Análise de SNARE mediada por fusão de membrana usando um ensaio de fusão celular enzimática

O objetivo geral deste procedimento é quantificar eventos de fusão celular mediados por snare mediante a expressão ativada de beta galacto. Isso é realizado primeiramente pela expressão ectópica das proteínas v e t snare na superfície de células cost sete. O próximo passo do procedimento consiste em combinar as células que expressam as proteínas v snare com aquelas que expressam as proteínas t snare.

Isso resulta na fusão celular mediada por snare e na expressão ativada da beta galacto. Em última análise, a atividade da beta galacto induzida pela fusão celular é medida utilizando um espectrofotômetro. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como o ensaio da região SAL microscópica, é que ela pode analisar múltiplas combinações de snare.

Quantitativamente, embora este método possa ser aplicado para compreender o mecanismo e a regulação da fusão de membranas mediada por snare. Também pode ser aplicado em estudos de alto rendimento. A demonstração do procedimento será feita por Doc Na Hassan, pós-doutorando, e David Humphrey, técnico do meu laboratório, no dia anterior à carga da transfeção.

Placas de 24 poços com lamínulas de vidro de 12 milímetros preparam dois poços para cada combinação de células expressando plasmídeos únicos no experimento sobre essas lamínulas. Semear 30.000 células COS-7 cultivadas em DMEM suplementado com 4,5 gramas por litro de glicose e 10% de FBS para transfeção. Às células V, adicionar a cada poço um quarto de micrograma do plasmídeo TTA e um conjunto de plasmídeos de expressão.

Proteínas invertidas de interesse, neste caso vampiros invertidos, para transfectar os linfócitos T, adicione um quarto de micrograma do plasmídeo que codifica TRE que carece de Z e o conjunto complementar de plasmídeos que codificam as proteínas invertidas de interesse. Neste caso, snap 25, sintaxina um e sintaxina quatro. Agora, transfecte o custo sete com lipectomia de acordo com as instruções do fabricante e cultive as células por 24 horas. Após 24 horas da transfeção, fixe as células em paraformaldeído suplementado por 10 minutos. Após a fixação, enxágue as células três vezes com PBS++, em seguida, bloquee as células com FBS suplementado por 30 minutos.

Após o bloqueio, incubar as células com o anticorpo monoclonal anti-mic. Nove E 10 por 30 minutos após quatro lavagens com PBS mais mais, incubar as células por uma hora com anticorpos secundários conjugados com fitzina em uma diluição de um para 500. Após mais quatro lavagens com PBS mais mais, montar as células marcadas em um reagente comercial anti-fading.

As células estão agora prontas para microscopia confocal. No dia anterior à transfeção, semeie 1,2 milhão de células Coss-7 em cada placa de cultura tecidual de 100 milímetros e 200.000 células Coss-7 em cada poço de placas de seis poços, para cada combinação de plasmídeos a ser analisada. Prepare um poço por cultura e incube as células por 24 horas. No dia seguinte, adicione os plasmídeos para a transfeção. Para células V, transfete um plasmídeo que expressa a proteína invertida de interesse e cinco microgramas de pTet-Off às células em cada placa de cultura de 100 milímetros.

Cotransfecte as células-controle em uma placa de cultura de 100 milímetros com um vetor vazio e P te off nas mesmas concentrações relativas das células V. Após todos os plasmídeos terem sido adicionados às células V e às células-controle, adicione tcom micina a esses poços para impedir a N-glicosilação de vamps. Em cada poço das placas de seis poços, cotransfecte as células T com um micrograma de PBIG juntamente com os plasmídeos complementares que expressam as proteínas de interesse.

Agora, transfete as células cost sete com lip de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, cultive as células por 24 horas; 24 horas após a transfeção, desprenda as células V dos seus recipientes de cultura com tampão de dissociação celular livre de enzimas. Comece lavando as células uma vez com 20 mililitros de PBS.

Em seguida, adicione cinco mililitros de tampão de dissociação livre de enzimas. Após uma incubação de 10 minutos à temperatura ambiente, as células se soltarão ao bater firmemente na placa; verifique se elas se desprendeu sob o microscópio. Se menos da metade das células tiverem se desprendido, aguarde mais cinco minutos e bata na placa novamente.

Continue a incubação no tampão de destacamento até que mais da metade das células tenha se destacado. Em seguida, conte as células V com um hemocitômetro. Depois, ressuspenda as células V numa concentração de aproximadamente 480.000 células por mililitro em tampão DMEM Heis suplementado.

Agora, adicione um mililitro de células V ressuspendidas em cada poço contendo as células T e retorne as placas ao incubador. Após seis, 12 ou 24 horas de cocultivo das células, lave-as com PBS e adicione tampão de lise. Em seguida, raspe as células dos poços e transfira-as para tubos para centrifugação.

Após a centrifugação, transfira o sobrenatante para um novo tubo e meça a expressão de beta galacto utilizando um ensaio comercialmente disponível de acordo com as instruções do fabricante durante esse protocolo; certifique-se de interromper a reação colimétrica após 90 minutos pela adição de carbonato de sódio um molar para pontuar os resultados. Meça a absorbância em 420 nanômetros em um espectrofotômetro ter. Quando células CO sete foram transfectadas com plasmídeos de snare invertido, proteínas de snare invertidas foram expressas na superfície celular.

A citometria de fluxo foi utilizada para medir os níveis de expressão de proteínas snare na superfície celular. Para comparar suas capacidades de fusão de membrana, era necessário que os vamps fossem expressos em níveis idênticos. Portanto, a concentração de cada plasmídeo snare invertido utilizado na transfeção foi titulada e otimizada para a transfeção.

Sob tais condições, as vampirinas 1, 3, 4, 5, 7 e oito e a sintaxina um e quatro foram expressas no mesmo nível na superfície celular, respectivamente; os complexos SNARE neuronais que medeiam a exocitose sináptica foram utilizados para testar a viabilidade do ensaio. De fato, quando as células V expressando vampirina dois e as células T expressando SINTAXINA um e SNAP 25 foram combinadas, detectou-se uma expressão robusta de beta-galactosidase. No entanto, quando a vampirina dois ou o SNAP 25 não eram expressos, apenas atividade basal de beta-galactosidase foi detectada, indicando que a fusão celular e a expressão da beta-galactosidase dependem das interações entre os SNAREs v e t. No geral, a SINTAXINA um, o SNAP 25, a vampirina um, a vampirina três e a vampirina oito apresentaram atividades de fusão comparáveis e as mais altas.

Em contraste, a atividade basal de beta GAL sugere que a combinação de proteínas não induz fusão de membrana, como é o caso entre vamp cinco e SINTAXINA um. Snap 25. Ao realizar o ensaio enzimático de fusão, é importante lembrar de adicionar a unicamicina para prevenir a glicosilação de proteínas esna e adicionar DTT para evitar a formação de ligações dissulfeto entre as proteínas esna.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar o ensaio de fusão celular.