Name: Análise de SNARE mediada por fusão de membrana usando um ensaio de fusão celular enzimática (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Aprenda a quantificar fusão celular mediada por SNARE usando ensaio enzimático com β-galactosidase em células COS-7. Este método permite analisar múltiplas combinações proteicas quantitativamente.

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Este trabalho é apoiado por fundos de inicialização da Universidade de Louisville e CA135123 dos Institutos Nacionais de Saúde (para CH).

1. Cultura de Células e Transfecção <ol><li> Células COS-7 foram cultivadas em Meio de Dulbecco Modificado de Eagle (DMEM), suplementado com 4,5 g / l de glucose e 10% de soro fetal bovino (FBS). </li><li> Transfecção de plasmídeo foi feito com Lipofectamina de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen). </li></ol> 2. Análise microscópica de fluorescência de células de expressão de superfície SNARE <ol><li> Um dia antes da transfecção, 3 × 10 4 células COS-7 foram semeadas em lamelas estéreis de 12 milímetros de vidro (Fisher Scientific), contidos em placas de 24 poços. </li><li> Para v-células em cada cavidade, 0,25 ug do plasmídeo que codifica tTA (BRST-Off, CLONTECH) é co-transfectadas com 0,25 ng dos plasmídeos que expressam invertidas VAMPS. </li><li> Para t-células em cada cavidade, 0,25 ug do plasmídeo que codifica TRE-LacZ (pBI-G, CLONTECH) é co-transfectadas com 0,25 ug de cada um dos plasmídeos que expressam invertidas SNAP-25 e syntaxins 1 ou 4. </li><li> 24 horas após transfection, as células são fixadas com paraformaldeído a 4% em PBS + + (PBS suplementado com 0,1 g / l de CaCl2 e 0,1 g / l de MgCl 2), durante 10 min e, em seguida, bloqueadas em FBS a 10% em PBS + +, durante 30 minutos. </li><li> As células são incubadas durante 1,5 horas com os anti-Myc 9E10 anticorpos monoclonais (sobrenadante da cultura de hibridoma pura). </li><li> Depois de quatro lavagens com PBS + +, as células são incubadas durante 1 hora com FITC-anticorpos secundários conjugados (Jackson ImmunoResearch Laboratories) a uma diluição de 1:500. </li><li> Depois de quatro lavagens com PBS + +, as células marcadas são montados em Prolongar reagente Antifade Gold (Invitrogen). </li><li> Imagens confocal são coletados em um microscópio de varredura a laser confocal Olympus. As imagens são processadas com o software Adobe Photoshop. </li></ol> 3. Análise FACS de células de expressão de superfície SNARE <ol><li> Um dia antes da transfecção, 2 × 10 5 células COS-7 foram semeadas em cada poço de placas de 6 poços. </li><li> 24 hr após transfection com o virado SNARE, BRST-Off e pBI-G plasmídeos, as células são fixadas com paraformaldeído a 1% em PBS + +, durante 15 minutos, e, em seguida, bloqueadas em FBS a 10% em PBS + +, durante 15 minutos. </li><li> As células são incubadas com o anti-Myc 9E10 anticorpos monoclonais durante 60 min. </li><li> Após três lavagens com PBS + +, as células são marcadas com FITC-conjugado de anticorpos secundários (diluição a 1:200) durante 45 min. </li><li> Após três lavagens com PBS + +, as células são raspadas das placas com um raspador de células. </li><li> 15.000 células são analisadas utilizando um citómetro de fluxo FACSCalibur (BD Biosciences). A intensidade média de fluorescência de cada amostra é obtido utilizando o software CellQuest Pro. </li></ol> 4. Ensaio de Fusão celular enzimática <ol><li> Um dia antes da transfecção, 1,2 x 10 6 células COS-7 foram semeadas em cada placa de cultura de tecidos de 100 mm e 2 x 10 5 células COS-7 foram semeadas em cada poço de placas de 6 poços. </li><li> Para v-células, 0,5 - 5 mg cada de Flipped VAMP plasmídeo é co-transf ectadas com 5 ug de BRST-Off para dentro das células em cada placa de cultura de 100 mm. As células de controlo são co-transfectadas com o vector vazio pcDNA3.1 (+) e BRST-Off. Para impedir que o N-glicosilação de gáspeas 1, 4, 5, 7 e 8, tunicamicina (10 ug / ml) é incluída no meio de cultura celular durante a transfecção. </li><li> Para t-células em cada poço das placas de 6 poços, 1 ug do virado SNAP-25 e plasmídeo pBI-G são co-transfectadas com 0,5 ug de plasmídeo ou invertida syntaxin1 0,05 ug de plasmídeo syntaxin4 invertida. </li><li> 24 horas após a transfecção, o V-células são separadas de pratos de cultura com a enzima livre de dissociação celular Buffer (Invitrogen). As células destacadas são contadas com um hemocitómetro e novamente suspensas em HEPES-tampão DMEM suplementado com FBS a 10%, 6,7 ug / ml de tunicamicina e 0,67 mM de DTT. </li><li> 4,8 x 10 5 ressuspenso v-As células são adicionadas a cada poço já contendo as células-T. </li><li> Depois de 6, 12 ou 24 horas de ratos de 37 ° C em CO2 a 5% </sub&gt;, a expressão de β-galactosidase é medida utilizando o β-Galactosidase Sistema de Ensaio Enzimático com Tampão de Lise Repórter de acordo com as instruções do fabricante (Promega). Resumidamente, as células são lavadas duas vezes com PBS, e depois foram lisadas em tampão de lise repórter. Os lisados ​​de células são misturadas com um volume igual de Tampão de Ensaio x 2. Como um controlo em branco, o Tampão de Lise Repórter é misturado com o tampão de Ensaio 2 ×. </li><li> Após 90 min, a reacção colorimétrica é parada pela adição de carbonato de sódio 1 M. </li><li> Absorvância a 420 nm é medida utilizando um espectrofotómetro de HITACHI 100-40. </li></ol>

<ol><li>Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+intracellular+protein+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of intracellular protein transport.</a> Nature. 372, 55-63 (1994).</li>
<li>Jahn, R., Lang, T., Sudhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Membrane fusion.</a> Cell. 112, 519-533 (2003).</li>
<li>Bonifacino, J. S., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanisms+of+vesicle+budding+and+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The mechanisms of vesicle budding and fusion.</a> Cell. 116, 153-166 (2004).</li>
<li>Jahn, R., Scheller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNAREs--engines+for+membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">SNAREs--engines for membrane fusion.</a> Nature. 7, 631-643 (2006).</li>
<li>Weber, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNAREpins%3A+minimal+machinery+for+membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SNAREpins: minimal machinery for membrane fusion.</a> Cell. 92, 759-772 (1998).</li>
<li>Hu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+of+cells+by+flipped+SNAREs%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y%29%22%5BJournal%5D)">Fusion of cells by flipped SNAREs.</a> Science (New York, N.Y). 300, 1745-1749 (2003).</li>
<li>Hu, C., Hardee, D., Minnear, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+fusion+by+VAMP3+and+plasma+membrane+t-SNAREs%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Membrane fusion by VAMP3 and plasma membrane t-SNAREs.</a> Experimental cell research. 313, 3198-3209 (2007).</li>
<li>Hasan, N., Corbin, D., Hu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusogenic+Pairings+of+Vesicle-Associated+Membrane+Proteins+%28VAMPs%29+and+Plasma+Membrane+t-SNAREs+-+VAMP5+as+the+Exception%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Fusogenic Pairings of Vesicle-Associated Membrane Proteins (VAMPs) and Plasma Membrane t-SNAREs - VAMP5 as the Exception.</a> PloS one. 5, e14238(2010).</li>
<li>Gossen, M., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+control+of+gene+expression+in+mammalian+cells+by+tetracycline-responsive+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 5547-5551 (1992).</li>
<li>Hanson, P. I., Heuser, J. E., Jahn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotransmitter+release+-+four+years+of+SNARE+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Neurotransmitter release - four years of SNARE complexes.</a> Current opinion in neurobiology. 7, 310-315 (1997).</li>
<li>McMahon, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellubrevin+is+a+ubiquitous+tetanus-toxin+substrate+homologous+to+a+putative+synaptic+vesicle+fusion+protein.+%5Bsee+comments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cellubrevin is a ubiquitous tetanus-toxin substrate homologous to a putative synaptic vesicle fusion protein. [see comments.</a> Nature. 364, 346-349 (1993).</li>
<li>Steegmaier, M., Klumperman, J., Foletti, D. L., Yoo, J. S., Scheller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle-associated+membrane+protein+4+is+implicated+in+trans-Golgi+network+vesicle+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Vesicle-associated membrane protein 4 is implicated in trans-Golgi network vesicle trafficking.</a> Molecular biology of the cell. 10, 1957-1972 (1999).</li>
<li>Zeng, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+synaptobrevin%2FVAMP+homologous+protein+%28VAMP5%29+is+increased+during+in+vitro+myogenesis+and+present+in+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">A novel synaptobrevin/VAMP homologous protein (VAMP5) is increased during in vitro myogenesis and present in the plasma membrane.</a> Molecular biology of the cell. 9, 2423-2437 (1998).</li>
<li>Galli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+tetanus+neurotoxin-insensitive+vesicle-associated+membrane+protein+in+SNARE+complexes+of+the+apical+plasma+membrane+of+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">A novel tetanus neurotoxin-insensitive vesicle-associated membrane protein in SNARE complexes of the apical plasma membrane of epithelial cells.</a> Molecular biology of the cell. 9, 1437-1448 (1998).</li>
<li>Wong, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endobrevin%2C+a+novel+synaptobrevin%2FVAMP-like+protein+preferentially+associated+with+the+early+endosome%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Endobrevin, a novel synaptobrevin/VAMP-like protein preferentially associated with the early endosome.</a> Molecular biology of the cell. 9, 1549-1563 (1998).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O ensaio de fusão de células original, 6 determina SNARE mediadas por eventos de fusão de células por microscopia de fluorescência. Descrevemos aqui um ensaio que quantifica inovador SNARE mediadas por eventos de fusão de células activado por expressão de β-galactosidase e medição espectrométrica. Utilizando este ensaio, que rotineiramente analisar 15-20 v-e t-SNARE combinações em uma única experiência. Utilizando citometria de fluxo para medir a expressão SNARE na superfície da célula, é titular os níveis de...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente e equipamento </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 12800-017 </td></tr><tr><td> Células COS-7 </td><td> ATCC </td><td> CRL-1651 </td></tr><tr><td> tunicamicina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T7765-5mg </td></tr><tr><td> BRST-Off </td><td> Clontech </td><td> K1620-A </td></tr><tr><td> pBI-G </td><td> Clontech </td><td> 6150-1 </td></tr><tr><td> lipofectamina </td><td> Invitrogen </td><td> 18324-012 </td></tr><tr><td> Enzima livre de célula de solução de dissociação </td><td> Invitrogen </td><td> 13151-014 </td></tr><tr><td> Coelho anti-TET anticorpo policlonal Repressor </td><td> Millipore </td><td> AB3541 </td></tr><tr><td> FITC-conjugado de burro anti-IgG de ratinho (H + L) </td><td> JacImmunoResearch KSON </td><td> 715-095-150 </td></tr><tr><td> Microscópio de varredura a laser confocal </td><td> Olimpo </td><td> FV1000 </td></tr><tr><td> FACSCalibur citômetro de fluxo </td><td> BD Biosciences </td><td></td></tr><tr><td> β-Galactosidase Sistema de Ensaio Enzima com Tampão de Lise Repórter </td><td> Promega </td><td> E2000 </td></tr><tr><td> Modelo 100-40 espectrofotómetro de UV-VIS </td><td> Hitachi </td><td> C740843 </td></tr></tbody></table>

análise de snare mediada por fusão de membrana usando um ensaio de fusão celular enzimática

Analysis of SNARE-mediated Membrane Fusion Using an Enzymatic Cell Fusion Assay

As interacções dos SNARE (s factor de N-etilmaleimida sensível oluble ttachment um re ceptor de proteína) de proteínas em vesículas (v-SNAREs) e sobre as membranas-alvo (t-SNAREs) catalisam fusão das vesículas intracelulares 1-4. Os ensaios de reconstituição são essenciais para dissecar o mecanismo e regulação de SNARE mediada por fusão de membrana 5. Num ensaio de células de fusão 6,7, proteínas SNARE são expressos ectopicamente na superfície da célula. Estes &quot;invertida&quot; SNARE proteínas unidade de fusão célula-célula, demonstrando que SNAREs são suficientes para fundir as membranas celulares. Uma vez que o ensaio de fusão de células é baseada na análise microscópica, é menos eficaz quando utilizado para a análise múltipla v-e t-SNARE interacções quantitativamente. Descrevemos aqui um novo ensaio que quantifica 8 SNARE mediadas por eventos de fusão de células activado por expressão de β-galactosidase. Doiscomponentes do sistema de expressão do gene Tet-Off 9 são utilizados como um sistema de leitura: o transactivador tetraciclina controlada (tTA) e um plasmídeo repórter que codifica para o gene LacZ sob o controlo do elemento de resposta a tetraciclina (TRE-LacZ). Nós tTA em transfectar células COS-7 que expressam invertidas v-SNARE proteínas na superfície da célula (V-células) e transfectam TRE-LacZ em células COS-7 que expressam invertida t-SNARE proteínas na superfície celular (células T) . SNARE dependente da fusão dos v-e t-células resulta na ligação de tTA a TRE, a activação da transcrição do LacZ e da expressão de β-galactosidase. A actividade de β-galactosidase é quantificado utilizando um método colorimétrico por absorvância a 420 nm. As proteínas de vesículas associadas a membranas (Vamps) são v-SNAREs que residem em várias pós-Golgi compartimentos vesiculares 10-15. Ao expressar Vamps 1, 3, 4, 5, 7 e 8 no mesmo nível, compara-se a sua fusão de membranaactividades utilizando o ensaio enzimático de fusão celular. Com base em medições de espectrometria, este ensaio proporciona uma abordagem para a análise quantitativa SNARE mediada por fusão de membrana e de alto rendimento estudos.

Para desenvolver um ensaio de fusão celular quantitativo, tiramos vantagem da activação transcricional forte pela ligação de tTA a TRE. Na ausência de tTA, a transcrição do gene LacZ em TRE-LacZ é silenciosa. Quando tTA estiver presente, liga-se ao TRE e activa a transcrição de LacZ. Figura 1 mostra um fluxograma do ensaio enzimático das células de fusão. tTA é transfectado em células que v-v-SNARE expressa proteínas na superfície celular, e TRE-LacZ é transfectado em...

Nós desenvolvemos um ensaio de fusão de células que quantifica SNARE mediadas por eventos de fusão da membrana por expressão activada de β-galactosidase.

Análise de SNARE mediada por fusão de membrana usando um ensaio de fusão celular enzimática

As interações das proteínas SNARE (receptor de proteína de anexo ao fator sensível à N-etilmaleimida solúvel) em vesículas (v-SNAREs) e em membranas alvo ...

O objetivo geral deste procedimento é quantificar eventos de fusão celular mediados por snare mediante a expressão ativada de beta galacto. Isso é realizado primeiramente pela expressão ectópica das proteínas v e t snare na superfície de células cost sete. O próximo passo do procedimento consiste em combinar as células que expressam as proteínas v snare com aquelas que expressam as proteínas t snare.Isso resulta na fusão celular mediada por snare e na expressão ativada da beta galacto. Em última análise, a atividade da beta galacto induzida pela fusão celular é medida utilizando um espectrofotômetro. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como o ensaio da região SAL microscópica, é que ela pode analisar múltiplas combinações de snare.Quantitativamente, embora este método possa ser aplicado para compreender o mecanismo e a regulação da fusão de membranas mediada por snare. Também pode ser aplicado em estudos de alto rendimento. A demonstração do procedimento será feita por Doc Na Hassan, pós-doutorando, e David Humphrey, técnico do meu laboratório, no dia anterior à carga da transfeção.Placas de 24 poços com lamínulas de vidro de 12 milímetros preparam

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Técnicas de microscopia de luz acopladas a ensaios bioquímicos elucidam o envolvimento da exocitose mediada por SNARE na ramificação do axônio dependente de netrina. Essa combinação de técnicas permite a identificação de mecanismos moleculares que controlam a ramificação do axônio e a mudança da forma celular.

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Fusão SNARE mediada por uma única proteolipossomos com Bicamadas suportados Tethered em uma célula Microfluidic fluxo monitorado por polarizada TIRF microscopia

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Visualizando intracelular SNARE tráfico pela vida de fluorescência, microscopia de imagem

Este protocolo descreve uma abordagem de baseados em espectroscopia de flutuação de fluorescência para investigar interações entre proteínas mediando as interações célula-célula, ou seja, as proteínas localizadas em cruzamentos de célula, diretamente em células vivas. Nós fornecemos orientações detalhadas na calibração de instrumentos, aquisição de dados e análise, incluindo correcções de fontes possível artefato.

Um ensaio de espectroscopia de flutuação de fluorescência das interações da proteína-proteína em contatos do celular

Aqui, apresentamos o procedimento detalhado de uma plataforma de ensaio de protease recentemente desenvolvido utilizando o N-terminal hexahistidine/maltose-proteína e fluorescentes substratos recombinantes da proteína-fundido, anexados à superfície do níquel-nitrilotriacético grânulos de agarose magnético ácido. Também é apresentada uma análise subsequente em-gel das amostras de ensaio separados por eletroforese em gel polyacrylamide do sulfato dodecyl de sódio.

Utilização de proteínas recombinantes de fusão em uma plataforma de ensaio de Protease fluorescente e sua renaturalização em-gel

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Reconstituição detergente-assistida da Drosophila atlastin recombinante em lipossomas para ensaios de mistura de lipídios

Este protocolo descreve uma técnica de imagem confocal para detectar três modos de fusão em células adrenals de chromaffin bovinas. Esses modos de fusão incluem 1) close-fusion (também chamado de kiss-and-run), envolvendo abertura e fechamento de poros de fusão, 2) stay-fusion, envolvendo abertura de poros de fusão e manutenção do poro aberto, e 3) redução de fusão, envolvendo encolhimento vesícula fundido.

Microscopia Confocal para medir três modos de dinâmica de poros de fusão em células adrenal chromaffin

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