A descrição visual do Dissecção da vasculatura cerebral Superfície e Meninges Associados e plexo coróide do cérebro de um rato
14 de novembro de 2012
Este vídeo de apresentação mostra um método de colheita das duas mais importantes estruturas altamente vasculares que suportam a função do cérebro anterior. Eles são a superfície cerebral (superficial), juntamente com vasculatura meninges associados (MAV) e plexo coróide que são necessárias para o fluxo sanguíneo cerebral e do líquido cefalorraquidiano (LCR) homeostase.
O objetivo geral deste procedimento é dissecar de forma eficiente e rápida as porções da túnica e da aracnoide das meninges e a vasculatura arterial associada, que recobrem a superfície do córtex telencefálico e do mesencéfalo, tálamo e corpos calosos, bem como coletar o plexo coroide dos ventrículos laterais. Isso é realizado primeiramente removendo a glândula pineal e separando as meninges e as árvores arteriais aderidas ao telencéfalo. Em segundo lugar, as artérias e arteríolas na superfície cortical são cuidadosamente removidas, iniciando-se no círculo ventral de Willis e, em seguida, prosseguindo para as superfícies corticais dorsais, de modo que a túnica e as membranas aracnoideas remanescentes permaneçam aderidas à vasculatura, tomando o cuidado de minimizar a coleta de tecidos adjacentes da superfície cortical.
Em seguida, o córtex e as fibras comissurais são dissecados afastando-se do septo e do hipocampo, expondo os ventrículos laterais para permitir a coleta do plexo coroide. Por fim, o hipocampo é removido, expondo o tálamo e os colículos do mesencéfalo. As meninges e a vasculatura associada que recobrem esta região são então dissecadas.
Por fim, a integridade e especificidade das meninges dissecadas e da vasculatura arterial associada, bem como do plexo coroide, podem ser determinadas comparando os perfis de expressão gênica de cada uma dessas regiões. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais em pesquisas relacionadas à vascularização que sustenta a função cerebral. Inclui semelhanças, comparações e diferenças na função do plexo coroide em relação às meninges e à sua vasculatura arterial associada, com respeito ao fluxo sanguíneo, função do LCR, agressões neurotóxicas e trauma cerebral.
Para iniciar este protocolo, coloque os cérebros recém-removidos de ratos imediatamente após a eutanásia em solução salina normal gelada por cinco minutos. É importante permitir que o cérebro esfrie por esse período antes da dissecação, para que as quatro meninges cerebrais e a vasculatura arterial associada, ou VAA, possam ser separadas da superfície do córtex. Em seguida, coloque o cérebro no fundo de uma placa de Petri de vidro sobre gelo, com um centímetro de solução salina normal gelada ou solução tampão de fosfato de sódio 0,1 molar com pH de 7,4.
Toda a dissecação deve ser realizada com o cérebro, em sua maior parte, imerso em solução salina. Para iniciar a dissecação, posicione o cérebro com o lado dorsal voltado para cima na placa de Petri e localize a glândula pineal, que está na região ventral mais profunda entre os dois hemisférios. Logo à frente do cerebelo e logo abaixo, ou na superfície das meninges.
Sobre os colículos. Remova a glândula pineal usando duas pinças pequenas com pontas curvadas. Observe que a glândula pineal é de cor rosa, como o córtex, mas geralmente está rodeada por remanescentes de sangue e vasos sanguíneos residuais provenientes da remoção do cérebro.
Em seguida, vire o cérebro de cabeça para baixo na placa de Petri. Então, separe a artéria vertebral e as artérias menores e as meninges que recobrem a ponte das meninges e da vasculatura do prosencéfalo. A seguir, inicie a remoção do MAV.
É importante começar ventralmente no processo de dissecação com as artérias principais do círculo de Willis, artérias cerebrais médias e artérias anteriores. Em seguida, iniciando em um dos hemisférios, use pinças de ponta curvada pequenas para seccionar a artéria comunicante posterior logo posteriormente à junção carótida interna, separando assim as árvores arteriais mais anterior e posterior do prosencéfalo. Depois, repita o mesmo processo para o hemisfério contralateral.
Agora, segurando a artéria cerebral média (ACM) e a artéria anterior com a pinça, puxe suavemente em direção anterior dorsal, de modo que a membrana aracnoide ventral (MAV) que recobre o córtex anterior ventral seja levantada para cima e ao redor do trato olfatório. Isso remove grande parte da MAV que recobre o córtex anterior. Gire o cérebro em um ângulo de 45 a 90 graus em relação à placa de Petri, de forma que as regiões laterais mais anteriores da MAV ao redor das regiões corticais laterais possam ser soltas do córtex; segure a ACM e as artérias associadas e puxe suavemente em direção dorsal ao longo do córtex.
Se necessário, as pontas da pinça podem ser usadas para levantar e soltar as artérias principais do córtex durante a dissecação. Agora, remova as regiões laterais mais posteriores do MAV. Observe que é preferível alternar de um hemisfério para o outro durante esse processo de coleta para garantir que o MAV permaneça frio e hidratado; também alterne os hemisférios se houver qualquer resistência ao soltar o MAV do córtex.
Por fim, para remover as regiões mais dorsais da MAV ao redor do córtex somatossensorial primário e do córtex motor, vire o cérebro com o lado dorsal voltado para cima para soltar esta seção do cérebro, utilizando as pontas da pinça ao longo do seio sagital. Esta porção da MAV coletada pode ser temporariamente mantida em solução salina gelada até ser necessária para testes e análises, ou congelada para processamento posterior. Frequentemente, a MAV que recobre as regiões occipitais mais posteriores do córtex permanece aderida.
A sua remoção é mostrada em uma seção subsequente deste vídeo. Para remover o plexo coroide, posicione primeiro o cérebro com o lado dorsal voltado para cima e segure-o no lugar com a pinça maior. Em seguida, empurre a pinça menor para baixo através da linha média entre os hemisférios e use as pontas para perfurar a córtex e o corpo caloso, atingindo o topo da linha média do hipocampo.
Em seguida, use a pinça para puxar o córtex com o corpo caloso afastando-o do hipocampo dorsal e do septo, expondo a maior parte do ventrículo lateral. O plexo coroide pode ser localizado e identificado pela linha vermelha ondulada que delimita a artéria principal que percorre seu comprimento. Use as duas extremidades da pinça para alavancar as paredes laterais do terceiro ventrículo e ampliá-lo em sua extremidade mais caudal.
Em seguida, utilizando a pinça pequena, puxe este extremo do plexo coroide livre. A seguir, use a pinça para alargar a região bem anterior entre o septo e a região do putâmen caudado e solte o plexo coroide também por esta extremidade. Realize também o mesmo procedimento no hemisfério contralateral para obter o segundo plexo coroide remanescente.
Novamente, esse tecido pode ser temporariamente mantido em gelo, solução salina fria ou congelado para processamento posterior. Para remover o MAV remanescente que cobre as regiões posteriores do córtex, primeiramente remova todo o hipocampo de ambos os hemisférios, expondo o MAV sobre o tálamo e os colículos. Observe que a remoção dessa porção do MAV será muito menos difícil do que sua remoção do córtex para o MAV restante.
Ao segurar a vasculatura maior que sobrepõe a porção anterior do tálamo e puxar suavemente com cuidado, essa vasculatura está conectada à rede supra-cocurricular e fornece sangue à rede do hipocampo dorsal e do tálamo dorsal. Puxe cuidadosamente para longe e, eventualmente, a rede supra será liberada, permitindo que as últimas porções do círculo arterial coddle possam então ser alcançadas. Nesse momento, deve-se ter mais cuidado para remover qualquer MAV remanescente na superfície da linha reticular granular, primária, auditiva e visual.
Qualquer MAV cortical ventral posterior remanescente colhida com esta segunda seção de MAV tálamo e corpo caloso deve ser removida e adicionada à primeira seção de MAV cortical dissecada, caso devam ser analisadas separadamente. Em seguida, para comparar os perfis de expressão gênica entre o estriado, o córtex parietal e as regiões de MAV sob condições controle, pode-se realizar análise de expressão gênica utilizando matrizes oligonucleotídicas de genoma inteiro de rato Agilent 0 1 4 8 7 9, quatro por 44.060 meros. Mais detalhes sobre processamento, escaneamento e armazenamento inicial dos dados podem ser encontrados em Thomas et al.
Quando a dissecação for realizada corretamente, os tecidos de MAV resultantes devem formar duas entidades intactas com peso total de aproximadamente 35 a 45 miligramas. A MAV inicialmente dissecada ao redor da maior parte do córtex deve pesar cerca de 25 miligramas, e aquela que cobre o tálamo, os corpos calosos e o córtex occipital deve pesar cerca de 15 miligramas.
O tecido deve apresentar uma coloração levemente rosada devido ao sangue residual na vasculatura. O plexo coroide bilateral colhido deve estar em duas amostras teciduais intactas, cada uma pesando de um a dois miligramas, como visto aqui. Aqui observamos uma comparação dos perfis de expressão gênica no estriado, córtex parietal e MAV sob condições controle.
O gráfico superior mostra a expressão no estriado em comparação com o córtex parietal. Enquanto o gráfico inferior mostra a expressão na MAV em comparação com o córtex parietal, pode-se observar que o estriado e o córtex parietal estão muito mais intimamente relacionados entre si do que a MAV. Aqui observamos a expressão gênica diferencial na MAV em resposta à hipertemia em comparação com o controle, em resposta à anfetamina em comparação com o controle e na hipertemia versus anfetamina.
Por fim, aqui observamos genes com expressão superior a 15 vezes maior no VMA em comparação com o córtex parietal e o estriado, caracterizados por sua função. Muitos desses genes estão relacionados ao sistema vascular e/ou ao sistema imunológico. Outros genes com mudanças de expressão muito grandes são proteínas da matriz extracelular, transportadores saute, e metabolismo de lipídios e ácido retinóico.
Ao realizar este procedimento, é importante ter paciência durante a dissecação da VMA. Também é fundamental manter o cérebro submerso em solução salina isotônica ou solução salina tamponada com fosfato durante toda a dissecação. Além disso, recomenda-se praticar a seção da VMA em quatro ou cinco ratos antes de obter tecidos para gerar dados experimentais.
Visão Geral
Esta apresentação em vídeo demonstra um método para colher a vasculatura da superfície cerebral e o plexo coroide, essenciais para manter o fluxo sanguíneo cerebral e a homeostase do líquido cefalorraquidiano.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Vascular
- Neuroanatomia
Contexto
- A vascularização da superfície cerebral e o plexo coroide são vitais para a função cerebral.
- Compreender seus papéis pode orientar pesquisas sobre a dinâmica do líquido cefalorraquidiano.
- Técnicas de dissecação são essenciais para o estudo dessas estruturas.
- Perfis de expressão gênica podem revelar diferenças funcionais entre esses componentes vasculares.
Objetivo do Estudo
- Dissecar e coletar eficientemente as meninges e a vasculatura associada.
- Explorar a relação entre o plexo coroide e a função do líquido cefalorraquidiano.
- Fornecer informações sobre agressões neurotóxicas e trauma cerebral.
Métodos Utilizados
- Dissecação das meninges e da vasculatura arterial de cérebros de ratos.
- Remoção cuidadosa do plexo coroide dos ventrículos laterais.
- Uso de pinça para colheita precisa, minimizando danos aos tecidos adjacentes.
- Comparação dos perfis de expressão gênica para avaliar a integridade dos tecidos colhidos.
Resultados Principais
- Dissecação bem-sucedida das meninges e da vasculatura associada.
- A coleta do plexo coroide foi realizada com dano tecidual mínimo.
- A análise da expressão gênica indicou perfis distintos para cada região coletada.
- Conhecimentos obtidos sobre os papéis funcionais do plexo coroide e das meninges.
Conclusões
- Este método fornece uma abordagem confiável para o estudo das estruturas vasculares cerebrais.
- Compreender esses componentes pode aprimorar o conhecimento sobre a dinâmica do líquido cefalorraquidiano.
- Pesquisas futuras podem se basear nesses achados para abordar a função cerebral e a patologia.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este método permite que pesquisadores de biofármacos isolem e analisem duas estruturas neurovasculares críticas — a vasculatura associada às meninges (MAV) e o plexo coroide — apoiando a validação de alvos na descoberta de fármacos para o sistema nervoso central (SNC). Ao fornecer tecido bioquimicamente viável para perfis de expressão gênica, facilita a desvinculação mecanicista de vias envolvidas na homeostase vascular e dos fluidos, implicadas em distúrbios neurodegenerativos e neuropsiquiátricos. A abordagem aumenta a confiança preditiva na fase inicial da descoberta ao associar a função vascular a agressões neurotóxicas, como a exposição à anfetamina e à hipertemia.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação da expressão gênica vascular e imunológica no VAM para validar alvos envolvidos no acoplamento neurovascular e na função da barreira hematoencefálica.
- Valor Operacional: Fornece um fluxo de trabalho padronizado de dissecção que produz tecidos intactos de VAM e plexo coroide adequados para análises omicas posteriores.
- Valor Preditivo: Apoia a descoberta de biomarcadores ao revelar expressão diferencial de genes em resposta a desafios neurotóxicos, auxiliando na priorização de alvos.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera preparações de tecido com integridade vascular preservada, permitindo o desenvolvimento confiável de ensaios para alvos cerebrovasculares e reguladores do LCR.
- Valor Operacional: A dissecção leva de 5 a 10 minutos, possibilitando o preparo de tecidos em alto rendimento para campanhas de triagem.
- Valor de Reprodutibilidade: A coleta consistente de VAM (~25–35 mg associado ao córtex, ~15 mg do tálamo) e do plexo coroide (1–2 mg por lado) permite entrada padronizada para análises comparativas.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Translacional: Os tecidos obtidos são modelos relevantes para doenças que permitem estudar as respostas vasculares a agressões que simulam condições clínicas, como lesão cerebral traumática e neurotoxicidade.
- Redução de Riscos Mecanística: As comparações de expressão gênica entre MAV, plexo coroide e regiões corticais ajudam a reduzir riscos em alvos ao esclarecer a sinalização específica do compartimento vascular versus o parênquima do SNC.
- Continuidade Pré-clínica: Permite a avaliação longitudinal do engajamento de alvos vasculares desde a fase de descoberta até as fases pré-clínicas, utilizando isolamento consistente de tecidos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere na fase inicial da descoberta, apoiando a validação de alvos orientada por hipóteses e contribuindo para a identificação de compostos líderes por meio do esclarecimento da via vascular.
- Biologia da Descoberta: Facilita a elucidação de vias ao isolar a vasculatura meníngea e o plexo coroide para estudar seus papéis distintos no fluxo sanguíneo cerebral e na homeostase do LCR.
- Triagem: Produz insumos teciduais padronizados, permitindo testes reprodutíveis de compostos em ensaios vasculares e neuroimunes.
- Análises: Gera saídas quantitativas de expressão gênica (por exemplo, por meio de matrizes Agilent de genoma inteiro de rato) que permitem a comparação de respostas vasculares entre diferentes condições experimentais.
- Pesquisa Translacional: Apoia o alinhamento de biomarcadores ao associar perfis moleculares de MAV e plexo coroide a estados fisiopatológicos, como neurotoxicidade induzida por hipertermia.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável de isolamento de tecidos aplicável a múltiplos projetos do SNC que estudam alvos vasculares, meníngeos ou do plexo coroide.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança na validação do alvo ao reduzir a ambiguidade mecanicista nas vias neurovasculares e relacionadas ao LCR.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade por meio de uma técnica padronizada de dissecação e manipulação de tecidos em solução salina isotônica.
- Valor Estratégico: Aprimora as decisões de avanço ou interrupção ao fornecer dados precoces sobre a resposta vascular, reduzindo o risco de falhas em estágios avançados de programas do SNC.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos com base no engajamento vascular e na relevância funcional para a homeostase cerebral.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em neuroanatomia e técnicas de dissecação microcirúrgica para isolar tecidos meníngeos e vasculares delicados.
- Depende de instrumentos de dissecação, como pinças finas, e de um ambiente controlado (solução salina gelada) para manter a viabilidade tecidual.
- Necessita padronização entre equipes distintas de histologia, biologia molecular e farmacologia para garantir preparação e análise tecidual consistentes.
- Considerações para adaptação incluem ajustar a profundidade da dissecação conforme a linhagem ou idade das ratas, a fim de evitar contaminação cortical.
- Limitação prática: risco de rompimento das meninges ou dano vascular se a dissecação for realizada muito rapidamente ou sem hidratação adequada do tecido.
