Name: Geração de substrato para Endonucleases de CRISPR / Cas Sistemas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-08T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: Aprenda a gerar substratos de RNA para estudo de endonucleases Cas em sistemas imunes CRISPR de bactérias e arqueias. Este método utiliza PCR e oligonucleotídeos para produzir pré-crRNAs de diferentes tamanhos.

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Os autores gostariam de agradecer Jeanette Schermuly para a preparação de recombinante RNA polimerase T7 e Ebelt Norman para a assistência na preparação Figura 1. Este trabalho foi financiado por fundos do Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG FOR1680) e da Sociedade Max Planck.

1. Geração de tempo pré-crRNA substratos via PCR <ol><li> Iniciadores de PCR projeto de segmentação das regiões espaçadoras de um cluster CRISPR. Adicionar a polimerase de ARN T7 (T7RNAP) sequência promotora (5 &#39;-taatacgactcactata-3&#39;) para o iniciador directo e sítios de restrição para a clonagem do produto de PCR em um vetor de ambos os iniciadores (por exemplo, BamHI e HindIII para pUC19, fig. 2A) . Nota: O T7RNAP requer um resíduo de guanidina para a iniciação da transcrição adequada. </li><li> Amplificar a seqüência de pré-crRNA de interesse do DNA genômico por PCR. </li><li> Separar os produtos de PCR por electroforese em gel de agarose e gel de extrair a banda desejada. Digerir o produto de PCR com as enzimas de restrição para criar extremidades coesivas (por exemplo, BamHI e HindIII, fig. 2A). Purifica-se o produto de PCR com um kit de purificação de PCR para eliminar a clivagem subprodutos. </li><li> Defina-se uma reacção de ligação que contém ADN-ligase de T4, tampão de ligase T4 DNA euma relação molar de 3:1 do produto de PCR clivado e o vector linear desfosforilada pUC com as correspondentes extremidades coesivas. Incubar a mistura a 16 ° C durante a noite. Transformar a mistura de ligação em células competentes de Escherichia coli DH5a por protocolos padrão e utilizar rastreio azul branco para identificar a ligação bem sucedida. </li><li> Isolar os plasmídeos de colónias brancas, utilizando um kit de preparação de plasmídeo. Identificar os clones positivos por sequenciação de plasmídeo. Alternativamente, colónia PCR pode ser utilizado para o rastreio. </li></ol> 2. Geração de intermediário pré-crRNA substratos através de emparelhamento de oligonucleótidos de DNA <ol><li> Projetar para a frente e para trás oligonucleotídeos com o desejado CRISPR sequência de repetição / espaçador. Os oligonucleótidos contêm a sequência de um promotor T7 RNAP assim como sítios de restrição terminais (por exemplo, BamHI e HindIII para pUC19). Encerrar os oligonucleótidos de forma a assegurar que as extremidades pegajosas após recozimento (ver fig. 2B </strong&gt;). </li><li> 5&#39;-fosforilam nmol 1 de cada oligonucleótido numa reacção separada 20 uL contendo 5 uL de quinase de polinucleótidos de T4 (PNK), 2 uL de tampão PNK 10x T4, 2 ul de ATP (10 mM). Incubar cada amostra durante 1 hora a 37 ° C. </li><li> Hibridizar os dois oligonucleótidos fosforilados. Combinar 1 ul da mistura de oligo fosforilado para a frente (a partir de 2.2.), 1 ul da mistura inverso fosforilado oligo (a partir de 2.2.), 1 ul de tampão de T4 ADN ligase 10x numa reacção de 10 jil. Incubar as amostras durante 5 min a 95 ° C num bloco de aquecimento ou em água a ferver, desligar a fonte de calor e deixar a mistura arrefecer até à temperatura ambiente (~ 2-3 horas). Nota: Neste passo crítico, o processo de arrefecimento lento favorece a hibridação dos dois oligonucleótidos em comparação com a formação de estruturas dentro de cada um único oligonucleótido. </li><li> Ligadura 4 ul da mistura de hibridação, 1 ul de digerido e desfosforilado vector pUC (0,1 ug /ul) com ligase de ADN de T4, tampão de ligase T4 de ADN 10x e 10 mM de ATP em uma mistura de ligação 20 ul. Incubar a amostra a 16 ° C durante a noite. </li><li> Transforme os plasmídeos ligados em células de Escherichia coli competentes DH5ct por protocolos padrão e utilizar triagem branco azul. Isolar os plasmídeos e identificar os clones positivos por digestão (para a tela para inserções com o tamanho desejado) e sequenciação de plasmídeo subsequentes. </li></ol> 3. Geração de curto Cas substratos RNA via síntese de oligonucleótidos RNA personalizado Projeto de curto Cas RNA substratos (por exemplo, seqüências de repetição simples, fig. 2C) e utilizar personalizados RNA instalações de síntese de oligonucleotídeos. Nota: A inclusão de um desoxirribonucleótido a uma posição definida de um oligonucleótido de ARN (Fig. 2C), pode ser utilizado para identificar o local de clivagem de ARN. 4. In vitro T7 transcrição de ARN-polimerase <ol><li> Isolar os plasmídeos com o constructo concebido (a partir de 1.9. Ou 2.7.) Utilizando um kit de purificação de maxiprep de plasmídeo. </li><li> Linearizar o plasmídeo com a enzima de restrição que cliva a jusante do fragmento clonado (por exemplo, Hind III). Assegurar uma digestão completa. Nota: Se um 3 divergente definido &#39;terminus do transcrito de RNA é desejada, o constructo concebido deve conter um sítio de restrição adicional específico para &quot;run-off&quot; da transcrição a montante da sequência HindIII. </li><li> Purifica-se o plasmídeo linearizado por fenol: clorofórmio (1:1) e precipitação com etanol. Recuperar os ácidos nucleicos por ressuspensão do sedimento em água tratada com DEPC estéril. </li><li> Configurar uma in vitro T7 RNAP correr mistura de transcrição que contém 40 mM de Hepes / KOH (pH 8), 22 mM MgCl2, 5 mM ditiotreitol, 1 mM de espermidina, 4 mM de cada nucleósido-trifosfato (ATP, CTP, GTP, UTP ), 40-100 ug / ml de digeridoplasmídeo e 0,1 mg / ml de T7 RNAP em água tratada com DEPC. Incubar 3 horas a 37 ° C. </li><li> Analisar as transcrições de RNA obtidos sobre um gel de poliacrilamida desnaturante ureia 8 M 12% (Fig. 3A). Os transcritos de RNA pode ser purificado através de aniões Mono Q cromatografia de troca 13 e recuperado por precipitação com etanol das fracções de RNA e de ressuspensão do sedimento em água tratada com DEPC estéril. No futuro, a armazenar o RNA a -80 ° C. </li></ol> 5. Cas6 ensaio endonuclease <ol><li> Configurar uma 20 pi in vitro T7 RNAP correr mistura de transcrição (ver 4.4), que contém uma quantidade reduzida de 2 mM ATP e é complementado com 2,5 ul α-[32 P]-ATP (10 mCi / ml, 5000 Ci / mmol). Purifica-se os produtos da reacção por meio de extracção a partir de um gel desnaturante de ureia 8 M em gel de poliacrilamida a 12%. Visualizar as bandas por autorradiograf ia. </li><li> Produzir e purificar as proteínas recombinantes desejados Cas. Neste exemplo, CAS6 de Clostridium thermocellum foi purificado por meio de calor de precipitação e cromatografia de Ni-NTA. </li><li> Defina-se uma reacção de digestão com endonucleases (por exemplo, para Clostridium thermocellum Cas6, a mistura reaccional contém 20 mM de Hepes (KOH pH 8), 250 mM de KCl, 2 mM de MgCl2, 1 mM DTT, 12000 cpm de substrato de ARN e 1 uM de enzima e incubou-se a 37 ° C durante 30 min). </li><li> Carregar 5 uL da mistura de reacção (+ 10 ul de tampão de carregamento de RNA contendo 95% de formamida) em ureia 8 M em gel de poliacrilamida a 12%. Visualizar os produtos de clivagem, após eletroforese através de autorradiografia. </li></ol> 6. Resultados representativos Um exemplo de substratos de RNA para análise de actividade de endonuclease Cas é mostrado na Figura 3A. Uma parte alíquota de 5 ul de uma pi 100 analítico in vitro da reacção de transcrição foram carregados. Por favor note que a eficiência da produção de RNA varia entre diferentes construções. Alguns fatores tchapéu foram observados para influenciar a quantidade de RNA obtidos são (i) a sequência que se segue imediatamente a G 1 necessária para a iniciação da transcrição, (ii) a possibilidade de formação de estruturas de RNA durante a transcrição e (iii) a escolha do local de restrição para a geração da posição de clivagem segundo turno. A investigação da actividade de endonuclease RNA requer tanto recombinante altamente purificada Cas proteínas (Fig. 3B) e controlos negativos apropriados. Idealmente, esta amostra de controlo negativo difere tão pouco quanto possível a partir da reacção investigada endonuclease Cas. Isto pode ser alcançado através da incubação do RNA com o tampão de reacção e lisado de células sem expressão Cas (e seguindo o procedimento de purificação idêntico). Um controle negativo ideal é a adição de um desoxirribonucleótido no local de clivagem proposto. Na Figura 3C, a clivagem de uma sequência de repetição 5 &#39;terminal marcado é mostrado por Clostridium thermocellum Cas6. Em<html> condições idênticas, esta repetição não é um substrato mais quando é introduzido um desoxirribonucleótido na posição -9. Este método também fornece informações sobre o local de clivagem. Finalmente, um longo internamente marcada pré-crRNA é clivada por Cas6 e dois fragmentos de clivagem são observados. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4277/4277fig1.jpg" /> Figura 1. Visão esquemática CRISPR / Cas atividade. A síntese segue a inserção de uma sequência de ADN viral (protospacer) para o cluster CRISPR (de adaptação), a transcrição e processamento da matriz CRISPR em crRNAs pequenas por uma endonuclease Cas6, a absorção de crRNAs no complexo da cascata e a interferência de um repetido ataque viral, baseada na complementaridade entre crRNA e protospacer. Motivos Protospacer adjacentes (PAM) seqüências protospacer marca virais. igura 2 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/4277/4277fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. Geração de RNA substratos para Cas proteínas. O esquema mostra o fluxo de trabalho para a geração de (A) de comprimento pré-crRNA substratos, (B) intermédia pré-crRNA substratos e (C) de curto Cas RNA substratos para a produção de pré-crRNA. Seqüências de exemplo são apresentados para a matriz CRISPR de Clostridium thermocellum. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4277/4277fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4277/4277fig3.jpg" /> Figura 3. Cas6 a digestão com endonucleases. A.) em gel de poliacrilamida de toluidina azul manchado de um oligonucleótido de ARN de design personalizado (250 pmol) e dois transcritos de RNA in vitro (5 ul de uma reacção de 100 uL típico). B.) SDS-PAGE em gel de uma preparação Cas6 (80 pmol) de Clostridium thermocellum depois calorprecipitação a 50 ° C durante 1 hora e cromatografia de Ni-NTA. C.) A detecção da actividade Cas6 endonucleolítica para 5 &#39;terminal de sequências de repetição rotulados e pré-crRNA transcritos in vitro. A introdução de um dNTP na posição -9 abole Cas6 clivagem do substrato por um curto RNA Cas (S, fig. 2C). A 5 &#39;terminal 8 tag nt é também gerada para crRNA maturação de longa pré-crRNA substratos (L, fig. 2A). As bandas foram separados num 8 M ureia em gel de poliacrilamida desnaturante a 12% e visualizados por autorradiografia.

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<li>Jahn, M. J., Jahn, D., Kumar, A. M., Söll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mono+Q+chromatography+permits+recycling+of+DNA+template+and+purification+of+RNA+transcripts+after+T7+RNA+polymerase+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Mono Q chromatography permits recycling of DNA template and purification of RNA transcripts after T7 RNA polymerase reaction.</a> Nucleic Acids Res. 19, 2786-2787 (1991).</li>
<li>Sampson, J. R., Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+physical+characterization+of+an+unmodified+yeast+phenylalanine+transfer+RNA+transcribed+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Biochemical and physical characterization of an unmodified yeast phenylalanine transfer RNA transcribed in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 1033-1037 (1988).</li>
<li>Dreher, T. W., Bujarski, J. J., Hall, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutant+viral+RNAs+synthesized+in+vitro+show+altered+aminoacylation+and+replicase+template+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mutant viral RNAs synthesized in vitro show altered aminoacylation and replicase template activities.</a> Nature. 311, 171-175 (1984).</li>
<li>McGinness, K. E., Joyce, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substitution+of+ribonucleotides+in+the+T7+RNA+polymerase+promoter+element%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Substitution of ribonucleotides in the T7 RNA polymerase promoter element.</a> J. Biol. Chem. 277, 2987-2991 (2002).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Os métodos apresentados permitem a geração de substratos Cas endonucleases de gamas de tamanhos diferentes e com diferentes liberdade no desenho sequência. A abordagem mais simples e direta para a geração de substratos de oligonucleótidos sintéticos de ARN está limitada a designs de ARN curtos devido ao aumento dos custos e as limitações técnicas na criação de oligómeros mais longos de RNA. Enquanto a síntese de RNA de sucesso tem sido relatado para oligómeros não modificados de RNA de nucleótidos ao longo do comprimento de 100, o máximo prático e económico para a síntese de RNA personalizado está abaixo de 40 nucleótidos. No entanto, qualquer dada sequência pode ser sintetizado e a introdução orientada dos nucleótidos modificados (por exemplo, desoxirribonucleótidos) pode ser utilizada para analisar locais de clivagem em detalhe. Mais longos de pré-CRNAs deve ser gerada através de transcrição in vitro. O recozimento de oligonucleótidos que contêm um promotor de ARN-polimerase de T7 permite a produção de comprimento intermédio pré-CRRNComo. O comprimento máximo de rotina e economicamente oligonucleótidos de ADN sintetizadas está apenas acima de 150 nucleótidos e representa o máximo de síntese pré-crRNAs através deste método. A montagem dos vários pares de oligonucleótidos de ADN hibridados que formam extremidades coesivas com o outro pode estender este comprimento máximo mas necessita desafios crescentes na clonagem do construto. A principal vantagem deste método é a capacidade para gerar pré-crRNA construções (e, portanto, Cas endonuclease substratos) com qualquer sequência desejada. Isto permite que o teste de modelos crRNA sintéticos. Finalmente, os pré-crRNAs maiores podem ser obtidos a partir de PCR amplificados de elementos genómicos CRISPR inteiras ou fracções dos mesmos. Alterações ao modelo in vitro de transcrição do plasmídeo pode ser introduzido, através de mutagénese dirigida para a produção de pré-crRNA variantes. Estas construções podem ser usadas para analisar o padrão de clivagem endonucleolítica mundial dentro de um inteiropré-crRNA. O trabalho pioneiro para a produção de ARN não modificado através de T7 RNA polimerase de transcrição in vitro foi baseada em RNAs de transferência 14 e do vírus do mosaico brome RNA 15. O consenso do promotor T7 RNA polimerase consiste de um domínio de reconhecimento (-17 a -5) e um domínio de iniciação (-4 através +6) com o início da transcrição em um guanosina essencial um 16. Posições jusante de um pode ser variada o que permite a transcrição de quase qualquer sequência de ARN desejado. Os métodos apresentados para a geração de modelos in vitro run-off de transcrição permitir a síntese in vitro de completos pré-crRNAs que correspondem regiões genômicas CRISPR ou sintéticos pré-crRNA variantes. As transcrições são gerados com um presente trifosfato 5&#39;-terminal, a menos que a reacção de transcrição é iniciada com GMP para se obter 5 &#39;monofosfato de terminais 14. Esses terminais são necessários se as transcrições devem ser rotuladoscom polinucleótido-quinase de T4 e γ-[32 P]-ATP. A actividade de clivagem de Cas6 e Cas6 enzimas semelhantes gera crRNA que contêm 5&#39;-hidroxilo e um grupo 2 &#39;, 3&#39;-terminais cíclicos fosfato. Estes RNAs podem então ser analisados ​​para o reconhecimento pelo complexo de cascata.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> Antártida Fosfatase </td><td> NEB </td><td> M0289L </td><td></td></tr><tr><td> Transcrição in vitro de grau Ultrapure Trisfosfatos Nucleotide </td><td> Jena Bioscience </td><td> NU-1010 - NU-1013 </td><td></td></tr><tr><td> Cromatografia líquida, ktapurifier 100 </td><td> GE Healthcare </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Os oligonucleótidos de DNA </td><td> MWG Operon </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Oligonucleotídeos de RNA </td><td> MWG Operon </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Gel Extraction Kit </td><td> QIAGEN </td><td> 28704 </td><td></td></tr><tr><td> PCR Purification Kit </td><td> QIAGEN </td><td> 28104 </td><td></td></tr><tr><td> Rotação Miniprep Kit </td><td> QIAGEN </td><td> 27106 </td><td></td></tr><tr><td> Kit Plasmid Maxi </td><td> QIAGEN </td><td> 12163 </td><td></td></tr><tr><td> BamHI </td><td> NEB </td><td> R0136L </td><td></td></tr><tr><td> HindIII </td><td> NEB </td><td> R0104L </td><td></td></tr><tr><td> Ligase de ADN de T4 </td><td> NEB </td><td> M0202S </td><td></td></tr><tr><td> Quinase de polinucleótido T4 </td><td> Ambion </td><td> AM2310 </td><td></td></tr><tr><td> T7 RNA polimerase </td><td> própria preparação </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Mix Solução desoxinucleotídeo </td><td> NEB </td><td> N0447L </td><td></td></tr><tr><td> Mini-PROTEAN Sistema de Electroforese Tetra </td><td> Bio-Rad </td><td> 165-8001 </td><td></td></tr><tr><td> Scanner Tempestade 840 </td><td&gt; GE Healthcare </td><td> 163723 </td><td></td></tr><tr><td> Armazenamento Phosphorscreen </td><td> Molecular Dynamics </td><td> 63-0034-81 </td><td></td></tr><tr><td> Mono Q 5/50 GL </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-5166-01 </td><td></td></tr><tr><td> Phusion DNA polimerase de alta fidelidade </td><td> NEB </td><td> M0530L </td><td> usar o tampão GC </td></tr><tr><td> Azul de Toluidina </td><td> Sigma </td><td> T3260 </td><td></td></tr><tr><td> pUC19 </td><td> NEB </td><td> N3041S </td><td></td></tr><tr><td> γ-[32 P]-ATP, α-[32 P]-ATP </td><td> Hartmann Analítica </td><td> SRP-401, SRP-307 </td><td></td></tr></tbody></table>

geração de substrato para endonucleases de crispr / cas sistemas

Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems

A interação do vírus e seus hospedeiros procarióticos moldaram a evolução da vida de bactérias e Archaea. Procariotos desenvolveram várias estratégias para evitar ataques virais que incluem a modificação restrição, infecção abortiva e CRISPR / Cas sistemas. Estes sistemas adaptativos imunes encontrados em muitas bactérias e mais Archaea consistem em c Abrilhantado r i egularly nterspaced s hort p alindromic r EPEAT (CRISPR) e um número de sequências de C RISPR como associada (Cas) genes (Fig. 1) 1-3. Conjuntos diferentes de proteínas Cas e repete definir pelo menos três grandes tipos divergentes de CRISPR / Cas sistemas 4. As proteínas e universais CAS1 CAS2 são propostas a serem envolvidas na absorção do DNA viral quegerará um elemento espaçador entre duas repetições na extremidade 5 &#39;de um cluster CRISPR estendendo 5. O conjunto inteiro é transcrito em um precursor crRNA contendo todos espaçador e sequências de repetição e é posteriormente processado por uma enzima da família Cas6 diversificada em crRNAs menores 6-8. Estes consistem crRNAs da sequência flanqueada por um espaçador 5 &#39;terminal (8 nucleótidos) e um 3&#39; terminal de tag derivada da sequência de repetição 9. A infecção repetida do vírus pode agora ser bloqueada como o crRNA novo será dirigido por um complexo de proteína Cas (Cascade) para o ADN virai e identifica-o como tal através da complementaridade de base 10. Finalmente, para CRISPR / Cas tipo 1 sistemas, o CAS3 nuclease vai destruir o invasor detectado ADN 11,12. Esses processos definem CRISPR / Cas como um sistema imune adaptativo de procariotas e aberto um campo de pesquisa fascinante para o estudo das proteínas envolvidas Cas.A função de muitas proteínas Cas ainda é evasivo e as causas da aparente diversidade dos sistemas CRISPR / Cas continuam a ser iluminado. Atividades potenciais da maioria das proteínas Cas foram previstos através de análises detalhadas computacionais. A maior fracção de proteínas Cas ou são mostrados ou propostas para funcionar como endonucleases 4. Aqui, apresentamos métodos para gerar crRNAs e precursor-CRNAs para o estudo da endoribonucleases Cas. Os ensaios de endonucleases diferentes requerem sequências de repetição ou curtas que podem ser directamente sintetizados como oligonucleótidos de ARN ou sequências mais crRNA e pré-crRNA que são geradas in vitro por meio de polimerase de ARN de T7 a transcrição run-off. Esta metodologia permite a incorporação de nucleótidos radioactivos para a produção de substratos de endonuclease internamente marcadas e da criação de crRNAs sintéticos ou mutante. Cas6 actividade endonuclease é utilizado para pré-crRNAs amadurecer em crRNAs com 5&#39;-hidroxilo e um 2 &#39;, 3&#39;-terminais cíclicos fosfato.

CRISPR / Cas sistemas mediato imunidade adaptativa em Bacteria e Archaea. Muitas proteínas Cas são propostos para agir como endoribonucleases actuam sobre precursores crRNA de comprimento variável. Aqui, ilustramos três abordagens diferentes para gerar pré-crRNA substratos para a análise bioquímica da actividade de endonuclease Cas.

Geração de substrato para Endonucleases de CRISPR / Cas Sistemas

A interação de vírus e seus hospedeiros procarióticos moldou a evolução da vida bacteriana e arqueana. Os procariotos desenvolveram diversas estratégias para...

O objetivo geral dos experimentos a seguir é gerar substratos de RNA para o estudo da Endonuclease Cas, que desempenham papéis cruciais nos sistemas imunológicos CRISPR-Cas encontrados em bactérias e Archaea, a fim de obter substratos de RNA para a Endonuclease Cas. A amplificação por PCR de uma região específica do CRISPR pode ser empregada para obter um molde de DNA longo para a produção de RNA in vitro. Se preferido.Dois oligonucleotídeos podem ser usados para gerar modelos mais curtos para a produção de RNA substrato. Alternativamente, sequências repetidas curtas, sintetizadas sob encomenda, podem ser testadas em ensaios de endonuclease CAS. Em última análise, a produção de transcritos de RNA e a subsequente clivagem pela endonuclease CAS seis podem ser visualizadas por auto-radiografia.O principal objetivo das técnicas apresentadas é permitir que pesquisadores estudem o processamento de RNA CRISPR com substratos de RNA de diferentes comprimentos. Portanto, são utilizados diferentes métodos para gerar pequenos RNAs, por exemplo, elementos repetidos únicos ou RNAs maiores, como transcritos de crispr, RNA, que abrangem vários espaçadores. Embora esses métodos forneçam especificamente informações sobre a maturação do RNA CRISPR, estratégias semelhantes de preparação de modelos podem ser adotadas para outros sistemas de processamento de RNA. O procedimento será demonstrado por Muted Surface, estudante de pós-graduação, e Repl, pós-doutorando, ambos de um laboratório que pesquisa sistemas imunológicos CRISPR em bactérias e ArcHa.Uma sequência de DNA viral chamada protoespaçador pode ser inserida entre dois elementos repetidos em um agrupamento CRISPR em crescimento, num processo denominado adaptação. Em seguida, todo o agrupamento CRISPR é transcrito e depois processado em pequenos RNAs CRISPR por uma endonuclease Cas, por exemplo, Cas6. Os pequenos RNAs CRISPR são então incorporados ao complexo proteico Cas e medeiam a defesa do hospedeiro contra um ataque viral repetido, utilizando a complementaridade de bases entre o RNA CRISPR e o protoespaçador como sinal para a degradação do DNA viral, gerando substratos longos de pré-RNA CRISPR.Inicie projetando primers de PCR, visando as regiões espaçadoras de um agrupamento CRISPR mediante a adição da sequência do promotor da RNA polimerase T7 ao primer direto. Em seguida, adicione sítios de restrição a ambos os primers para clonar o produto de PCR em um vetor. Observe que a RNA polimerase T7 requer um resíduo de guanina (I) para a correta iniciação da transcrição após amplificar a sequência de RNA pré-CRISPR de interesse a partir do DNA genômico por PCR.Sequencie os produtos de PCR em gel de agarose e extraia do gel a faixa desejada, em seguida digira o produto de PCR com enzimas de restrição para criar extremidades coesivas. Depois, após purificar seu produto de PCR com um kit de purificação de PCR, para eliminar quaisquer subprodutos de clivagem, adicione T four DNA Ligase, tampão T four DNA Ligase e uma proporção molar de três para um do produto de PCR clivado em relação ao vetor puck relacionado ao DFOs four com extremidades coesivas correspondentes. Incube agora a reação de ligação a 16 graus Celsius durante a noite e, em seguida, transforme a mistura em células competentes de e coli, linhagem DH five alpha, por protocolos padrão, utilizando seleção azul-branca para identificar a ligação bem-sucedida.Por fim, isolam-se os plasmídeos das colônias brancas utilizando um kit de preparação de plasmídeos e identificam-se os clones positivos por meio de sequenciamento do plasmídeo para gerar substratos de RNA pré-CRISPR de tamanho intermediário. Comece projetando oligonucleotídeos direto e reverso com a sequência desejada de espaçadores repetidos CRISPR semelhante às sequências mostradas aqui. Observe que os oligonucleotídeos contêm a sequência de um promotor de RNA polimerase T7, bem como sítios de restrição terminais após a finalização dos oligonucleotídeos, para garantir a formação de extremidades coesivas.Após uma incubação em posição agachada, incube as amostras com a cinase de polinucleotídeo T4 e o tampão da cinase de polinucleotídeo T4 por uma hora a 37 graus Celsius para fosforilar as extremidades cinco primas, um análogo de cada um dos oligonucleotídeos. Em seguida, incube os oligonucleotídeos direto e reverso fosforilados com o tampão da ligase de DNA T4 por cinco minutos a 95 graus Celsius em um bloco de aquecimento. Após as amostras terem hibridizado, desligue a fonte de calor e deixe a mistura esfriar por cerca de duas a três horas até atingir a temperatura ambiente.Agora, ligue os oligonucleotídeos sintetizados com uma mistura de hibridização digerida e desfosforilada com vetor P T quatro, tampão da DNA Ligase e uma TP a 16 graus Celsius durante a noite. Em seguida, transforme os plasmídeos ligados em células competentes de E. coli, linhagem DH cinco alfa, por protocolos padrão utilizando seleção azul-branca para identificar a ligação bem-sucedida. Por fim, isole os plasmídeos e identifique os clones positivos por digestão e subsequente sequenciamento do plasmídeo.Sequências de substrato de RNA com repetição única curta podem ser projetadas de forma semelhante às mostradas aqui. Certifique-se de incluir um desoxirribonucleotídeo. Caso o local de clivagem do RNA precise ser determinado, uma empresa de síntese personalizada poderá então ser utilizada para realizar a produção do oligonucleotídeo de RNA.Após o isolamento de plasmídeos com o substrato personalizado de escolha, utilize um kit de purificação de plasmídeos em escala maxi para linearizar os plasmídeos com a enzima de restrição que cliva a jusante dos fragmentos clonados. Em seguida, após assegurar a digestão completa, purifique o plasmídeo linearizado por extração com fenol-clorofórmio e precipitação com etanol. Recupere os ácidos nucleicos por ressuspendimento, suspendendo o precipitado em água estéril tratada com DEPC.Agora, incube os plasmídeos digestivos em uma mistura recém-preparada de transcrição in vitro com polimerase de RNA T7, contendo ATP, CTP, GTP e UTP, por três horas a 37 graus Celsius. Finalmente, analise os transcritos de RNA obtidos em um gel desnaturante de poliacrilamida a 12% contendo uréia a oito molar. Também é possível purificar os transcritos por meio de cromatografia de troca aniônica Mono Q e, em seguida, recuperar os transcritos por precipitação alcoólica das frações de RNA e ressuspendendo os pellets em água estéril tratada com DEPC para analisar os substratos projetados. Para começar, visualize as bandas do substrato por auto-radiografia e purifique os produtos da reação por extração em gel a partir de uréia a oito molar desnaturante.Gel de poliacrilamida a 12% e, em seguida, produzir e purificar as proteínas Cas recombinantes desejadas por meio de precipitação térmica e cromatografia em coluna de níquel-NTA, conforme demonstrado para esta proteína Cas6 de Clostridium thermocellum. Em seguida, combinar a proteína Cas com uma mistura de reação de endonuclease recém-preparada durante 30 minutos a 37 graus Celsius para permitir que a reação do ensaio de endonuclease ocorra. Por fim, carregar cinco microlitros da mistura de reação em gel de uréia a oito molar.Gel de poliacrilamida a 12% e visualize os produtos de clivagem após eletroforese por autorradiografia. Aqui é mostrado um gel de poliacrilamida corado com azul de hinina de um oligonucleotídeo de RNA projetado sob medida e dois transcritos de RNA in vitro. Observe que a eficiência da produção de RNA varia entre as construções de comprimento curto, longo e intermediário.A investigação da atividade de endonuclease de RNA exige controles positivos e negativos, bem como proteínas Cas recombinantes altamente purificadas. Nesta figura, um gel de eletroforese em SDS-PAGE de uma preparação da amostra CAS6 de Clostridium thermocellum.Após a precipitação por calor e cromatografia em coluna de níquel com NTA, acompanhada por um marcador proteico padrão, é mostrada. Uma amostra controle negativo adequada deve conter um lisado celular sem expressão de CAS seis, mas seguindo o procedimento idêntico de purificação de CAS seis, a preparação de CAS seis foi determinada como possuidora do nível necessário de pureza. Aqui, a clivagem de um substrato de sequência repetida marcado no terminal cinco primo pelo proteína CAS seis de Clostridium thermocellum pode ser visualizada por autorradiografia.Cada poço contém substrato marcado radioativamente, RNA após incubação com a proteína ca seis, conforme indicado pelos sinais positivos, ou com tampão como controle negativo, conforme indicado pelos sinais negativos, substratos longos ou substratos curtos com ou sem a adição do desoxirribonucleotídeo. Na posição menos nove, foram utilizados para facilitar a reação de endonuclease. Observe a ausência de clivagem dos substratos curtos quando o desoxirribonucleotídeo foi incluído na molécula de RNA após este procedimento.As seis nucleases CAS também podem ser utilizadas como ferramenta para gerar RNAs maduros e precisos. Esses RNAs podem ser incorporados a complexos em cascata para obter insights sobre o envolvimento na interferência contra ataques virais. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como projetar e produzir substratos CRISPR para Cas e nucleases.Esses diferentes substratos são úteis para abordar questões relacionadas à maturação e utilização de crispr Es.

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Biologia

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