Injeção de sub-retiniana de Vetores da terapia genética e células-tronco no olho do rato
25 de novembro de 2012
Esta técnica cirúrgica ilustra a injecção de vectores de terapia genética e de células estaminais para o espaço sub-retiniano do olho do rato.
O primeiro passo é montar o dispositivo a partir de um conjunto para coleta de sangue. Corte uma agulha de calibre 25 e três quartos deste trecho de oito centímetros de tubo estéril. Com um conector tipo lure lock, você pode adquirir uma agulha capilar de vidro com diâmetro de cem mícrons, ou fabricar uma você mesmo com um puxador de pipetas Sutter P 97, e então aspirar solução salina estéril para preencher o espaço morto no tubo.
Fixe um tubo capilar de vidro na extremidade do tubo plástico estéril, e jogue um pouco de solução salina através da agulha para garantir que esteja corretamente fixado e sem vazamentos. Se você observar ao microscópio, verifique a pressão aplicada e a taxa de ejeção do fluido pela ponta fina; usaremos uma solução colorida para representar o vetor viral ou as células-tronco. Coloque isso em uma placa de Petri estéril, aspire um pouco de ar e, em seguida, a solução de injeção.
Para os nossos propósitos, utilizamos P cinco camundongos. Nesta imagem, é possível observar o focinho. A localização do olho está coberta por uma pálpebra.
As linhas pontilhadas mostram a margem palpebral e o sulco palpebral onde será feita a incisão. Tesouras retas de Vanis são usadas para fazer uma incisão de um milímetro e meio ao longo da pálpebra fechada. Pinças de pressão para fissura são utilizadas para afastar as pálpebras e projetar o olho com a margem palpebral ligeiramente atrás do globo ocular.
Para realizar a esclerectomia, é importante ser capaz de identificar algumas referências anatômicas. A transição entre a córnea transparente e a esclera é marcada pelo limbo. Logo abaixo da esclera encontra-se o epitélio pigmentado da retina, seguido pela retina e, em seguida, pelo vítreo. O Matomy é posicionado na metade posterior ou no equador do globo ocular, realizando um pequeno corte na superfície com uma lâmina microcirúrgica de 15 graus, especialmente em animais de pigmentação escura.
Um tecido pigmentado marrom escuro ficará visível no ponto da incisão. Se a incisão for feita muito profunda, você realmente verá fluido saindo. Isso representa o vítreo e significa que você foi longe demais.
Passando pela retina RPE. Essa incisão pode ser usada para uma injeção intravítrea. Agora, animal BYO.
O corte neste ponto está completo. Cortes adicionais e arranhões liberarão o vítreo para uma injeção subretiniana; o objetivo é posicionar o tubo de capilar de vidro no espaço subretiniano, exatamente entre a retina e o epitélio pigmentado da retina (RPE). Se o corte for muito profundo, a agulha poderá atravessar a retina e penetrar no vítreo. Insira a agulha paralelamente à parede externa do olho.
Para acessar o espaço sub-retiniano. Aplique leve pressão ao êmbolo e comece a injetar o fluido. Se a agulha estiver corretamente posicionada, será sentida uma pressão contrária moderada e uma bolha sub-retiniana (BLE) será criada no espaço sub-retiniano.
Se a agulha estiver no vítreo, há uma pressão contrária significativamente menor. Para evitar refluxo significativo, mantenha o êmbolo no lugar por mais 15 segundos antes de remover a agulha. Isso permitirá que a pressão intraocular se estabilize.
Empurre suavemente o olho de volta para trás das pálpebras, para dentro da órbita, usando pinças curvas para curativos. Aqui há outro exemplo de injeção sub-retiniana em que o corante preenche o espaço sub-retiniano e é claramente visível em um animal albino. O menisco de ar permite que você veja quando atingir o final da injeção.
Injeções de fluido em um olho fortemente pigmentado são um pouco mais desafiadoras. A inserção cuidadosa da agulha proporcionará excelentes resultados.
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Visão Geral
Esta técnica cirúrgica ilustra a injeção de vetores de terapia gênica e células-tronco no espaço sub-retiniano do olho de camundongo. O processo envolve a montagem cuidadosa de um dispositivo para a entrega precisa dos agentes terapêuticos.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Terapia gênica
- Pesquisa com células-tronco
- Oftalmologia
Contexto
- A terapia gênica tem como objetivo tratar ou prevenir doenças mediante a introdução de material genético nas células.
- As células-tronco têm a capacidade de regenerar tecidos danificados.
- O espaço sub-retiniano é uma área crítica para intervenções oculares.
- Modelos murinos são comumente utilizados em estudos pré-clínicos na pesquisa da visão.
Objetivo do Estudo
- Demonstrar uma técnica cirúrgica para a administração de vetores de terapia gênica.
- Explorar o potencial das células-tronco no tratamento de doenças retinianas.
- Aperfeiçoar métodos para injeções precisas no olho.
Métodos Utilizados
- Montagem de um dispositivo a partir de um conjunto para coleta de sangue.
- Preparação de uma agulha de capilar de vidro para injeção.
- Aspiração de solução salina estéril para preencher o dispositivo.
- Uso de uma solução colorida para representar o vetor viral ou as células-tronco durante o procedimento.
Resultados Principais
- O dispositivo permite a injeção controlada no espaço sub-retiniano.
- Visualização bem-sucedida da ejeção do fluido sob microscópio.
- Demonstração da viabilidade da técnica para aplicações em terapia gênica.
- Implicações potenciais para tratamentos futuros de doenças retinianas.
Conclusões
- Essa técnica fornece um método confiável para a entrega de terapia gênica.
- São necessários mais estudos para avaliar os resultados de longo prazo.
- Ela abre caminhos para tratamentos inovadores em distúrbios retinianos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Essa técnica cirúrgica permite a administração precisa de vetores de terapia gênica e células-tronco no espaço sub-retiniano de olhos de camundongos perinatais, apoiando a validação pré-clínica de terapêuticas oculares. Ao minimizar danos teciduais e garantir um direcionamento preciso, o método aumenta a reprodutibilidade em fluxos de trabalho de descoberta em estágios iniciais para modelos de doenças retinianas. Ele fornece uma plataforma escalonável para avaliação de candidatos terapêuticos antes de avançar para estudos em animais maiores ou pesquisas habilitadoras para pedido de autorização para ensaios clínicos (IND).
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação funcional de construtos de terapia gênica em um microambiente ocular relevante para a doença.
- Valor Operacional: Apoia a validação de alvos ao confirmar a entrega às camadas retinianas pretendidas.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera resultados quantificáveis da distribuição de vetores ou células por meio da formação visível de bolhas no espaço sub-retiniano.
- Valor Operacional: Padroniza os parâmetros de injeção para a administração reprodutível de compostos ou células entre os grupos de estudo.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Facilita a desmistificação mecanicista ao permitir a avaliação longitudinal do enxerto ou expressão em modelos perinatais.
- Valor Operacional: Permite testes de resposta à dose, essenciais para o perfil de segurança e eficácia pré-clínicos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método integra-se ao continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a identificação de compostos promissores e avaliação pré-clínica, especialmente para terapias oculares genéticas e celulares.
- Biologia da Descoberta: Testa hipóteses sobre tropismo de vetores, atividade de promotores ou enxerto de células-tronco no nicho retiniano.
- Triagem: Administra volumes padronizados de agentes terapêuticos para permitir a triagem comparativa de candidatos.
- Análise: Fornece leituras visuais e espaciais (por exemplo, tamanho do bleb, fluorescência) para quantificar o sucesso da administração.
- Pesquisa Translacional: Conecta a descoberta científica a estudos pré-clínicos ao validar a administração em um modelo fisiologicamente relevante de olho neonatal.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma cirúrgica reutilizável para testes iterativos de múltiplos vetores ou linhagens celulares.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva no engajamento do alvo ao confirmar a localização subcelular dos agentes administrados.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade por meio da montagem padronizada do dispositivo e da técnica de injeção.
- Valor Estratégico: Reduz atrasos no desvio de riscos biológicos ao permitir a validação funcional precoce in vivo.
- Impacto no Portfólio: Apoia decisões de prosseguir/interromper com base em métricas de eficiência de entrega e integridade do tecido.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em microcirurgia e familiaridade com a anatomia ocular neonatal.
- Depende de instrumentos de precisão, incluindo lâminas microcirúrgicas, pinças e ferramentas para preparação de capilares de vidro.
- Necessita treinamento padronizado para minimizar a variabilidade na profundidade da incisão e no posicionamento da agulha entre diferentes operadores.
- Deve levar em conta os desafios de visualização dependentes da pigmentação ao ser adaptado a diferentes linhagens de camundongos.
- Limitado pela habilidade técnica necessária para evitar a penetração no vítreo e garantir a colocação subretiniana.
