Name: piggyBac modificação do sistema Transposon de células T primárias Humanos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: Aprenda a modificar geneticamente células T humanas primárias usando o sistema de transposon piggyBac não viral. Este método permite expressão estável de transgenes para aplicações terapêuticas em imunologia.

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SS é apoiado em parte pela Med HHMI em Grad Formação Grant através do Programa TBMM. MHW é suportado, em parte, por um prêmio de desenvolvimento de carreira do Departamento de Assuntos de Veteranos eo generoso apoio do Dr. Harold e Sra. M. Selzman. Este trabalho também foi apoiado em parte por linfoma NIH SPORE concessão P50CA126752 e R01 NIH DK093660.

Dia 0 1. Isolamento de PBMCs a partir de Sangue Humano <ol><li> Recolher 20 ml de sangue humano fresco, utilizando a punção venosa em tubos Vacutainer Na-heparina. </li><li> Mix de sangue e Avançado RPMI 1640 em 01:01 (v / v) a relação. </li><li> Adicionam-se 20 ml de meio de Lymphoprep num tubo de centrifugação de 50 ml (25 ° C). Lentamente camada 25-30 ml de RPMI-1640 de sangue mistura no topo da Lymphoprep. </li><li> Centrifugar a 400 xg durante 40 min sem freios. </li><li> Recolher as duas camadas distintas e difusa utilizando uma pipeta descartável, em 10 ml de PBS 1x (25 ° C) e perfazer o volume até 50 ml com PBS 1x. </li><li> Centrifugar a 450 xg durante 10 min. </li><li> Aspirar o sobrenadante completamente e adicione 20 ml de RPMI 1640 Avançado. </li><li> Centrifugar a 400 xg durante 5 min. </li><li> Aspirar o sobrenadante. Adicionar 10 mL de meio de células T completo suplementado com 5 ng / ml de rhIL-15 pré-aquecido a 37 ° C. </li><li> Contar o número de células e a placa de cultura de uma camada de tecido de 24 poçosed placa a 2 x 10 6 células / cavidade em meios completos de células T suplementado com 5 ng / ml de rhIL-15 Adiciona-se água estéril para poços adjacentes. Incubar durante a noite numa incubadora humidificada a 37 ° C, 5% CO 2. </li></ol> Dia 1 2. Placas de revestimento com anticorpo anti-CD28 e anti-CD3 para estimular as células T <ol><li> Diluir os anticorpos anti-CD28 e anti-CD3 em água estéril a uma concentração de 1 ug / ml cada um. </li><li> Adicionar 500 ul de solução de anticorpo a cada 5 poços marcados de uma cultura de tecido não revestido 24 placa bem. </li><li> Adicionar água estéril para descansar dos poços. Enrole a placa no envoltório do psiquiatra e coloque na geladeira a 4 ° C. </li></ol> 3. Nucleofection de não estimuladas Células T <ol><li> Pré-aquecer media de células T a 37 ° C e com suplemento de 5 ng / ml de rhIL-15. Preparar a solução de Nucleofector completa por adição de 500 ul de suplemento Nucleofector 1-2,25 ml de solução de Nucleofector. </li><li> Aug liquot 5 cada um dos transposões (Zeo-pT-CMV-eGFP) e transposase (pCMV-piggyBac) num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml Nota:. pode ser necessário optimizar a transposase e transposon quantidade de ADN para entrega do gene óptima e para minimizar toxicidade celular. Os plasmídeos podem ser obtidos a partir dos autores, a pedido. </li><li> PBMCs de colheita a partir da placa de cultura de tecido 24 bem para um tubo de 50 ml. Contar o número de células. Salvar 2 x 10 6 células para utilização como controlo durante a citometria de fluxo. </li><li> Adicionar 7-10 x 10 6 células para um tubo de 15 ml e centrifugar a 400 xg, 5 min, o sobrenadante aspirado e dedo-flick o sedimento. </li><li> Adicionar 100 ul de solução de T nucleofection célula completa para afrouxado pellet celular. </li><li> Adicionar a mistura de solução de células para o tubo contendo os plasmídeos. </li><li> Adicionar a mistura de solução de células-plasmídeo para a parte inferior da tina nucleofection. Tenha cuidado para não introduzir quaisquer bolhas. </li><li> Nucleofect as células utilizando program U-014 (células não estimuladas, T humanos, <a href="http://bio.lonza.com/resources/product-instructions/protocols/" target="_blank">http://bio.lonza.com/resources/product-instructions/protocols/</a> ). </li><li> Imediatamente adicionar 500 ul de meio pré-aquecido com rhIL-15 para a cuvete. Transferir as células para um poço de uma placa de 24 poços com 1,5 ml de meio pré-aquecido com rhIL15. </li><li> Incubar durante a noite numa incubadora humidificada a 37 ° C, 5% CO 2. </li></ol> Dia 2 4. Estimulação não específica das células T <ol><li> Colheita de células e determinar o número de células. Separe 0,5 x 10 6 células por citometria de fluxo para determinar a frequência de células positivas para GFP-. Use as CMSPs não transfectadas como controlo. </li><li> Aspirar a solução de anticorpo a partir do CD3/28 placa de cultura de tecido não revestido e lave cada cavidade com meio de células T. </li><li> Ressuspender as células em nucleofected 0,5 x 10 6 células por ml em meio de CTL completassuplementado com 5 ng / ml de rhIL-15. Adicionar 2,0 ml de cada uma das células nucleofected em quatro cavidades da placa de cultura de tecido não. Adicionar 0,5 x 10 6 células não nucleofected para o dia 5 de bem. </li><li> Incubar durante 3 dias numa incubadora humidificada a 37 ° C, 5% CO 2. </li></ol> Dia 5 <ol><li> Colheita das células T estimuladas a partir da placa de cultura de tecido não revestido. </li><li> Contagem e replate as células numa placa de cultura de 24 poços revestidos com tecido menos 0,7 x 10 6 células / ml em meio de células T com 5 ng / ml de IL-15. </li></ol> Dia 7 7. Análise da Expressão do Gene <ol><li> Células de colheita e coram com anti-anticorpo humano CD8 (poderia também usar anti-CD3 e anti-CD4) e análise por citometria de fluxo para a expressão de GFP%. </li></ol> Dia 8 (Opcional) 8. Expansão de células T <ol><li> No dia 8 após a transfecção, as células T podem ser novamente plaqueadas em T-Cell media com IL-15 a uma densidade de 0,7 x 10 6 células por poço de uma nova expansão 16. </li></ol>

<ol><li>Cary, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon+mutagenesis+of+baculoviruses%3A+analysis+of+Trichoplusia+ni+transposon+IFP2+insertions+within+the+FP-locus+of+nuclear+polyhedrosis+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Transposon mutagenesis of baculoviruses: analysis of Trichoplusia ni transposon IFP2 insertions within the FP-locus of nuclear polyhedrosis viruses.</a> Virology. 172 (1), 156(1989).</li>
<li>Fraser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+for+movement+of+Lepidopteran+transposon+IFP2+in+insect+cells+using+a+baculovirus+genome+as+a+target+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Assay for movement of Lepidopteran transposon IFP2 in insect cells using a baculovirus genome as a target DNA.</a> Virology. 211 (2), 397(1995).</li>
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<li>Saridey, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PiggyBac+transposon-based+inducible+gene+expression+in+vivo+after+somatic+cell+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">PiggyBac transposon-based inducible gene expression in vivo after somatic cell gene transfer.</a> Mol. Ther. 17 (12), 2115(2009).</li>
<li>Nakanishi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piggyBac+transposon-mediated+long-term+gene+expression+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">piggyBac transposon-mediated long-term gene expression in mice.</a> Mol. Ther. 18 (4), 707(2010).</li>
<li>Wilson, M. H., Coates, C. J., George, A. L. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PiggyBac+Transposon-mediated+Gene+Transfer+in+Human+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">PiggyBac Transposon-mediated Gene Transfer in Human Cells.</a> Mol. Ther. 15 (1), 139(2007).</li>
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<li>Doherty, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperactive+piggyBac+gene+transfer+in+human+cells+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Hyperactive piggyBac gene transfer in human cells and in vivo.</a> Hum. Gene Ther. , In Press (2011).</li>
<li>Yusa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hyperactive+piggyBac+transposase+for+mammalian+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (4), 1531(2011).</li>
<li>Bonini, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+modification+of+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Blood+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">Genetic modification of T cells.</a> Biol. Blood Marrow Transplant. 17, Suppl 1. S15-S20 (2011).</li>
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<li>Galvan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mapping+of+PiggyBac+transposon+integrations+in+primary+human+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunother%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mapping of PiggyBac transposon integrations in primary human T cells.</a> J. Immunother. 32 (8), 837(2009).</li>
<li>Nakazawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PiggyBac-Mediated+Cancer+Immunotherapy+Using+EBV-Specific+Cytotoxic+T-Cells+Expressing+HER2-Specific+Chimeric+Antigen+Receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">PiggyBac-Mediated Cancer Immunotherapy Using EBV-Specific Cytotoxic T-Cells Expressing HER2-Specific Chimeric Antigen Receptor.</a> Mol. Ther. 19 (12), 2133(2011).</li>
<li>Huye, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+mTor+Inhibitors+With+Rapamycin-resistant+T+Cells%3A+A+Two-pronged+Approach+to+Tumor+Elimination%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Combining mTor Inhibitors With Rapamycin-resistant T Cells: A Two-pronged Approach to Tumor Elimination.</a> Mol. Ther. 19 (12), 2239(2011).</li>
<li>Vera, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+production+of+antigen-specific+T+cells+for+preclinical+and+clinical+applications+using+gas-permeable+rapid+expansion+cultureware+%28G-Rex%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunother%22%5BJournal%5D)">Accelerated production of antigen-specific T cells for preclinical and clinical applications using gas-permeable rapid expansion cultureware (G-Rex).</a> J. Immunother. 33 (3), 305(2010).</li>
<li>Kahlig, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+transposon-mediated+stable+gene+transfer+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Multiplexed transposon-mediated stable gene transfer in human cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (4), 1343(2010).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O método aqui descrito permite a modificação de transgene estável primárias linfócitos T humanos. Temos anteriormente testado o uso do sistema de transposon piggyBac para modificar as células T para expressar um gene repórter (por mais de 4 semanas), um gene suicida não imunogénica, um receptor do antigénio quimérico para uma imunoterapia adoptiva (por mais de 100 dias), e de projetar a resistência a medicamentos imunossupressores 7,13-15. Non-viral modificação de células T para a imunoterapia adopti...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> Lympholyte </td><td> Cedarlane </td><td> CL5015 </td><td></td></tr><tr><td> Avançado RPMI 1640 </td><td> LifeTechnologies </td><td> 12633020 </td><td></td></tr><tr><td> De soro fetal bovino Hyclone </td><td> Fisher Scientific </td><td> SH3008803 </td><td></td></tr><tr><td> GlutaMAX-I Suplemento </td><td> LifeTechnologies </td><td> 35050-061 </td><td></td></tr><tr><td> IL-15 humana recombinante Protein </td><td> eBioscience </td><td> 14-8159 </td><td></td></tr><tr><td> EndoFree Plasmid Maxi Kit </td><td> Qiagen </td><td> 12362 </td><td></td></tr><tr><td> Amaxa Nucleofector </td><td> Lonza </td><td> AAD-1001S </td><td> &amp; Nbsp; </td></tr><tr><td> Human T Cell do Nucleofector Kit </td><td> Lonza </td><td> VPA-1002 </td><td></td></tr><tr><td> CD8-APC </td><td> Southern Biotech </td><td> 9536-11 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-CD3 Humano </td><td> eBioscience </td><td> 16-0037-81 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-CD28 humano </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555725 </td><td></td></tr><tr><td> Placa 24 Cultura de Tecidos Bem tratada </td><td> BD Falcon </td><td> 353047 </td><td></td></tr><tr><td> 24 Cultura de Tecidos Bem Não Tratada Placa </td><td> BD Falcon </td><td> 351147 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Completa de células T mídia composição 1x avançada RPMI 1640 5% de calor soro bovino fetal inactivado 2 mM GlutamaxIM-I </td></tr></tbody></table>

piggybac modificação do sistema transposon de células t primárias humanos

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

O piggyBac sistema transposon é naturalmente ativo, originalmente derivado da 1,2 repolho traça looper. Este sistema não-viral é o plasmídeo com base, mais comumente utilizando dois plasmídeos com uma expressão da enzima transposase piggyBac e um transposon plasmídeo que alberga o gene (s) de interesse entre os elementos de repetição invertidos, que são necessários para a actividade de transferência de genes. PiggyBac medeia a transferência de genes através um &quot;corta e cola&quot; o mecanismo através do qual se integra o segmento transposase do transposão no genoma da célula alvo (s) de interesse. piggyBac demonstrou actividade a entrega eficiente de genes em uma ampla variedade de 1,2 insectos, mamíferos 3-5, e humana cells6 incluindo células T primárias humanos 7,8. Recentemente, uma transposase piggyBac hiperactivo foi gerada a melhoria da eficiência de transferência de genes 9,10. Os linfócitos T humanos são de intere clínicoª para a imunoterapia adoptiva de câncer 11. De nota, o primeiro ensaio clínico envolvendo transposon modificação de células T humanas utilizando o sistema de transposon Sleeping beauty foi aprovado 12. Temos anteriormente avaliaram a utilidade de piggyBac como metodologia não virais para a modificação genética de células T humanas. Encontrámos piggyBac ser eficientes na modificação genética de células T humanas com um gene repórter e um não-imunogénico gene suicida induzível 7. Análise de locais de integração genómicos revelou uma falta de preferência para integração em ou perto de proto-oncogenes conhecidos 13. Usamos a piggyBac gene-modificam linfócitos T citotóxicos para transportar um receptor do antigénio quimérico dirigido contra o antigénio de tumor HER2, e descobriram que as células T modificadas gene-alvo mediada por morte de HER2-positivos de células tumorais in vitro e in vivo num modelo de rato ortotópico 14. Temos também utilizado piggyBacpara gerar células T humanas resistentes a rapamicina, que devem ser úteis em terapias de cancro em que a rapamicina é utilizada 15. Relata-se um método para utilizar piggyBac para modificar geneticamente células T primárias humanas. Isto inclui o isolamento de células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) a partir de sangue humano, seguido por cultura, a modificação do gene, e a activação das células T. Para efeitos do presente relatório, as células T foram modificados com um gene repórter (eGFP), para análise e quantificação da expressão de genes através de citometria de fluxo. PiggyBac pode ser usado para modificar células T humanas com uma variedade de genes de interesse. Apesar de termos usados ​​piggyBac para dirigir as células T a antigénios de tumor 14, também foram utilizados piggyBac para adicionar um interruptor de segurança induzível de modo a eliminar as células de genes modificados, se necessário 7. A capacidade de carga de grande piggyBac também permitiu a transferência de genes deuma grande molécula de rapamicina mTOR resistente (15 kb) 15. Por conseguinte, apresenta-se uma metodologia não-viral para estável gene modificação de células T primárias humanas para uma grande variedade de finalidades.

Um diagrama esquemático mostrando as etapas na modificação genética de linfócitos T humanos com um gene repórter (eGFP) é mostrado na Figura 1. Estes plasmídeos estão disponíveis mediante solicitação dos autores. A schemtic demonstrando as etapas geneticamente modificados linfócitos T humanos com um gene repórter (eGFP) é showin na Figura 2. É necessário para activar as células T, a fim de levá-los a dividir, expandir e propagar em cultura. Modificados células T humanas foram então cult...

Descreve-se um método para modificar geneticamente células T primárias humanas com um transgene, utilizando o não-viral<em&gt; PiggyBac</em&gt; Sistema de transposon. As células T modificado para utilizar o<em&gt; PiggyBac</em&gt; Transposon sistema mostra a expressão do transgene estável.

piggyBac modificação do sistema Transposon de células T primárias Humanos

O sistema de transposon piggyBac é naturalmente ativo, derivado originalmente da mariposa do looper da couve1,2. Este sistema não viral é baseado em plasmídeos, a maioria...

O objetivo geral deste procedimento é modificar geneticamente de forma estável linfócitos T humanos primários com um sistema de transposon não viral. Primeiro, colete sangue humano e, em seguida, isole as células mononucleares do sangue periférico, procedendo à nucleofecção dos PBMCs com o sistema de transposon piggyBac e um transgene de interesse, como a EGFP. Em seguida, estimule os linfócitos T a proliferarem em cultura.Em seguida, analise os linfócitos T quanto à expressão do transgene. Em última análise, a análise por citometria de fluxo é utilizada para demonstrar a expressão estável do transgene em linfócitos T modificados com o sistema de transposição piggyback. Diferentemente da transfeção por plasmídeo em linfócitos T humanos, os transposons apresentam a vantagem de integrar estavelmente os transgenes para expressão de longo prazo.O segredo consiste em seguir um protocolo muito específico no manuseio das P BMCs durante o isolamento e após a nucleofecção. Implementamos inicialmente este método para gerar linhagens celulares humanas estáveis em cultura para expressar diferentes genes. Essa abordagem ajuda a responder perguntas fundamentais na área de imunologia, como, por e

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Aplicação Clínica de<em&gt; A Bela Adormecida</em&gt; Artificial e Antigen Presenting Cells para modificar geneticamente células T de Sangue do Cordão Umbilical e periférica

Neste estudo, geramos células-tronco pluripotentes induzidas a partir de células de líquido amniótico de camundongo, usando um sistema de transposon baseado em não vírus.

A produção de células-tronco pluripotentes de rato amniótico células do líquido Usando um Sistema Transposon

Este protocolo descreve um método para alcançar a integração estável de um gene de interesse no genoma humano pelo sistema transcriptionally regulado de Bela adormecida . Preparação da integração dos vetores de Lentivirus defeituosos, a transdução em vitro de células humanas e o ensaio molecular em células transduzidas são relatados.

Um método eficiente em Vitro transposição por um sistema de beleza dormindo Transcriptionally regulado empacotado em um vetor de Lentivirus defeituoso de integração

Delineamos um protocolo de 9 dias para a transdução e expansão de células mononucleares periféricas rhesus macaque que produz células com excelente co-expressão dos genes de interesse em número suficiente para estudos de infusão da eficácia celular.

Transdução e expansão de células T primárias em nove dias com manutenção do fenótipo da memória central

Aqui, descrevemos um método detalhado para edição de genes sem costura em células-tronco pluripotentes humanas usando um plasmídeo doador baseado em piggyBac e o mutante Cas9 nickase. Duas mutações pontuais foram introduzidas no éxon 8 do locus do fator nuclear 4 alfa do hepatócito (HNF4α) em células-tronco embrionárias humanas (hESCs).

Introduzindo mutações pontuais em células-tronco pluripotentes humanas usando edição de genoma contínua

Desenvolvemos um protocolo para transfectar células epiteliais primárias de pigmento humano por eletroporação com o gene que codifica o fator derivado do epitélio pigmentar (PEDF) usando o sistema de transposon da Bela Adormecida (SB). A transfecção bem-sucedida foi demonstrada pela reação quantitativa em cadeia da polimerase (qPCR), immunoblotting e ensaio imunoenzimático (ELISA).

Modificação Genética Baseada em Eletroporação de Células Epiteliais de Pigmento Humano Primário usando o Sistema Transposon da Bela Adormecida

Aqui, é apresentado um protocolo para isolar e transfetar células epiteliais de íris primária e pigmento da retina de vários mamíferos (ratos, ratos, coelhos, suínos e bovinos). O método é ideal para estudar abordagens de terapia genética ocular em várias configurações para análises ex vivo e estudos in vivo transferíveis para humanos.

Isolamento, Cultura e Engenharia Genética de Células Epiteliais de Pigmento Primário mamífero para terapia genética não viral

A transformação germinal bem sucedida no verme do exército de outono, Spodoptera frugiperda,foi alcançada usando mRNA de transposase hiperativo piggyBac.

Transformação germline hiperativa da Transposase mediada pela Transposase no Verme do Exército de Outono, Spodoptera frugiperda

Um protocolo detalhado é fornecido para o uso da tecnologia CRISPR / Cas9 para obter knock-in direcionado altamente eficiente de grandes construções multicistrônicas em células T humanas primárias por meio da via de reparo de DNA de junção de extremidade mediada por homologia (HMEJ). As células T projetadas com este protocolo adaptável ao cGMP mantêm excelente expansão celular, citotoxicidade e produção de citocinas.

Engenharia não viral de células T humanas primárias por meio de integração direcionada de junção de extremidade mediada por homologia de grandes modelos de DNA

Aprenda a modificar geneticamente células T humanas primárias usando o sistema de transposon piggyBac não viral. Este método permite expressão estável de transgenes para aplicações terapêuticas em imunologia.

piggyBac modificação do sistema Transposon de células T primárias Humanos

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