Geração de substrato para Endonucleases de CRISPR / Cas Sistemas

O objetivo geral dos experimentos a seguir é gerar substratos de RNA para o estudo da Endonuclease Cas, que desempenham papéis cruciais nos sistemas imunológicos CRISPR-Cas encontrados em bactérias e Archaea, a fim de obter substratos de RNA para a Endonuclease Cas. A amplificação por PCR de uma região específica do CRISPR pode ser empregada para obter um molde de DNA longo para a produção de RNA in vitro. Se preferido.

Dois oligonucleotídeos podem ser usados para gerar modelos mais curtos para a produção de RNA substrato. Alternativamente, sequências repetidas curtas, sintetizadas sob encomenda, podem ser testadas em ensaios de endonuclease CAS. Em última análise, a produção de transcritos de RNA e a subsequente clivagem pela endonuclease CAS seis podem ser visualizadas por auto-radiografia.

O principal objetivo das técnicas apresentadas é permitir que pesquisadores estudem o processamento de RNA CRISPR com substratos de RNA de diferentes comprimentos. Portanto, são utilizados diferentes métodos para gerar pequenos RNAs, por exemplo, elementos repetidos únicos ou RNAs maiores, como transcritos de crispr, RNA, que abrangem vários espaçadores. Embora esses métodos forneçam especificamente informações sobre a maturação do RNA CRISPR, estratégias semelhantes de preparação de modelos podem ser adotadas para outros sistemas de processamento de RNA. O procedimento será demonstrado por Muted Surface, estudante de pós-graduação, e Repl, pós-doutorando, ambos de um laboratório que pesquisa sistemas imunológicos CRISPR em bactérias e ArcHa.

Uma sequência de DNA viral chamada protoespaçador pode ser inserida entre dois elementos repetidos em um agrupamento CRISPR em crescimento, num processo denominado adaptação. Em seguida, todo o agrupamento CRISPR é transcrito e depois processado em pequenos RNAs CRISPR por uma endonuclease Cas, por exemplo, Cas6. Os pequenos RNAs CRISPR são então incorporados ao complexo proteico Cas e medeiam a defesa do hospedeiro contra um ataque viral repetido, utilizando a complementaridade de bases entre o RNA CRISPR e o protoespaçador como sinal para a degradação do DNA viral, gerando substratos longos de pré-RNA CRISPR.

Inicie projetando primers de PCR, visando as regiões espaçadoras de um agrupamento CRISPR mediante a adição da sequência do promotor da RNA polimerase T7 ao primer direto. Em seguida, adicione sítios de restrição a ambos os primers para clonar o produto de PCR em um vetor. Observe que a RNA polimerase T7 requer um resíduo de guanina (I) para a correta iniciação da transcrição após amplificar a sequência de RNA pré-CRISPR de interesse a partir do DNA genômico por PCR.

Sequencie os produtos de PCR em gel de agarose e extraia do gel a faixa desejada, em seguida digira o produto de PCR com enzimas de restrição para criar extremidades coesivas. Depois, após purificar seu produto de PCR com um kit de purificação de PCR, para eliminar quaisquer subprodutos de clivagem, adicione T four DNA Ligase, tampão T four DNA Ligase e uma proporção molar de três para um do produto de PCR clivado em relação ao vetor puck relacionado ao DFOs four com extremidades coesivas correspondentes. Incube agora a reação de ligação a 16 graus Celsius durante a noite e, em seguida, transforme a mistura em células competentes de e coli, linhagem DH five alpha, por protocolos padrão, utilizando seleção azul-branca para identificar a ligação bem-sucedida.

Por fim, isolam-se os plasmídeos das colônias brancas utilizando um kit de preparação de plasmídeos e identificam-se os clones positivos por meio de sequenciamento do plasmídeo para gerar substratos de RNA pré-CRISPR de tamanho intermediário. Comece projetando oligonucleotídeos direto e reverso com a sequência desejada de espaçadores repetidos CRISPR semelhante às sequências mostradas aqui. Observe que os oligonucleotídeos contêm a sequência de um promotor de RNA polimerase T7, bem como sítios de restrição terminais após a finalização dos oligonucleotídeos, para garantir a formação de extremidades coesivas.

Após uma incubação em posição agachada, incube as amostras com a cinase de polinucleotídeo T4 e o tampão da cinase de polinucleotídeo T4 por uma hora a 37 graus Celsius para fosforilar as extremidades cinco primas, um análogo de cada um dos oligonucleotídeos. Em seguida, incube os oligonucleotídeos direto e reverso fosforilados com o tampão da ligase de DNA T4 por cinco minutos a 95 graus Celsius em um bloco de aquecimento. Após as amostras terem hibridizado, desligue a fonte de calor e deixe a mistura esfriar por cerca de duas a três horas até atingir a temperatura ambiente.

Agora, ligue os oligonucleotídeos sintetizados com uma mistura de hibridização digerida e desfosforilada com vetor P T quatro, tampão da DNA Ligase e uma TP a 16 graus Celsius durante a noite. Em seguida, transforme os plasmídeos ligados em células competentes de E. coli, linhagem DH cinco alfa, por protocolos padrão utilizando seleção azul-branca para identificar a ligação bem-sucedida. Por fim, isole os plasmídeos e identifique os clones positivos por digestão e subsequente sequenciamento do plasmídeo.

Sequências de substrato de RNA com repetição única curta podem ser projetadas de forma semelhante às mostradas aqui. Certifique-se de incluir um desoxirribonucleotídeo. Caso o local de clivagem do RNA precise ser determinado, uma empresa de síntese personalizada poderá então ser utilizada para realizar a produção do oligonucleotídeo de RNA.

Após o isolamento de plasmídeos com o substrato personalizado de escolha, utilize um kit de purificação de plasmídeos em escala maxi para linearizar os plasmídeos com a enzima de restrição que cliva a jusante dos fragmentos clonados. Em seguida, após assegurar a digestão completa, purifique o plasmídeo linearizado por extração com fenol-clorofórmio e precipitação com etanol. Recupere os ácidos nucleicos por ressuspendimento, suspendendo o precipitado em água estéril tratada com DEPC.

Agora, incube os plasmídeos digestivos em uma mistura recém-preparada de transcrição in vitro com polimerase de RNA T7, contendo ATP, CTP, GTP e UTP, por três horas a 37 graus Celsius. Finalmente, analise os transcritos de RNA obtidos em um gel desnaturante de poliacrilamida a 12% contendo uréia a oito molar. Também é possível purificar os transcritos por meio de cromatografia de troca aniônica Mono Q e, em seguida, recuperar os transcritos por precipitação alcoólica das frações de RNA e ressuspendendo os pellets em água estéril tratada com DEPC para analisar os substratos projetados. Para começar, visualize as bandas do substrato por auto-radiografia e purifique os produtos da reação por extração em gel a partir de uréia a oito molar desnaturante.

Gel de poliacrilamida a 12% e, em seguida, produzir e purificar as proteínas Cas recombinantes desejadas por meio de precipitação térmica e cromatografia em coluna de níquel-NTA, conforme demonstrado para esta proteína Cas6 de Clostridium thermocellum. Em seguida, combinar a proteína Cas com uma mistura de reação de endonuclease recém-preparada durante 30 minutos a 37 graus Celsius para permitir que a reação do ensaio de endonuclease ocorra. Por fim, carregar cinco microlitros da mistura de reação em gel de uréia a oito molar.

Gel de poliacrilamida a 12% e visualize os produtos de clivagem após eletroforese por autorradiografia. Aqui é mostrado um gel de poliacrilamida corado com azul de hinina de um oligonucleotídeo de RNA projetado sob medida e dois transcritos de RNA in vitro. Observe que a eficiência da produção de RNA varia entre as construções de comprimento curto, longo e intermediário.

A investigação da atividade de endonuclease de RNA exige controles positivos e negativos, bem como proteínas Cas recombinantes altamente purificadas. Nesta figura, um gel de eletroforese em SDS-PAGE de uma preparação da amostra CAS6 de Clostridium thermocellum.

Após a precipitação por calor e cromatografia em coluna de níquel com NTA, acompanhada por um marcador proteico padrão, é mostrada. Uma amostra controle negativo adequada deve conter um lisado celular sem expressão de CAS seis, mas seguindo o procedimento idêntico de purificação de CAS seis, a preparação de CAS seis foi determinada como possuidora do nível necessário de pureza. Aqui, a clivagem de um substrato de sequência repetida marcado no terminal cinco primo pelo proteína CAS seis de Clostridium thermocellum pode ser visualizada por autorradiografia.

Cada poço contém substrato marcado radioativamente, RNA após incubação com a proteína ca seis, conforme indicado pelos sinais positivos, ou com tampão como controle negativo, conforme indicado pelos sinais negativos, substratos longos ou substratos curtos com ou sem a adição do desoxirribonucleotídeo. Na posição menos nove, foram utilizados para facilitar a reação de endonuclease. Observe a ausência de clivagem dos substratos curtos quando o desoxirribonucleotídeo foi incluído na molécula de RNA após este procedimento.

As seis nucleases CAS também podem ser utilizadas como ferramenta para gerar RNAs maduros e precisos. Esses RNAs podem ser incorporados a complexos em cascata para obter insights sobre o envolvimento na interferência contra ataques virais. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como projetar e produzir substratos CRISPR para Cas e nucleases.

Esses diferentes substratos são úteis para abordar questões relacionadas à maturação e utilização de crispr Es.