A descrição visual do Dissecção da vasculatura cerebral Superfície e Meninges Associados e plexo coróide do cérebro de um rato

O objetivo geral deste procedimento é dissecar de forma eficiente e rápida as porções peeling e aracnóide das meninges e da vasculatura arterial associada, sobrepondo a superfície do córtex do prosencéfalo e mesencéfalo, tálamo e calos, bem como colher o plexo coróide dos ventrículos laterais. Isso é feito removendo primeiro a glândula pineal e separando as meninges e as árvores arteriais mimadas no prosencéfalo. Em segundo lugar, as artérias e artérias na superfície cortical são cuidadosamente removidas, começando no círculo ventral de Willis e, em seguida, prosseguindo para as superfícies corticais dorsais para que a casca e as membranas aracnoides restantes permaneçam presas à vasculatura, certificando-se de minimizar a coleta de tecidos da superfície cortical adjacentes.

Em seguida, o córtex e as fibras comissurais são dissecados do septo e do hipocampo, expondo os ventrículos laterais para permitir a coleta do plexo coróide. Finalmente, o hipocampo é removido, expondo o tálamo e os calos do mesencéfalo. As meninges e a vasculatura associada que recobrem essa região são então dissecadas.

Em última análise, a integridade e especificidade das meninges dissecadas e da vasculatura arterial associada, bem como do plexo coróide, podem ser determinadas comparando os perfis de expressão gênica de cada uma dessas regiões. Este método pode ajudar a responder a questões-chave em pesquisas relacionadas ao vascular que suporta a função cerebral. Inclui semelhanças, comparações e diferenças na função do plexo coróide em comparação com as meninges e sua vasculatura arterial associada em relação ao fluxo sanguíneo, função do LCR, insultos neurotóxicos e trauma cerebral.

Para iniciar este protocolo, coloque os cérebros recém-removidos dos ratos imediatamente após serem sacrificados em solução salina normal gelada por cinco minutos. É importante permitir que o cérebro esfrie por esse período de tempo antes da dissecação, para que as quatro meninges cerebrais e a vasculatura arterial associada ou MAV possam ser separadas da superfície do córtex. Em seguida, coloque o cérebro no fundo de uma placa de Petri de vidro apoiada no gelo com um centímetro de gelo, solução salina fria normal ou solução salina tamponada com fosfato de sódio 0,1 molar a um pH de 7,4.

Toda dissecção deve ser feita com o cérebro, principalmente imerso em solução salina. Para iniciar a dissecação, coloque o lado dorsal do cérebro para cima na placa de Petri e localize a glândula pineal, que está na região ventral mais delicada entre os dois hemisférios. Apenas rostral ao cerebelo e logo abaixo, ou na superfície das meninges.

Sobre o colli. Remova a glândula pineal usando duas pequenas pinças de ponta dobrada. Observe que a glândula pineal é de cor rosa como o córtex, mas muitas vezes é cercada por restos de sangue residual e vasculatura da remoção do cérebro.

Em seguida, vire o cérebro de cabeça para baixo na placa de Petri. Em seguida, separe a artéria vertebral e as artérias menores e as meninges que cobrem a ponte das meninges e vasculaturas do prosencéfalo. Em seguida, inicie a remoção do MAV.

É importante iniciar ventralmente no processo de dissecção com as artérias principais do círculo de Willis, artérias cerebrais médias e artérias anteriores. Em seguida, começando com qualquer um dos hemisférios, use uma pequena pinça de ponta dobrada para cortar a artéria comunicante posterior logo posterior à junção carotídea interna, separando assim as árvores arteriais mais anteriores e posteriores do prosencéfalo. Em seguida, repita o mesmo processo para o hemisfério contralateral.

Agora, segurando a ACM e a artéria anterior com a pinça, puxe suavemente na direção dorsal anterior, de modo que o MAV que cobre o córtex anterior ventral seja levantado sobre e ao redor do trato olfatório. Isso remove grande parte do MAV que cobre o córtex anterior. Gire o cérebro em um ângulo de 45 a 90 graus em relação à placa de Petri para que as regiões laterais mais anteriores do MAV ao redor das regiões corticais laterais possam ser liberadas do córtex, agarrar o MCA e as artérias associadas e puxar suavemente dorsalmente ao longo do córtex.

Se necessário, as extremidades da pinça podem ser usadas para levantar e liberar as principais artérias do córtex durante a dissecção. Agora, remova as regiões laterais mais posteriores do MAV. Observe que é melhor mudar de um hemisfério para o outro durante este processo de colheita para garantir que o MAV permaneça frio e hidratado, também troque de hemisfério se for encontrada alguma resistência em liberar o MAV do córtex.

Finalmente, para remover as regiões mais dorsais do MAV ao redor do córtex somatossensorial e motor primário, vire o lado dorsal do cérebro para cima para liberar essa seção do cérebro, use as extremidades da pinça ao longo do seio sagital. Esta parte do MAV colhido pode ser mantida temporariamente em solução salina gelada até que seja necessária para testes e análises, ou congelada para processamento posterior. Freqüentemente, o MAV que cobre as regiões mais posteriores do córtex permanece ligado.

Sua remoção é mostrada em uma seção subsequente deste vídeo. Para remover a primeira posição do plexo coróide, o cérebro fica com o lado dorsal para cima e segure-o no lugar com a pinça maior. Em seguida, empurre a pinça menor para baixo através da linha média entre os hemisférios e use as extremidades para perfurar o córtex e o corpo caloso até o topo da linha média do hipocampo.

Em seguida, use a pinça para puxar o córtex com caloso para longe do hipocampo dorsal e do septo, expondo a maior parte do ventrículo lateral. O plexo coróide pode ser localizado e identificado pela linha vermelha ondulada que demarca a artéria principal que percorre seu comprimento. Use as duas extremidades da pinça para erguer as paredes laterais do terceiro ventrículo e aumentá-lo em sua extremidade mais mimada.

Em seguida, usando a pequena pinça, puxe esta extremidade do plexo coróide para fora. Em seguida, use a pinça para ampliar a região muito anterior entre o septo e a região do putâmen caudado e puxe o plexo coróide para fora nessa extremidade também. Realize também o mesmo procedimento no hemisfério contralateral para obter o segundo plexo coróide remanescente.

Novamente, esse tecido pode ser mantido temporariamente em gelo, frio, solução salina ou congelado para processamento posterior. Para remover o MAV restante cobrindo as regiões mais posteriores do córtex, primeiro remova todo o hipocampo de ambos os hemisférios, expondo o MAV sobre o tálamo e os colículos. Observe que a remoção desta parte do MAV será muito menos difícil do que sua remoção do córtex para o MAV restante.

Ao agarrar a vasculatura maior que cobre a porção anterior do tálamo e puxar suavemente com força, essa vasculatura é conectada à rede supracurricular e fornece sangue ao hipocampo dorsal e à rede de tálamo dorsal. Afaste-se consideravelmente e, eventualmente, a rede supra será liberada e as últimas porções do círculo arterial do mimo poderão ser alcançadas. Neste ponto, mais cuidado deve ser tomado para remover qualquer MAV remanescente na superfície dos córtices primários, auditivos e visuais lineares retros granulares.

Qualquer MAV cortical ventral posterior remanescente colhido com esta segunda seção MAV talâmica e calosa deve ser removido e adicionado à primeira seção cortical do MAV dissecado se for analisado separadamente. Em seguida, para comparar os perfis de expressão gênica entre o córtex parietal estriado e as regiões MAV sob condições de controle, a análise da expressão gênica pode ser realizada usando o genoma completo de ratos Agilent 0 1 4 8 7 9, quatro por 44.060 matrizes de oligonucleotídeos mer. Mais detalhes sobre processamento, digitalização e armazenamento inicial de dados podem ser encontrados em Thomas et al.

Quando a dissecção é executada corretamente. Os tecidos MAV resultantes devem estar em duas entidades intactas pesando cerca de 35 a 45 miligramas no total. O MAV inicialmente dissecado ao redor da maior parte do córtex deve pesar cerca de 25 miligramas, e o que cobre o tálamo, calo e córtex occipital deve pesar cerca de 15 miligramas.

O tecido deve ser ligeiramente rosado devido ao sangue residual na vasculatura. O plexo coróide bilateral colhido deve estar em duas amostras de tecido intacto, cada uma pesando de um a dois miligramas, como visto aqui. Aqui vemos uma comparação dos perfis de expressão gênica no estriado, córtex parietal e MAV sob condições de controle.

O gráfico superior mostra a expressão no estriado em comparação com o córtex parietal. Embora o gráfico inferior mostre a expressão no MAV em comparação com o córtex parietal, pode-se ver que o estriado e o córtex parietal estão muito mais intimamente relacionados entre si do que o MAV. Aqui vemos a expressão gênica diferencial no MAV em resposta à hipertermia em comparação com o controle, em resposta à anfetamina em comparação com o controle e na hipertermia versus anfetamina.

Finalmente, aqui vemos genes com expressão superior a 15 vezes no MAV em comparação com o córtex parietal e o estriado caracterizados pela função. Muitos desses genes estão relacionados ao sistema vascular e/ou ao sistema imunológico. Outros genes com alterações muito grandes na dobra são proteínas da matriz extracelular, transportadores de refogado e metabolismo de lipídios e ácido retinóico.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de ser paciente ao dissecar o MAV. Também é importante que o cérebro permaneça submerso em solução salina isotônica ou solução salina tamponada com fosfato durante toda a dissecção. Além disso, aconselha praticar a seção do MAV em quatro ou cinco ratos antes de obter tecidos para gerar dados experimentais.