Humanos Linhas tumor neuroendócrino de células como um modelo tridimensional para o estudo da terapia de tumores humanos Neuroendócrino

O objetivo geral do experimento a seguir é desenvolver um método fácil e simples para produzir esteroides tridimensionais uniformes de tumores neuroendócrinos e um método simples para processar a inclusão em HistoGel para o estudo da histologia desses esteroides. Isso é alcançado por meio do revestimento uniforme de placas de 24 poços com aeros, sobre os quais são semeadas células de tumor neuroendócrino humano em suspensão simples de células. Em seguida, a placa é incubada durante a noite em um agitador orbital no incubador, a uma velocidade inferior a 40 RPM, e depois transferida para uma prateleira estável no incubador.

Os esferoides serão formados no terceiro ou quarto dia, e seu crescimento e integridade são monitorados por microscopia de contraste de fase para estudar sua histologia. Os esteroides tridimensionais são embutidos em HistoGel aquecido antes do processamento rotineiro em parafina, e os resultados obtidos mostram o crescimento de tumores neuroendócrinos em esteroides tridimensionais com base em imagens capturadas durante a microscopia de contraste de fase. A histologia dos esteroides tridimensionais é analisada por coloração com hematoxilina e eosina (H&E) e por coloração imunohistoquímica de cortes em blocos de parafina dos esteroides tridimensionais.

A principal vantagem desta técnica em relação ao método existente é que ela é simples, fácil, confiável e economicamente eficaz. Este método pode facilitar a pesquisa na área de descoberta de fármacos, ajudando a identificar rapidamente medicamentos terapêuticos para pacientes com tumores neuroendócrinos. Em geral, indivíduos novos nesta técnica terão dificuldade inicial, pelo menos, em cultivar esteroides tridimensionais com formato e tamanho uniformes.

A chave para isso é garantir que suas placas de 24 poços sejam uniformemente revestidas com agros e também assegurar que suas suspensões de células isoladas estejam bem dispersas e sejam precisas. Para compreender a histologia dos esteroides tridimensionais, precisamos realizar o processamento de parênquima e coloração imunoquímica. A inclusão histológica dos esteroides tridimensionais é a etapa fundamental, que será demonstrada posteriormente hoje. Para preparar 1% de augurs para revestimento de placas de 24 poços, adicione um grama de aeros a 100 mililitros de água desionizada em um frasco de 250 a 500 mililitros e autoclave para esterilizar o aeros após a esterilização.

Transfira o frasco para um banho-maria a 70 graus Celsius por cerca de uma hora. Para que os aeros esfriem a 70 graus Celsius, eles devem ser mantidos estéreis em todos os momentos. Em uma cabine de segurança biológica, use uma pipeta repetidora para dispensar 200 microlitros de aeros em cada poço de 2 24.

Placas de fundo plano para este protocolo. Qualquer tipo de placa de fundo plano de 24 poços funcionará, desde que as placas possam ser visualizadas em um microscópio de contraste de fase; gire suavemente o aeros ao redor do poço para garantir uma cobertura uniforme. 200 microlitros de aeros são ideais para formar uma superfície côncava, permitindo que o esferoide adquira formas esféricas consistentes.

Após cerca de 10 minutos, as placas de 24 poços revestidas com aeros estão prontas para serem utilizadas. As células bon one utilizadas neste experimento são células tumorais neuroendócrinas pancreáticas humanas, ou células NET, mantidas em meio D-M-E-M-F 12 com 10% de FBS, em uma placa de cultura de tecidos estéril, em incubadora úmida a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Quando as células bon one em monocamada atingem 70 a 80% de confluência, suspensões de células únicas são preparadas em uma cabine de segurança biológica.

Remova o meio e lave as células com PBS duas vezes, desprenda as células do recipiente adicionando um mililitro de tripsina e incubando a 37 graus Celsius por cinco minutos. Verifique ao microscópio para confirmar que todas as células foram destacadas do recipiente e então adicione nove mililitros de meio de crescimento à tripsina.

Pipete as células oculares para cima e para baixo algumas vezes para garantir uma suspensão uniforme de células isoladas. Utilize um filtro de células de 70 micrômetros para filtrar as células. Após realizar a contagem celular, colete as células filtradas e prepare uma suspensão de 5.000 células por mililitro em D-M-E-M-F 12 com meio de crescimento contendo 10% de FBS.

O número de células a ser semeado deve ser determinado empiricamente com base no tamanho das esferas no sexto dia. Idealmente, deseja-se obter um tamanho entre 300 e 400 nanômetros de diâmetro. Por essa razão, semeamos mil células por 200 microlitros por poço.

Para iniciar este procedimento, sobreponha 200 microlitros da suspensão de células isoladas em cada poço revestido com aero das placas de 24 poços previamente preparadas e feche as placas de 24 poços com fita adesiva estéril para prevenir evaporação. Coloque as placas de 24 poços revestidas com aero contendo células bon uma em um agitador orbital com agitação muito lenta em um incubador umidificado a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono no ar, incube durante a noite e, na manhã seguinte, transfira as placas para uma plataforma estável e mantenha os cultivos em crescimento no incubador. A cada três dias.

Adicione 200 microlitros de meio de crescimento a cada poço das placas. Para evitar perturbar o phe, encoste a ponteira da pipeta na parede do poço e deixe o meio escorrer pela parede até o interior do poço. Monitore a formação de OID nas placas de 24 poços sob microscópio. O tratamento farmacológico dos esteroides 3D é iniciado no sexto dia de cultivo.

Quando os esferoides possuem cerca de 300 a 400 mícrons de diâmetro, isso é considerado o dia zero para o tratamento com fármaco no dia seis. Cada poço das placas contém cerca de 400 microlitros de meio para garantir que os tratamentos com fármacos tenham uma concentração final de um x em cada poço; para cada dose de tratamento, prepare a solução três vezes mais concentrada, diluindo a quantidade apropriada do estoque do fármaco em cinco mililitros de meio de crescimento em um tubo cônico de 15 mililitros, o que é suficiente para oito repetições. Os PHE em cada linha das placas de 24 poços são caracterizados como veículo e doses 1, 2, 3, 4 e 5. Há quatro repetições para cada dose de tratamento em cada placa de 24 poços.

Normalmente, os phe 3D são tratados em pelo menos 2 placas de 24 poços, resultando em pelo menos oito réplicas para cada dose do tratamento. Antes de adicionar o tratamento a cada poço, centrifugar as placas de 24 poços para garantir que toda a condensação presente na fita superior desça para o poço, devido à característica de flutuação do esteroide 3D. O meio em cada poço não é removido após a centrifugação.

Para evitar a perturbação da esferoide, adicione cuidadosamente 200 microlitros de cada dose do tratamento nos poços apropriados ao longo da parede de cada um. Selo bem as placas de 24 poços com fita adesiva e incube as culturas em um incubador umidificado a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono no ar. Monitore as culturas tridimensionais com esteroides em cada ponto temporal escolhido após o tratamento com fármaco utilizando um microscópio de contraste de fase.

Um objetivo de 5x é ideal porque os EFP crescem rapidamente além do campo de imagem com um objetivo de 10x. Adquira imagens do organoide em cada poço em cada ponto temporal antes do HistoGel. Os organoides tridimensionais são coletados das placas de 24 poços e fixados em Formol 10% após o encapsulamento.

Coloque um tubo de HistoGel frio em um béquer contendo água. Aqueça o béquer em um micro-ondas por um minuto ou até que o gel esteja completamente liquefeito. Mantenha o tubo no mesmo béquer com água durante toda a duração do procedimento.

Usando uma pipeta plástica descartável, transfira todo o esteroide para um molde criogênico para biópsia. Deixe o esteroide repousar por um minuto para que se deposi te no fundo do molde criogênico para biópsia.

Tente remover o líquido do molde criogênico da biópsia com lenços de papel Kim. Empurre suavemente o esteroide para o centro na base do molde criogênico da biópsia usando um palito. Em seguida, utilize a pipeta de Pasteur para manter suavemente o esteroide no centro do molde criogênico da biópsia.

Adicione uma fina camada de HistoGel aquecido ao molde criogênico para biópsia. Não adicione HistoGel em excesso. Apenas o suficiente para estabilizar os esteroides no centro.

Deixe o esteroide no HistoGel repousar por um a dois minutos à temperatura ambiente ou até que o HistoGel esteja completamente solidificado. Complete o restante da matriz criogênica para biópsia com HistoGel aquecido e deixe solidificar à temperatura ambiente por cerca de 10 minutos. Imediatamente antes de remover o bloco de HistoGel com os OIDs da matriz criogênica para biópsia.

Deixe o molde de congelação sobre gelo por um minuto, depois retire o bloco intacto de HistoGel com o esteroide. Envolva o bloco em um pedaço de filme plástico e coloque-o em um cassete para tecidos e biópsias. Armazene o cassete com tecido e biópsia em um recipiente com etanol a 70%.

Posteriormente, são realizados procedimentos rotineiros de processamento de tecidos para inclusão em parafina quando cultivados em placas de 24 poços codificadas como aeros. Diferentes linhagens celulares de net apresentam morfologias distintas, conforme observado aqui. A linhagem celular de net pancreático humano bond one e a linhagem celular de net pulmonar humano H 7 27 formaram esteroides tridimensionais.

Em contraste, qgp um. Células pancreáticas humanas formam grandes massas porosas semelhantes a uvas, que não são consideradas esteroides. Após o plaqueamento das células um em placa de 24 poços revestida com agros, a formação multicelular de esteroides ocorre tipicamente no terceiro ou quarto dia, e os esteroides tornam-se mais arredondados até o sexto dia.

Devido à limitação de nutrientes e oxigênio, as células no núcleo denso do esteroide começam a morrer por volta do dia 10 e, no dia 17, os esteroides começam a se desintegrar. Devido ao grande tamanho ou, em alguns casos, à expulsão do cordão necrótico, o esteroide normalmente pode crescer até 1000 micrômetros de diâmetro.

Neste experimento, os esteroides tridimensionais do sexto dia foram escolhidos como ponto inicial para o tratamento com o inibidor da desacetilase de histona triques estatina A ou TSA. Relatou-se anteriormente que os inibidores da desacetilase de histona exibem efeitos antiproliferativos e pró-apoptóticos sobre células-tronco. Essas imagens acompanham a morfologia dos esteroides tridimensionais no início do tratamento e após 24, 48, 72 e 96 horas.

V indica tratamento com o veículo, que neste caso é DMSO. D um a D cinco representam tratamento com doses crescentes de TSA do tamanho de cada indivíduo. OID foi estimado automaticamente por um programa de computador personalizado desenvolvido em MATLAB.

Pelo menos oito esferoides foram medidos por dose do tratamento com TSA em cada ponto temporal, e os resultados são representados neste gráfico em relação ao veículo. Todas as doses de TSA mostraram algum grau de inibição do crescimento em OID tridimensionais. Nas concentrações de TSA de 125 nanomolar e 250 nanomolar, o crescimento de esteroides tridimensionais foi fortemente suprimido para compreender a histologia do esteroide tridimensional residual.

A coloração H e E e a coloração imuno-histoquímica foram realizadas em esteroides tridimensionais cultivados por 17 dias. A proteína KI 67 é um marcador de células proliferativas, enquanto a caspase 3 clivada é um marcador de células apoptóticas. Os resultados indicam que as células da camada externa do esteroide tridimensional estão ativamente proliferando, mas as células no interior do núcleo são predominantemente necróticas ou apoptóticas.

Após este procedimento, ensaios adicionais, como o ensaio cell titer glow, podem ser realizados para determinar a viabilidade celular desses esteroides 3D. Após seu desenvolvimento, esta técnica pode ser estendida a placas de 96 poços para realizar triagens de alto rendimento, o que facilitará a descoberta de fármacos terapêuticos na pesquisa do câncer.