incidência de dois por 100 000 indivíduos por ano, e representam 0,5% de todos os humanos ...

O objetivo geral do experimento a seguir é desenvolver um método fácil e simples para produzir esteroides tridimensionais uniformes de tumores neuroendócrinos e um método simples para processar a inclusão em HistoGel para o estudo da histologia desses esteroides. Isso é alcançado por meio do revestimento uniforme de placas de 24 poços com aeros, sobre os quais são semeadas células de tumor neuroendócrino humano em suspensão simples de células. Em seguida, a placa é incubada durante a noite em um agitador orbital no incubador, a uma velocidade inferior a 40 RPM, e depois transferida para uma prateleira estável no incubador.Os esferoides serão formados no terceiro ou quarto dia, e seu crescimento e integridade são monitorados por microscopia de contraste de fase para estudar sua histologia. Os esteroides tridimensionais são embutidos em HistoGel aquecido antes do processamento rotineiro em parafina, e os resultados obtidos mostram o crescimento de tumores neuroendócrinos em esteroides tridimensionais com base em imagens capturadas durante a microscopia de contraste de fase. A histologia dos esteroides tridimensionais é analisada por coloração com hematoxilina e eosina (H&E) e por coloração imunohistoquímica de cortes em blocos de parafina dos esteroides tridimensionais.A principal vantagem desta técnica em relação ao método existente é que ela é simples, fácil, confiável e economicamente eficaz. Este método pode facilitar a pesquisa na área de descoberta de fármacos, ajudando a identificar rapidamente medicamentos terapêuticos para pacientes com tumores neuroendócrinos. Em geral, indivíduos novos nesta técnica terão dificuldade inicial, pelo menos, em cultivar esteroides tridimensionais com formato e tamanho uniformes.A chave para isso é garantir que suas placas de 24 poços sejam uniformemente revestidas com agros e também assegurar que suas suspensões de células isoladas estejam bem dispersas e sejam precisas. Para compreender a histologia dos esteroides tridimensionais, precisamos realizar o processamento de parênquima e coloração imunoquímica. A inclusão histológica dos esteroides tridimensionais é a etapa fundamental, que será demonstrada posteriormente hoje. Para preparar 1% de augurs para revestimento de placas de 24 poços, adicione um grama de aeros a 100 mililitros de água desionizada em um frasco de 250 a 500 mililitros e autoclave para esterilizar o aeros após a esterilização.Transfira o frasco para um banho-maria a 70 graus Celsius por cerca de uma hora. Para que os aeros esfriem a 70 graus Celsius, eles devem ser mantidos estéreis em todos os momentos. Em uma cabine de segurança biológica, use uma pipeta repetidora para dispensar 200 microlitros de aeros em cada poço de 2 24.Placas de fundo plano para este protocolo. Qualquer tipo de placa de fundo plano de 24 poços funcionará, desde que as placas possam ser visualizadas em um microscópio de contraste de fase; gire suavemente o aeros ao redor do poço para garantir uma cobertura uniforme. 200 microlitros de aeros são ideais para formar uma superfície côncava, permitindo que o esferoide adquira formas esféricas consistentes.Após cerca de 10 minutos, as placas de 24 poços revestidas com aeros estão prontas para serem utilizadas. As células bon one utilizadas neste experimento são células tumorais neuroendócrinas pancreáticas humanas, ou células NET, mantidas em meio D-M-E-M-F 12 com 10% de FBS, em uma placa de cultura de tecidos estéril, em incubadora úmida a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Quando as células bon one em monocamada atingem 70 a 80% de confluência, suspensões de células únicas são preparadas em uma cabine de segurança biológica.Remova o meio e lave as células com PBS duas vezes, desprenda as células do recipiente adicionando um mililitro de tripsina e incubando a 37 graus Celsius por cinco minutos. Verifique ao microscópio para confirmar que todas as células foram destacadas do recipiente e então adicione nove mililitros de meio de crescimento à tripsina.Pipete as células oculares para cima e para baixo algumas vezes para garantir uma suspensão uniforme de células isoladas. Utilize um filtro de células de 70 micrômetros para filtrar as células. Após realizar a contagem celular, colete as células filtradas e prepare uma suspensão de 5.000 células por mililitro em D-M-E-M-F 12 com meio de crescimento contendo 10% de FBS.O número de células a ser semeado deve ser determinado empiricamente com base no tamanho das esferas no sexto dia. Idealmente, deseja-se obter um tamanho entre 300 e 400 nanômetros de diâmetro. Por essa razão, semeamos mil células por 200 microlitros por poço.Para iniciar este procedimento, sobreponha 200 microlitros da suspensão de células isoladas em cada poço revestido com aero das placas de 24 poços previamente preparadas e feche as placas de 24 poços com fita adesiva estéril para prevenir evaporação. Coloque as placas de 24 poços revestidas com aero contendo células bon uma em um agitador orbital com agitação muito lenta em um incubador umidificado a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono no ar, incube durante a noite e, na manhã seguinte, transfira as placas para uma plataforma estável e mantenha os cultivos em crescimento no incubador. A cada três dias.Adicione 200 microlitros de meio de crescimento a cada poço das placas. Para evitar perturbar o phe, encoste a ponteira da pipeta na parede do poço e deixe o meio escorrer pela parede até o interior do poço. Monitore a formação de OID nas placas de 24 poços sob microscópio. O tratamento farmacológico dos esteroides 3D é iniciado no sexto dia de cultivo.Quando os esferoides possuem cerca de 300 a 400 mícrons de diâmetro, isso é considerado o dia zero para o tratamento com fármaco no dia seis. Cada poço das placas contém cerca de 400 microlitros de meio para garantir que os tratamentos com fármacos tenham uma concentração final de um x em cada poço; para cada dose de tratamento, prepare a solução três vezes mais concentrada, diluindo a quantidade apropriada do estoque do fármaco em cinco mililitros de meio de crescimento em um tubo cônico de 15 mililitros, o que é suficiente para oito repetições. Os PHE em cada linha das placas de 24 poços são caracterizados como veículo e doses 1, 2, 3, 4 e 5. Há quatro repetições para cada dose de tratamento em cada placa de 24 poços.Normalmente, os phe 3D são tratados em pelo menos 2 placas de 24 poços, resultando em pelo menos oito réplicas para cada dose do tratamento. Antes de adicionar o tratamento a cada poço, centrifugar as placas de 24 poços para garantir que toda a condensação presente na fita superior desça para o poço, devido à característica de flutuação do esteroide 3D. O meio em cada poço não é removido após a centrifugação.Para evitar a perturbação da esferoide, adicione cuidadosamente 200 microlitros de cada dose do tratamento nos poços apropriados ao longo da parede de cada um. Selo bem as placas de 24 poços com fita adesiva e incube as culturas em um incubador umidificado a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono no ar. Monitore as culturas tridimensionais com esteroides em cada ponto temporal escolhido após o tratamento com fármaco utilizando um microscópio de contraste de fase.Um objetivo de 5x é ideal porque os EFP crescem rapidamente além do campo de imagem com um objetivo de 10x. Adquira imagens do organoide em cada poço em cada ponto temporal antes do HistoGel. Os organoides tridimensionais são coletados das placas de 24 poços e fixados em Formol 10% após o encapsulamento.Coloque um tubo de HistoGel frio em um béquer contendo água. Aqueça o béquer em um micro-ondas por um minuto ou até que o gel esteja completamente liquefeito. Mantenha o tubo no mesmo béquer com água durante toda a duração do procedimento.Usando uma pipeta plástica descartável, transfira todo o esteroide para um molde criogênico para biópsia. Deixe o esteroide repousar por um minuto para que se deposi te no fundo do molde criogênico para biópsia.Tente remover o líquido do molde criogênico da biópsia com lenços de papel Kim. Empurre suavemente o esteroide para o centro na base do molde criogênico da biópsia usando um palito. Em seguida, utilize a pipeta de Pasteur para manter suavemente o esteroide no centro do molde criogênico da biópsia.Adicione uma fina camada de HistoGel aquecido ao molde criogênico para biópsia. Não adicione HistoGel em excesso. Apenas o suficiente para estabilizar os esteroides no centro.Deixe o esteroide no HistoGel repousar por um a dois minutos à temperatura ambiente ou até que o HistoGel esteja completamente solidificado. Complete o restante da matriz criogênica para biópsia com HistoGel aquecido e deixe solidificar à temperatura ambiente por cerca de 10 minutos. Imediatamente antes de remover o bloco de HistoGel com os OIDs da matriz criogênica para biópsia.Deixe o molde de congelação sobre gelo por um minuto, depois retire o bloco intacto de HistoGel com o esteroide. Envolva o bloco em um pedaço de filme plástico e coloque-o em um cassete para tecidos e biópsias. Armazene o cassete com tecido e biópsia em um recipiente com etanol a 70%.Posteriormente, são realizados procedimentos rotineiros de processamento de tecidos para inclusão em parafina quando cultivados em placas de 24 poços codificadas como aeros. Diferentes linhagens celulares de net apresentam morfologias distintas, conforme observado aqui. A linhagem celular de net pancreático humano bond one e a linhagem celular de net pulmonar humano H 7 27 formaram esteroides tridimensionais.Em contraste, qgp um. Células pancreáticas humanas formam grandes massas porosas semelhantes a uvas, que não são consideradas esteroides. Após o plaqueamento das células um em placa de 24 poços revestida com agros, a formação multicelular de esteroides ocorre tipicamente no terceiro ou quarto dia, e os esteroides tornam-se mais arredondados até o sexto dia.Devido à limitação de nutrientes e oxigênio, as células no núcleo denso do esteroide começam a morrer por volta do dia 10 e, no dia 17, os esteroides começam a se desintegrar. Devido ao grande tamanho ou, em alguns casos, à expulsão do cordão necrótico, o esteroide normalmente pode crescer até 1000 micrômetros de diâmetro.Neste experimento, os esteroides tridimensionais do sexto dia foram escolhidos como ponto inicial para o tratamento com o inibidor da desacetilase de histona triques estatina A ou TSA. Relatou-se anteriormente que os inibidores da desacetilase de histona exibem efeitos antiproliferativos e pró-apoptóticos sobre células-tronco. Essas imagens acompanham a morfologia dos esteroides tridimensionais no início do tratamento e após 24, 48, 72 e 96 horas.V indica tratamento com o veículo, que neste caso é DMSO. D um a D cinco representam tratamento com doses crescentes de TSA do tamanho de cada indivíduo. OID foi estimado automaticamente por um programa de computador personalizado desenvolvido em MATLAB.Pelo menos oito esferoides foram medidos por dose do tratamento com TSA em cada ponto temporal, e os resultados são representados neste gráfico em relação ao veículo. Todas as doses de TSA mostraram algum grau de inibição do crescimento em OID tridimensionais. Nas concentrações de TSA de 125 nanomolar e 250 nanomolar, o crescimento de esteroides tridimensionais foi fortemente suprimido para compreender a histologia do esteroide tridimensional residual.A coloração H e E e a coloração imuno-histoquímica foram realizadas em esteroides tridimensionais cultivados por 17 dias. A proteína KI 67 é um marcador de células proliferativas, enquanto a caspase 3 clivada é um marcador de células apoptóticas. Os resultados indicam que as células da camada externa do esteroide tridimensional estão ativamente proliferando, mas as células no interior do núcleo são predominantemente necróticas ou apoptóticas.Após este procedimento, ensaios adicionais, como o ensaio cell titer glow, podem ser realizados para determinar a viabilidade celular desses esteroides 3D. Após seu desenvolvimento, esta técnica pode ser estendida a placas de 96 poços para realizar triagens de alto rendimento, o que facilitará a descoberta de fármacos terapêuticos na pesquisa do câncer.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Heterotípica tridimensional<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelagem de Estroma-epitelial de ovário Interações durante o início e progressão do câncer

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Humanos Linhas tumor neuroendócrino de células como um modelo tridimensional para o estudo da terapia de tumores humanos Neuroendócrino (Vídeo) | JoVE Journal

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