Name: A descrição visual do Dissecção da vasculatura cerebral Superfície e Meninges Associados e plexo coróide do cérebro de um rato (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 31 s
Description: Aprenda a dissecar a vasculatura cerebral superficial e o plexo coróide de ratos. Este método permite estudar a função vascular e a homeostase do líquido cefalorraquidiano em neurociência.

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Este trabalho foi financiado pelo NCTR / FDA.

Embora não esteja representado no vídeo, os ratos receberam primeiro uma dose excessiva de 300 mg / kg de pentobarbital, resultando em anestesia, em menos de 3 minutos, e em seguida mortos por decapitação. Os seus cérebros foram rapidamente mas então cuidadosamente removido do crânio e arrefeceu-se com gelo uma solução salina normal durante 5 min. É importante deixar a arrefecer o cérebro para esse período de tempo antes da dissecação do MAV modo que o VAM pode ser separado a partir da superfície do córtex (parte superior da camada I). O cérebro foi então colocado no fundo de uma placa de Petri de vidro repousando sobre gelo que foi completo (1 cm de profundidade) de solução salina gelada normal ou de sódio 0,1 M de tampão fosfato com pH = 7,4 salina. Todos dissecção é feita com o cérebro, na maior parte imersa em solução salina. 1. A remoção da glândula Pineal <ol><li> Colocar-se o cérebro do lado dorsal (em relação à parte inferior da caixa de Petri). A glândula pineal está localizado na região mais caudal ventral entre os dois hemisférios para t apenas rostraisele cerebelo (recesso pineal), e é um pouco abaixo ou na superfície das meninges mais colículo. Remover a glândula pineal primeiro usando duas pinças de ponta pequenos amassados. É na cor rosa, como o córtex, mas é frequentemente cercado de restos de sangue e vasculatura residual de remoção de cérebro. </li></ol> 2. A remoção do MAV <ol><li> Virar o cérebro mais &quot;cabeça para baixo&quot; e separar a artéria vertebral, artérias menores e meninges que recobrem a ponte das meninges e vasculatura do cérebro anterior. A remoção do MAV prosencéfalo é então iniciado. É importante começar ventralmente no processo de dissecação. Grandes artérias principais do círculo de Willis, artérias cerebrais médias (ACM) e artérias anteriores são fortes e servem como &quot;andaimes&quot;, pelo qual as artérias menores e arteríolas superficiais da pial membrana pode então ser removido a partir do córtex com o restante das meninges. Ver revisão por Scremin 7 para mrepresentações visuais de minério e detalhes da vasculatura cerebral superfície. </li><li> Começando com qualquer hemisfério, use a pinça ponta pequenas tortas de cortar a artéria comunicante posterior apenas posterior à conjuntura carótida interna. Assim, separando as árvores mais anterior e posterior arteriais do prosencéfalo. Repita o mesmo processo para o hemisfério contralateral. </li><li> Segurando a MCA ea artéria anterior com a pinça, puxe-a delicadamente em direção anterior-dorsal para que o MAV cobrindo o ventral anterior do córtex (piriforme, tubérculo olfatório) é levantado sobre e em torno do trato olfativo. Isto remove a maior parte do MAV cobrindo o córtex anterior (cingulado e orbital). </li><li> Ligue o cérebro em um ângulo de 45 ° a 90 para a placa de Petri. Os laterais, regiões mais anteriores do MAV em torno das regiões laterais corticais (insular granular, somatossensorial secundário e córtex auditivo) pode ser liberado a partir do córtex segurando a MCA e associados arters e puxando dorsalmente ao longo do córtex. Se necessário, as extremidades das pinças pode ser usado para levantar e libertar as principais artérias a partir do córtex durante a dissecção. </li><li> Agora retire as regiões mais posteriores laterais da MAV. (Nota, é melhor para passar de um a outro hemisfério, durante este processo de colheita para assegurar que a MAV permanece frio e hidratado. Além disso, se a resistência a libertar a partir do córtex MAV é encontrado em um interruptor hemisfério para o hemisfério contralateral temporariamente e depois voltar para o hemisfério original mais tarde.) </li><li> Para remover as regiões mais dorsais da MAV rodeiam a somatossensorial primário e córtex motor transformar-se o cérebro do lado dorsal (em relação à parte inferior da caixa de Petri). Para finalmente libertar a partir de MAV cerebrais, utilizar as extremidades das pinças ao longo do seio sagital. Esta porção do MAV colhido pode ser mantido temporariamente ou em solução salina arrefecida com gelo até que o teste e a análise ou congelados para posterior processamento. Freqüentementeo MAV cobrindo as regiões mais posteriores / caudal do córtex entorrinal (córtices auditivos, visuais e mais caudal) permanece ligado ao córtex. Sua remoção é mostrado no final do vídeo quando o MAV entre o córtex retrosplenial e sobrepondo-se às colículos são dissecados. </li></ol> 3. A remoção do plexo coróide <ol><li> Coloque o lado do cérebro dorsal-se e mantenha no lugar com a pinça maiores Empurre os fórceps menores através da linha média entre os hemisférios e depois usar as extremidades para perfurar através do corpo caloso córtex e corpus (≈ -3,3 milímetros de bregma) na parte superior do a linha média do hipocampo. </li><li> Use as pinças para puxar o córtex com callosum longe do hipocampo dorsal e septo, expondo mais do ventrículo lateral. O plexo coróide podem ser localizados e identificados pela linha ondulada vermelha demarcação da artéria principal que executa o seu comprimento. Use as duas pontas das pinças para erguer as paredes laterais do terceiro ventricle e ampliá-lo no final mais caudal (≈ -4,3 milímetros de bregma 8). </li><li> Usando a pinça pequenos, puxe esta final do plexo coróide livre. Então vá para a região muito anterior entre o septo e caudado / putâmen (extensão mais rostral, ≈ 1,6 milímetros de Bregma) e com a pinça ampliar esta secção do ventrículo e puxar o plexo coróide livre. Execute o mesmo procedimento no hemisfério contralateral para obter a segunda restante do plexo coróide. Novamente, isto pode ser tecido ou mantidos temporariamente em solução salina arrefecida com gelo até que o teste e a análise ou congelados para posterior processamento. </li></ol> 4. A remoção do MAV restante no ventrículo 3 º cobre o tálamo e colículo bem como que sobre as regiões mais caudal do Cortex incluindo Retrosplenial, Auditiva e Visual Cortex <ol><li> Remover todo o hipocampo de ambos os hemisférios, expondo o MAV sobre o tálamo e colículo. A remoção deesta porção da MAV é muito menos difícil do que a remoção de MAV sobre o córtex. </li><li> Puxe esta parte do livre MAV segurando a maior vascularização que recobre a porção anterior do tálamo e puxando caudalmente. Este vasculatura está ligado à rede coliculares supra e fornece sangue ao hipocampo dorsal de rede e tálamo dorsal. Puxar para fora caudalmente e gradualmente livre da rede supracollicular até alcançar as últimas porções da vasculatura círculo caudal arterial. Neste ponto, mais cuidados devem ser tomados para remover qualquer remanescente MAV posterior ventral na superfície do retrosplenial granular, auditivo primário e córtex visual. Tal como acontece com a outra secção de MAV cobrindo as porções mais anteriores do córtex, este tecido pode ser mantido temporariamente ou em solução salina arrefecida com gelo até que o teste e a análise ou congelados para posterior processamento. Qualquer MAV posterior restante ventral colhidas com esta seção MAV segunda devem ser retirados umad adicionadas à secção MAV primeiro dissecados cobrindo o córtex se estão a ser analisados ​​separadamente. </li></ol> 5. Resultados representativos Quando a dissecção é executada correctamente, os tecidos resultantes MAV devem estar em duas entidades intactos, pesando cerca de 35-45 mg no total. O MAV inicialmente dissecadas circundante a maior parte do córtex deve pesar cerca de 25 mg e a MAV cobrindo o tálamo, o córtex occipital colículos e deve pesar cerca de 15 mg. Deve ser um pouco rosado na cor do sangue residual na vasculatura. O plexo coróide bilateral colhida devem estar em duas amostras de tecidos intactos, pesando cada um com 1 a 2 mg. Embora a água em excesso pode ser removido do MAV antes do armazenamento ou de processamento, usando papel de seda, como a utilizada na limpeza das lentes, a fim de evitar a perda de tecido que não é uma boa ideia para remover o excesso de água a partir do plexo coróide dissecado. Figura 1 foi gerado por comparando profil expressão<html> es em três regiões (estriado, córtex parietal e MAV) em condições de controle usando Agilent-014879 Whole Rat Genome 4x44K 60mer arrays de oligonucleotídeos (G4131F, Agilent Technologies, Palo Alto, CA; NCBI GEO Adesão # GPL7294; GSE23093 e GSE29733 que estão presentes em o NCBI repositório GEO). Os dois gráficos na figura pictoricamente mostrar a expressão em 1) no estriado em relação ao córtex parietal e 2) o MAV relação ao córtex parietal. É claro que o striatum eo córtex parietal são muito mais intimamente relacionada com o outro do que o VAM. Os dados que comparam o plexo coróide com o MAV serão apresentados numa publicação futura. No entanto, é provável que o perfil de expressão do MAV e do plexo coróide são mais estreitamente relacionadas entre si do que são para o striatum eo córtex parietal. Figura 2 mostra a resposta diferencial a expressão do gene para a hipertermia (EIH) versus AMPH em comparação MAV para controlar e cada um dos outros. conteúdo &quot;&gt; A expressão dos genes de mais de 11.000 genes com símbolos oficiais de genes do NCBI em MAV dos animais controle foi comparado ao registrado no estriado e do córtex parietal. Mais de 2000 desses genes tinha uma expressão de 2,5 vezes ou mais diferindo no MAV em comparação com os dois neuronal tecidos ricos, e 550 genes tinham uma diferença de 10 vezes maior em expressão. Ligeiramente mais do que 40% (253) eram genes com expressão diminuída de 10 vezes ou mais em MAV e estavam relacionados com função neuronal. Havia 343 genes com uma sobre expressão de 10 vezes ou mais, em comparação com MAV córtex parietal e striatum. Esta lista de genes foi utilizado como ponto de partida com o qual para determinar genes com um enriquecimento muito elevada na MAV. Tabela 1 lista os genes com maior do que a expressão de 15 vezes em comparação com MAV córtex parietal e corpo estriado e classifica-os em relação à função. Muitos destes genes foram relacionados com o sistema vascular e / ou do sistema imunológico. Estes tIPOS de genes deve ser enriquecido cerca de 5 - a 10 - vezes a causa do aumento da vasculatura e do sangue próprio presente nele. No entanto, mesmo para os genes com funções conhecidas gerais vasculares, um aumento superior a 15 vezes indica enriquecimento em MAV. Havia também um número de genes com grandes alterações de dobragem que eram: 1) proteínas da matriz extracelular de lípidos (não especificamente relacionadas com a vasculatura), 2) os transportadores de soluto e 3) e o metabolismo do ácido retinóico. Como o crescimento, bem poucos e genes de diferenciação ou fatores de transcrição foram encontrados. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4285/4285fig1.jpg" /> Figura 1. Comparação da Expressão Gênica em MAV com córtex parietal e estriado. Enredo Vulcão comparando os níveis de expressão gênica do córtex parietal e estriado (gráfico em cima) eo córtex parietal e MAV (gráfico inferior). Os símbolos vermelhos denotam os genes que são significativamente diferentes entre níregiões banho de p &lt;0,05 e têm uma expressão diferencial de 1,5 vezes ou maior entre as regiões. Os símbolos pretos representam os genes que não são significativamente diferentes entre as regiões (p&gt; 0,05) e são menos do que 1,5 vezes na expressão diferentes. Os símbolos indicam genes rosa com uma diferença inferior a 1,5 vezes na expressão, mas uma diferença estatisticamente significativa a p &lt;0,05. Os símbolos amarelos identificar genes que têm uma expressão de 1,5 vezes ou superior, mas esta mudança não é estatisticamente significativa para p &lt;0,05. Abreviaturas Anfetamina AMPH EIH hipertermia induzida ambientalmente Meninges VAM e associado à vasculatura cerebral Norma normotérmica controla <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4285/4285fig2.jpg" /> Figura 2. Efeitos da hipertermia e anfetamina sobre a expressão gênica no MAV. Parcelas Vulcão comparandoníveis de expressão de genes no MAV depois salino, EIH ou AMPH no ponto de tempo de 3 horas. Os símbolos vermelhos denotam os genes que são considerados significativamente diferentes, enquanto os pontos pretos / círculos representam genes que não diferem significativamente entre as regiões. A análise estatística adicional foi usado para verificar que a expressão diferenças entre o controlo e os tratamentos foram de facto estatisticamente significativa. <table border="1"><tbody><tr><td fo:width="1in"> MAV Expressão Cérebro Expressão </td><td fo:width="4.5in"> Símbolos NCBI Gene </td><td fo:width="1.5in"> Especificidade tecido ou função referida (s) </td></tr><tr><td> &gt; 50 vezes </td><td> Anxa2 um, Col8a1, Des, Esm1, Glycam1, Kl um, Lect1, Lepr, Lum, Myh11, OGN, Tagln, Thbs2, TNNT2 </td><td> Vasculatura &amp; coração </td></tr><tr><td> &gt; 50 vezes </td><td> Ccl19, CD74 a, Defb1, Lrrc21, MGL1, MRC1, Msln, Pla2g5, Prg4, RT1-Bb, RT1-Da </td><td> Sistema Imune </td></tr><tr><td> &gt; 50 vezes </td><td> Adh1, Aebp1, Aldh1a2, Gstm2 </td><td> Ácido retinóico e Processamento de lipídeos </td></tr><tr><td> &gt; 50 vezes </td><td> CDH1, COL3A1, COL1A2, Colec12, Cpxm2, CPZ, DCN, Emp3, Gpc3, Nupr1, OMD, Pcolce Slamf9, Tmem27, Tspan8 </td><td> Extracelulares junções Matrix &amp; célula-célula </td></tr><tr><td> &gt; 50 vezes </td><td> AQP1, Asgr1, Kcnj13, Slc5a5, Slc6a13, Slc6a20, Slc22a6, Sned1, Ttr </td><td> Ion &amp; Homeostase Solute </td></tr><tr><td> &gt; 50 vezes </td><td> Alx3, Cdkn1c, FOXC2, IGFBP2, Ifitm1, Ifitm2, Nkx6-1, OSR1, Prrx2, Sfrp1, Tbx15. Upk1b, Wisp2, Wnt6 </td><td> Desenvolvimento e regulação da transcrição </td></tr><tr><td> &gt; 50 vezes </td><td> Gpha2, Mfap5, Mpzl2 Plac8, Scgb1c1, Sostdc1, Steap1 </td><td> Desconhecido &amp; Diversos </td></tr><tr><td> 30-50 vezes </td&gt; <td> Anxa1 um, Angpt2, C6 a, GJB2 Ptgis, Thbd, Timp1 </td><td> Vasculatura &amp; coração </td></tr><tr><td> 30-50 vezes </td><td> Casp12, CCL2, CCR1, Cd14, Cxcl10, Ifitm3, Klra5, Lgals1, LGALS3, Ms4a4a, Ms4a7, Plscr1, SPP1, Xcl1 </td><td> Sistema Imune </td></tr><tr><td> 30-50 vezes </td><td> Col6a3, Cpxm1, Efemp1, FMOD, pop, Nid2 </td><td> Extracelulares junções Matrix &amp; célula-célula </td></tr><tr><td> 30-50 vezes </td><td> Cp, Cubn, Gcgr, S100a6, Scn7a, Sct, Slc4a5, Slc16a11, Slco1a5 </td><td> Ion &amp; homeostase Solute </td></tr><tr><td> 30-50 vezes </td><td> Cfd, Ch25h, Crabp2, Rarres2 </td><td> Ácido retinóico e Processamento de lipídeos </td></tr><tr><td> 30-50 vezes </td><td> BMP6, Casp12, Dab2, Folr1, IGF2, Msx1, Tbx18, Twist1, Wnt5b </td><td> Desenvolvimento e regulação da transcrição </td></tr><tr><td> 30-50 vezes </td><td> Cela3b, CLN6, C1qtnf7, Copz2, Dhrs7c, Gng11, Prss23, Srpx, Vim </td><td> Desconhecido &amp; Diversos </td></tr><tr><td> 15-30 vezes </td><td> Adm, Angpt1, Angptl2, BGN, Cklf um, Cnn1, Cox8h, CTSK, F13a1, Gja5, Klf4, Lox, Lyz, Myl9, Procr, PROS1, RT1-Ba, Serpinb10, Serping1, Serpinf1, Tgm2, Tnmd, Trim63, Txnip um, Vamp5, VTN </td><td> Vasculatura &amp; coração </td></tr><tr><td> 15-30 vezes </td><td> Ada um, Bst2, Ccl6, CD40, CD68, CTSC, Dap, Faim3, Fkbp9, Fxyd5, Fmo1, Glipr1, Ier3, Ifi47, Igsf6, Msc, Nfatc4, RT1-DB1, Serpinb1a, TiR4, Tubb6 </td><td> Sistema Imune </td></tr><tr><td> 15-30 vezes </td><td> Adamtsl4, COL1A1, Crb3, DPT, Egfl3, Fbn1, Fbln1, FBLN5, Fn1, ITGB4, LAMA2, Lgals3bp, Loxl1, Mfap4, Mmp14, Mmp23, CIPP, SERPINH1, TIMP3 </td><td> Extracelulares junções Matrix &amp; célula-célula </td></tr><tr><td> 15-30 vezes </td><td> Cybrd1, Selenbp1, Slc2a4, Slc9a2, Slc13a3, Slc16a4, Slc22a8, Slc22a18 </td><td> Ion &amp; homeostase Solute </td></tr><tr><td> 15-30 vezes </td><td> AGPAT2, Bdh2, Cyp26b1, Lpar3, Ltb4dh, Olr1, Pon3, Rbp1, RBP4 </td><td> Ácido retinóico e Processamento de lipídeos </td></tr><tr><td> 15-30 vezes </td><td> Atf3, Dkk4, Eya2, Ifitm7, Ltbp1, Mustn1, Nr2f2, ptrf, Sphk1, Tgfbi, Tcea3 Tcfap2b, Wnt2b, Wnt5a, Zic1 </td><td> Desenvolvimento e regulação da transcrição </td></tr><tr><td> 15-30 vezes </td><td> Adamts12, Adamtsl3, C1r, Crispld2, Crygn, CYP1B1, DSE, Enpep, Enpp2, Epn3, Flna, FMO3, Gnmt, Gprc5c, Hspb1, Klc3, Krt18, Krt19, MDK, Mesp1, Ms4a6a, Ms4a6b, Ms4a11, Net1, Pdlim2, Phactr2, PLP2, Ppp1r3b, Pqlc3, Rin3, Spag11, Sult1a1, Tmem106a, Wfikkn2 </td><td> Desconhecido &amp; Diversos </td></tr></tbody></table> * Genes incluídos na tabela deve ser tanto a expressão mais de 15 vezes acima do estriado e PARIETal córtex e de 5 vezes acima dos níveis de fundo. Quanto mais baixa das duas taxas (MAV / estriado ou MAV / córtex parietal) para cada gene foi usado para agrupamento. um Genes são encontradas nas células endoteliais, mas também provavelmente desempenham um papel importante na mediação de respostas imunes. Tabela 1. Genes com uma * 15 vezes ou mais a expressão aumentada em comparação com MAV striatum eo córtex parietal.

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</ol>

Não temos nada a revelar. O trabalho aqui apresentado pode não representam, necessariamente, a opinião do Food and Drug Administration.

Aspectos técnicos da MAV e dissecação do plexo coróide É crítico durante a dissecção do MAV ter o cérebro &quot;submergida&quot; na maioria das vezes em solução salina normal ou de sódio tamponada com fosfato. Permitindo que o VAM e córtex para desidratar durante a dissecção resultará na MAV aderindo firmemente a camada cortical I. Isto irá aumentar a quantidade de tecido cortical e colhida com o MAV / ou resultar na incapacidade de remover estas secções MAV aderentes a partir do córtex. Além disso, a paciência é necessária durante a dissecção. Mais uma vez, se encontra uma certa resistência na remoção do MAV do córtex em um hemisfério durante a dissecação, mude para o outro hemisfério e voltar mais tarde para o lado onde a resistência foi encontrado. Este método faz um pouco de prática para aperfeiçoar e requer cerca de 5 a 15 &quot;práticas&quot; dissecções antes uma colheita consistentemente uniforme de tecido MAV é alcançado. O método de começar a dissecção e removal do MAV no círculo arterial na base do cérebro, facilita a remoção das meninges, utilizando o maior vasculatura como suporte &quot;andaime&quot;. Grande parte do sangue originalmente na vasculatura MAV após o sacrifício deverá ser ejectado durante a dissecação, e menos de 5% do RNA colhido MAV devem ser de origem arterial. É possível remover quase todo o sangue por perfusão do animal, com 50 a 70 ml de solução salina, utilizando técnicas histológicas, antes de decapitação e remoção do cérebro. No entanto, é, em seguida, muito mais difícil de visualizar os tecidos MAV durante a dissecção. As três fontes mais prováveis ​​de &quot;contaminação&quot; dos tecidos MAV são a glândula pineal, camada cortical I tecido e tecido bulbo olfativo residual, mas também é possível obter o tecido da glândula pituitária na preparação. Contaminação pineal no MAV é detectado pelo MAV contendo uma ronda 1-2 esfera mm de diâmetro que é vermelha escura. A função primáriada glândula pineal é normalmente considerado completamente diferente do MAV. A sua função principal é produzir melatonina, que regula os aspectos do ritmo circadiano 9, e em 10 de lipoxigenação precursores lipídicas. Embora o Lox gene que regula a actividade de lipoxigenase, pensava-se estar presente em adultos, principalmente na glândula pineal 10, os nossos resultados indicam que é também consistentemente presente em níveis significativos em MAV. Residuais resultados bulbo olfativo corticais ou contaminação no rosada tecido MAV na web como ter algumas 1-2 milímetros tecidos mais densos que são muito mais pálida na cor incluído nele. Isto pode ser visto por &quot;flutuar&quot; do MAV na superfície do tampão, e, em seguida, removendo os tecidos mais pesados ​​corticais ou ampola, utilizando as duas pinças de dissecação. Se a contaminação da camada cortical MAV de I tecido, tecido hipotalâmico ou a glândula pineal está presente, então, vários genes terão uma signifiexpressão significativamente maior do que o que está normalmente presente em uma dissecção &quot;limpa&quot;. A contaminação do MAV com glândula pineal irá resultar em maior expressão de aril-alquilamina N-acetiltransferase (Aanat) que é necessário para a síntese da melatonina. Infelizmente, se a contaminação pineal ocorre durante a dissecção MAV, os níveis de Lox em MAV não será capaz de ser determinada com precisão. A contaminação do MAV com tecido cortical irá resultar em maior expressão de genes específicos de neurónios, como hippocalcin (Hpca), parvalbumina (Pvalb) e / ou receptor pentraxina neuronal (Nptxr). A contaminação de MAV com tecido hipotalâmico resultará no aumento da expressão da hormona de crescimento 1 (Gh1), ​​proopiomelanocortina (POMC). No caso em que alguma contaminação não existe nos tecidos colhidos, a maioria destes genes pode ser identificado e não usado em análise de expressão génica. Isto é particularmente importante para os genes presentes no blo circulanteod que ainda podem estar presentes na MAV ou plexo coróide. Interpretting dados de expressão gênica provenientes da colheita da MAV e plexo coróide A superfície cerebral (superficial) a vasculatura juntamente com meninges associadas (MAV) e o plexo coróide são necessárias para o fluxo de sangue cerebral e fluido cerebrospinal (CSF) a homeostase 4,11, 12, 13, 14, 15, 16, 17. A colheita de tecido é apropriada para análises bioquímicas e fisiológicas, e o VAM tem sido mostrado para ser sensível aos danos produzidos por anfetamina e 1,2 hipertermia por meio de análise de expressão génica. Estes resultados estão relacionados com o que também é conhecido sobre a hipertermia severa e exposição a anfetaminas na vasculatura cerebral, em geral, 18,19,20. Dados clínicos humanos apóia a crença de que a vasculatura subdural é sensível a danos por 21,22 anfetaminas e metanfetaminas. Como assim, as maiores e menores vasculatures cerebrais includção aqueles na camada pial das meninges que são colhidas em MAV são de interesse potencial elevado quando se investiga tipos concussivas de traumatismo craniano 23,24 25. O perfil de expressão gênica atual resultou da MAV indica que o pial e, possivelmente, as membranas aracnóide das meninges pode desempenhar um papel maior do que o esperado na regulação composição CSF. No futuro, por meio da utilização de técnicas de microscopia de dissecação, pode ser possível para separar ainda mais os tecidos que constituem a MAV, de modo que as membranas pial e aracnóide pode ser separado a partir do presente vasculatura arterial maior e, possivelmente, um do outro. Isto irá permitir uma melhor interpretação da função de cada um destes três componentes da MAV colhida.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente / equipamento </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> Solução salina normal (9 gramas de solução salina / 1 litro de H 2 O) </td><td> Interno </td><td></td><td> Buffer de dissecção </td></tr><tr><td> 0,1 M fosfato de sódio pH 7,4 </td><td> Interno </td><td></td><td> Buffer de dissecção </td></tr><tr><td> Rongeurs osso </td><td> Roboz </td><td> RS-8300 </td><td> Remoção de osso do crânio </td></tr><tr><td> Fórceps curvado ponta (4 &quot;de comprimento e 0,8 mm de largura ponta) </td><td> Roboz </td><td> RS-5135 ou RS-5137 </td><td> Fórceps de dissecação </td></tr><tr><td> Fórceps reto-ponta (5,5 &quot;de comprimento) </td><td> Roboz </td><td> RS-8124 ou RS-8104 </td><td> Molho pinça polegar </td></tr></tbody></table>

a descrição visual do dissecção da vasculatura cerebral superfície e meninges associados e plexo coróide do cérebro de um rato

A Visual Description of the Dissection of the Cerebral Surface Vasculature and Associated Meninges and the Choroid Plexus from Rat Brain

Esta apresentação de vídeo foi criado para mostrar um método de colheita das duas mais importantes estruturas altamente vasculares, que não reside no cérebro próprio, que a função do cérebro anterior de apoio. Eles são a superfície cerebral (superficial), juntamente com vasculatura meninges associados (MAV) e plexo coróide que são necessárias para o fluxo sanguíneo cerebral e do líquido cefalorraquidiano (LCR) homeostase. O tecido colhido é adequado para análises bioquímicas e fisiológicas, e o MAV tem sido mostrado para ser sensível aos danos produzidos por anfetamina e 1,2 hipertermia. Como assim, as maiores e menores vasculatures cerebrais colhidas no MAV são de interesse potencialmente elevado ao investigar tipos concussive de traumatismo craniano. O MAV dissecados nesta apresentação consiste no pial e alguns da membrana aracnoideia (dura menos) das meninges e os vasos de superfície maior e menor cerebral. O plexo coróide dissecado é a estrutura que reside no lateral ventrículos como descrito por Oldfield e McKinley 3,4,5,6. Os métodos utilizados para a colheita de estes dois tecidos também facilita a colheita de tecido cortical regionais desprovido de meninges e vasculatura cerebral maior superfície, e é compatível com a colheita de tecidos cerebrais, tais como estriado, hipotálamo, hipocampo, etc A dissecação dos dois tecidos leva 5-10 total de min. Os níveis de expressão de gene para a MAV dissecados e do plexo coróide, como mostrado e descrito nesta apresentação podem ser encontradas em GSE23093 (MAV) e GSE29733 (plexo coróide) no repositório GEO NCBI. Estes dados têm sido e estão sendo, utilizados para ajudar a compreender melhor o funcionamento do MAV e do plexo coróide e como neurotóxicos eventos, tais como a hipertermia grave e AMPH afectar adversamente a sua função.

Este vídeo de apresentação mostra um método de colheita das duas mais importantes estruturas altamente vasculares que suportam a função do cérebro anterior. Eles são a superfície cerebral (superficial), juntamente com vasculatura meninges associados (MAV) e plexo coróide que são necessárias para o fluxo sanguíneo cerebral e do líquido cefalorraquidiano (LCR) homeostase.

A descrição visual do Dissecção da vasculatura cerebral Superfície e Meninges Associados e plexo coróide do cérebro de um rato

Esta apresentação em vídeo foi criada para mostrar um método de colheita das duas estruturas altamente vascularizadas mais importantes que não residem dentro do cérebro...

O objetivo geral deste procedimento é dissecar de forma eficiente e rápida as porções da túnica e da aracnoide das meninges e a vasculatura arterial associada, que recobrem a superfície do córtex telencefálico e do mesencéfalo, tálamo e corpos calosos, bem como coletar o plexo coroide dos ventrículos laterais. Isso é realizado primeiramente removendo a glândula pineal e separando as meninges e as árvores arteriais aderidas ao telencéfalo. Em segundo lugar, as artérias e arteríolas na superfície cortical são cuidadosamente removidas, iniciando-se no círculo ventral de Willis e, em seguida, prosseguindo para as superfícies corticais dorsais, de modo que a túnica e as membranas aracnoideas remanescentes permaneçam aderidas à vasculatura, tomando o cuidado de minimizar a coleta de tecidos adjacentes da superfície cortical.Em seguida, o córtex e as fibras comissurais são dissecados afastando-se do septo e do hipocampo, expondo os ventrículos laterais para permitir a coleta do plexo coroide. Por fim, o hipocampo é removido, expondo o tálamo e os colículos do mesencéfalo. As meninges e a vasculatura associada que recobrem esta região são então dissecadas.Por fim, a integridade e especificidade das meninges dissecadas e da vasculatura arterial associada, bem como do plexo coroide, podem ser determinadas comparando os perfis de expressão gênica de cada uma dessas regiões. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais em pesquisas relacionadas à vascularização que sustenta a função cerebral. Inclui semelhanças, comparações e diferenças na função do plexo coroide em relação às meninges e à sua vasculatura arterial associada, com respeito ao fluxo sanguíneo, função do LCR, agressões neurotóxicas e trauma cerebral.Para iniciar este protocolo, coloque os cérebros recém-removidos de ratos imediatamente após a eutanásia em solução salina normal gelada por cinco minutos. É importante permitir que o cérebro esfrie por esse período antes da dissecação, para que as quatro meninges cerebrais e a vasculatura arterial associada, ou VAA, possam ser separadas da superfície do córtex. Em seguida, coloque o cérebro no fundo de uma placa de Petri de vidro sobre gelo, com um centímetro de solução salina normal gelada ou solução tampão de fosfato de sódio 0,1 molar com pH de 7,4.Toda a dissecação deve ser realizada com o cérebro, em sua maior parte, imerso em solução salina. Para iniciar a dissecação, posicione o cérebro com o lado dorsal voltado para cima na placa de Petri e localize a glândula pineal, que está na região ventral mais profunda entre os dois hemisférios. Logo à frente do cerebelo e logo abaixo, ou na superfície das meninges.Sobre os colículos. Remova a glândula pineal usando duas pinças pequenas com pontas curvadas. Observe que a glândula pineal é de cor rosa, como o córtex, mas geralmente está rodeada por remanescentes de sangue e vasos sanguíneos residuais provenientes da remoção do cérebro.Em seguida, vire o cérebro de cabeça para baixo na placa de Petri. Então, separe a artéria vertebral e as artérias menores e as meninges que recobrem a ponte das meninges e da vasculatura do prosencéfalo. A seguir, inicie a remoção do MAV.É importante começar ventralmente no processo de dissecação com as artérias principais do círculo de Willis, artérias cerebrais médias e artérias anteriores. Em seguida, iniciando em um dos hemisférios, use pinças de ponta curvada pequenas para seccionar a artéria comunicante posterior logo posteriormente à junção carótida interna, separando assim as árvores arteriais mais anterior e posterior do prosencéfalo. Depois, repita o mesmo processo para o hemisfério contralateral.Agora, segurando a artéria cerebral média (ACM) e a artéria anterior com a pinça, puxe suavemente em direção anterior dorsal, de modo que a membrana aracnoide ventral (MAV) que recobre o córtex anterior ventral seja levantada para cima e ao redor do trato olfatório. Isso remove grande parte da MAV que recobre o córtex anterior. Gire o cérebro em um ângulo de 45 a 90 graus em relação à placa de Petri, de forma que as regiões laterais mais anteriores da MAV ao redor das regiões corticais laterais possam ser soltas do córtex; segure a ACM e as artérias associadas e puxe suavemente em direção dorsal ao longo do córtex.Se necessário, as pontas da pinça podem ser usadas para levantar e soltar as artérias principais do córtex durante a dissecação. Agora, remova as regiões laterais mais posteriores do MAV. Observe que é preferível alternar de um hemisfério para o outro durante esse processo de coleta para garantir que o MAV permaneça frio e hidratado; também alterne os hemisférios se houver qualquer resistência ao soltar o MAV do córtex.Por fim, para remover as regiões mais dorsais da MAV ao redor do córtex somatossensorial primário e do córtex motor, vire o cérebro com o lado dorsal voltado para cima para soltar esta seção do cérebro, utilizando as pontas da pinça ao longo do seio sagital. Esta porção da MAV coletada pode ser temporariamente mantida em solução salina gelada até ser necessária para testes e análises, ou congelada para processamento posterior. Frequentemente, a MAV que recobre as regiões occipitais mais posteriores do córtex permanece aderida.A sua remoção é mostrada em uma seção subsequente deste vídeo. Para remover o plexo coroide, posicione primeiro o cérebro com o lado dorsal voltado para cima e segure-o no lugar com a pinça maior. Em seguida, empurre a pinça menor para baixo através da linha média entre os hemisférios e use as pontas para perfurar a córtex e o corpo caloso, atingindo o topo da linha média do hipocampo.Em seguida, use a pinça para puxar o córtex com o corpo caloso afastando-o do hipocampo dorsal e do septo, expondo a maior parte do ventrículo lateral. O plexo coroide pode ser localizado e identificado pela linha vermelha ondulada que delimita a artéria principal que percorre seu comprimento. Use as duas extremidades da pinça para alavancar as paredes laterais do terceiro ventrículo e ampliá-lo em sua extremidade mais caudal.Em seguida, utilizando a pinça pequena, puxe este extremo do plexo coroide livre. A seguir, use a pinça para alargar a região bem anterior entre o septo e a região do putâmen caudado e solte o plexo coroide também por esta extremidade. Realize também o mesmo procedimento no hemisfério contralateral para obter o segundo plexo coroide remanescente.Novamente, esse tecido pode ser temporariamente mantido em gelo, solução salina fria ou congelado para processamento posterior. Para remover o MAV remanescente que cobre as regiões posteriores do córtex, primeiramente remova todo o hipocampo de ambos os hemisférios, expondo o MAV sobre o tálamo e os colículos. Observe que a remoção dessa porção do MAV será muito menos difícil do que sua remoção do córtex para o MAV restante.Ao segurar a vasculatura maior que sobrepõe a porção anterior do tálamo e puxar suavemente com cuidado, essa vasculatura está conectada à rede supra-cocurricular e fornece sangue à rede do hipocampo dorsal e do tálamo dorsal. Puxe cuidadosamente para longe e, eventualmente, a rede supra será liberada, permitindo que as últimas porções do círculo arterial coddle possam então ser alcançadas. Nesse momento, deve-se ter mais cuidado para remover qualquer MAV remanescente na superfície da linha reticular granular, primária, auditiva e visual.Qualquer MAV cortical ventral posterior remanescente colhida com esta segunda seção de MAV tálamo e corpo caloso deve ser removida e adicionada à primeira seção de MAV cortical dissecada, caso devam ser analisadas separadamente. Em seguida, para comparar os perfis de expressão gênica entre o estriado, o córtex parietal e as regiões de MAV sob condições controle, pode-se realizar análise de expressão gênica utilizando matrizes oligonucleotídicas de genoma inteiro de rato Agilent 0 1 4 8 7 9, quatro por 44.060 meros. Mais detalhes sobre processamento, escaneamento e armazenamento inicial dos dados podem ser encontrados em Thomas et al.Quando a dissecação for realizada corretamente, os tecidos de MAV resultantes devem formar duas entidades intactas com peso total de aproximadamente 35 a 45 miligramas. A MAV inicialmente dissecada ao redor da maior parte do córtex deve pesar cerca de 25 miligramas, e aquela que cobre o tálamo, os corpos calosos e o córtex occipital deve pesar cerca de 15 miligramas.O tecido deve apresentar uma coloração levemente rosada devido ao sangue residual na vasculatura. O plexo coroide bilateral colhido deve estar em duas amostras teciduais intactas, cada uma pesando de um a dois miligramas, como visto aqui. Aqui observamos uma comparação dos perfis de expressão gênica no estriado, córtex parietal e MAV sob condições controle.O gráfico superior mostra a expressão no estriado em comparação com o córtex parietal. Enquanto o gráfico inferior mostra a expressão na MAV em comparação com o córtex parietal, pode-se observar que o estriado e o córtex parietal estão muito mais intimamente relacionados entre si do que a MAV. Aqui observamos a expressão gênica diferencial na MAV em resposta à hipertemia em comparação com o controle, em resposta à anfetamina em comparação com o controle e na hipertemia versus anfetamina.Por fim, aqui observamos genes com expressão superior a 15 vezes maior no VMA em comparação com o córtex parietal e o estriado, caracterizados por sua função. Muitos desses genes estão relacionados ao sistema vascular e/ou ao sistema imunológico. Outros genes com mudanças de expressão muito grandes são proteínas da matriz extracelular, transportadores saute, e metabolismo de lipídios e ácido retinóico.Ao realizar este procedimento, é importante ter paciência durante a dissecação da VMA. Também é fundamental manter o cérebro submerso em solução salina isotônica ou solução salina tamponada com fosfato durante toda a dissecação. Além disso, recomenda-se praticar a seção da VMA em quatro ou cinco ratos antes de obter tecidos para gerar dados experimentais.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

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