Name: O uso de matrizes de fase reversa Proteínas (RPPA) para explorar variação Protein Expression individuais dentro de câncer de células renais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 22 s
Description: Aprenda a usar matrizes de proteínas de fase reversa (RPPA) para analisar variações proteômicas em câncer de células renais. Este método permite identificar biomarcadores de resposta ao tratamento e compreender a heterogeneidade tumoral.

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O trabalho dos autores FCO, DF, JN, DJH e GDS mencionado acima é financiado pelo Escritório Cientista Chefe, número de concessão: ETM37 e apoiado pelo Reino Unido Centro de Pesquisa do Câncer Medicina Experimental do Câncer. O trabalho de AL é financiado pelo Royal College of Surgeons de Edinburgh Robertson Trust, o Confiança Melville para o cuidado ea cura do câncer e do Conselho de Pesquisa Médica. IO é apoiado por uma Sociedade Real de Edimburgo Fellowship Governo escocês co-financiado pelas Acções Marie Curie e do UK Medical Research Council. Os autores gostariam de agradecer SCOTRRCC co-candidatos e colaboradores para suas discussões úteis sobre alguns dos temas abordados neste trabalho.

1. Identificação de morfológica e molecular Heterogeneidade Tumor <ol><li> Os tumores removidos do congelador a -80 ° C e mantido em gelo seco. </li><li> Dividir os tumores em secções de cerca de 1 cm 3. Mapear a posição original de cada secção do tumor em relação ao outro e etiqueta com um nome único. Armazenar as amostras em criotubos individuais a -80 ° C até que esteja pronto para uso. </li><li> Amostras do revestimento em outubro e cortar em um criostato a -22 ° C. </li><li> Amostras corados com Hematoxilina e Eosina método contracoloração. </li><li> Análise de microscopia de cortes congelados para garantir que eles são de natureza ccRCC, tumor viável e de classificação (de baixo grau, de alto grau ou mista de grau baixo / alto, desafiando a diferenciar os graus Fuhrman 1 a 4 na seção de congelados). Figura 1 a &amp; b (coloração H &amp; E de grau baixo e elevado misto). </li><li> Selecione até 4 amostras de cada região morfologicamente diferentes dentro de cada tumor para extração de proteínas. </li></ol> 2. Extracção de proteínas a partir de amostras de tumores <ol><li> Corte amostra de tumor de outubro </li><li> Lugar 50-75 mg de tecido em tubos de 2 ml com 990 ul de tampão de lise [Tris 50 mM-HCl (pH 7,5), 5 mM de EGTA (pH 8,5), 150 mM de NaCl] suplementado com aprotinina (Sigma A6279) (10 mg / ml), a fosfatase cocktail inibidor 2 (Sigma, P5716), cocktail de inibidores de fosfatase 3 (Sigma, P0044) e um cocktail de inibidores de protease (Roche, 11836153001). </li><li> Adicionar uma única esfera de aço de 5 mm de cada tubo e homogeneíza-se a 50 Hz, durante 5 min duas vezes utilizando um TissueLyser, verificando o nível de homogeneização, após cada período de 5 min. </li><li> Transfira a amostra homogeneizada novo tubo de 2 ml usando uma pipeta de sair da esfera de aço para trás. </li><li> Adicionar 10 ul de Triton X-100 a cada uma das amostras antes da centrifugação a 13.000 xg durante 30 min a 4 ° C. </li><li> Transfira os sobrenadantes para tubos de microcentrífuga fresco. </li><li> Determinar a concentração de proteína utilizando o BCA ensaio (Figura 2). </li><li>Normalizar as concentrações de proteína a 1 mg / ml. </li></ol> 3. Validação de anticorpo <ol><li> Preparar as amostras de proteína (extraído de linhas de células ou tecidos adequados) para transferência de Western e executado em um gel de 10% SDS-PAGE. </li><li> Transferir as amostras para uma membrana de nitrocelulose durante a noite a 4 ° C. </li><li> Bloquear a membrana no tampão de Li-Cor Odyssey bloqueio (50:50 diluída em PBS) durante 1 hora à temperatura ambiente. </li><li> Diluir os anticorpos primários em Li-Cor Tampão de Bloqueio Odyssey (50:50 diluída em PBS) na diluição recomendada os fabricantes tipicamente 1 em 1000. </li><li> Incubar membrana em anticorpos primários durante a noite a 4 ° C. </li><li> Tornar-se 0,1% de PBS-Tween 20 (PBS-T, 1 ml Tween 20/1 L de PBS). </li><li> Lavar membrana em PBS-T a temperatura ambiente durante 5 min (x3). </li><li> Diluir fluorescente marcado com anticorpos secundários em Tampão de Bloqueio Odyssey (diluído em PBS, 50:50) 0,01% de SDS a diluição 1:10000 (1,5 μl/15 ml). </li><li> Incubar em membrana secundáriaanticorpos à temperatura ambiente durante 45 min com agitação suave - é importante proteger a membrana a partir da luz até ao momento em que tenha sido finalmente digitalizado. </li><li> Lavar membrana em PBS-T a temperatura ambiente durante 5 min (x3), mantendo-se a membrana no escuro. </li><li> Lavar membrana em PBS à temperatura ambiente durante 5 min (x3) para remover Tween20 residual, mais uma vez mantendo a membrana no escuro. </li><li> Deite membrana plana sobre um pedaço de papel de filtro no escuro e deixar secar ao ar - permitindo que a membrana de secar pode melhorar o sinal e reduzir o fundo, mas tornar-se inútil para remoção e re-sondagem. </li><li> Digitalização da membrana no scanner Odyssey LiCor. Manter a membrana no escuro até ao momento em que tenha sido digitalizada. </li><li> Apenas seleccionar anticorpos que geram uma única banda predominante no peso molecular correcto. Figura 3 mostra exemplos de anticorpos aceitáveis ​​e inaceitáveis ​​para uso com RPPA. </li></ol> 4. RPPA PriNTING <ol><li> Lisados ​​de proteínas foram depositados em lâminas de nitrocelulose revestidos de vidro (Fastslides-Whatman) usando um MicroGrid II robótica observador. As lâminas utilizadas continham duas almofadas sobre o qual as amostras foram manchados. Cada bloco foi manchado com amostras idênticas, neste caso, 100 amostras. Outros formatos disponíveis incluem 1, 8 e 16 lâminas almofada. Quanto maior o número de almofadas de quanto menor for o número de amostras que podem ser depositados em cada um. </li><li> Uma série de cinco diluições de 2 vezes foram feitas a partir de cada amostra e cada uma delas foi então visto em triplicado (resultando num total de 15 pontos por amostra). </li></ol> 5. Detecção de Proteína RPPA <ol><li> Lâminas molhados em tampão LiCor excesso de bloqueio (50:50 diluída em PBS). Incubar à temperatura ambiente durante 1 hora numa plataforma de agitação. </li><li> Preparar 800 ul de anticorpos primários em LiCor tampão de bloqueio (diluído em PBS, 50:50) para as concentrações desejadas e manter em gelo. </li><li> Montar as lâminas em (i) Clip Chip o único frameou (ii) a quatro &#39;FastFrame&#39; porta-lâminas compartimento de modo que uma vedação apertada é formado entre a lâmina e a câmara de incubação. </li><li> Remover o tampão residual a partir de poços e adicionar 600 uL de anticorpo primário às cavidades respectivas. </li><li> Colocar a lâmina e câmara em uma caixa selada húmida e incubar no balanço da plataforma durante a noite a 4 ° C. </li><li> Tornar-se 0,1% de PBS-Tween 20 (PBS-T, 100 ul de Tween 20/100 ml de PBS). </li><li> Retirar as lâminas da câmara e remova cuidadosamente os anticorpos primários de cada poço. </li><li> Adicionar 600 ul de PBS-T e lavagem das lâminas em balançar plataforma à temperatura ambiente durante 5 min (X3). </li><li> Prepare fluorescentemente marcadas com anticorpos secundários através de diluição em tampão de bloqueio Odyssey (diluído em PBS, 50:50) 0,01% de SDS a 1:2.000 de diluição (1 ul / 2 ml), em primeiro lugar. </li><li> Remover o tampão dos poços e adicionar 600 ul de anticorpos marcados com fluorescência, secundárias às cavidades respectivas. Incubar anticorpos secundários à temperatura ambiente durante 45 min com agitação suave - loÉ importante proteger a membrana a partir da luz até ao momento em que tenha sido finalmente digitalizado. </li><li> Remover anticorpos secundários de lavagem bem e rapidamente (3x) em 600 ul de PBS-T, à temperatura ambiente. Retirar a lâmina de suporte, a transferência para um recipiente adequado e lavar em excesso de PBS-T, durante 15 minutos, mantendo-se a membrana no escuro. </li><li> Remover o PBS-T e da membrana de lavagem adicional com PBS à temperatura ambiente durante 15 min para remover o residual de Tween-20, mais uma vez mantendo a membrana no escuro. </li><li> Seca-se o forno Fastslide em 50 ° C durante 10 min e, em seguida, digitalizar no digitalizador Odyssey Li-Cor. Mantenha o slide no escuro até que tenha sido digitalizado. </li><li> Digitalizar o slide a 680 nm e / ou 800 nm, dependendo do anticorpo secundário / anticorpos utilizados. Por duas cores de detecção de usar sempre altamente cross-adsorvidas anticorpos secundários para minimizar reatividade cruzada. A selecção cuidadosa de anticorpos primários e secundários é necessário para a detecção de duas cores. De importância primária é a selecção dediferentes espécies hospedeiras (coelho e rato, por exemplo) para os dois anticorpos primários. Isso permite que a discriminação por anti-coelho e rato anti-anticorpos secundários que são marcadas com corante com espectros de emissão facilmente distinguíveis. </li><li> Os arquivos de imagem são salvos como arquivos. Tiff. Figura 4 (imagem de arquivos digitalizados). </li></ol> 6. Análise de Dados <ol><li> Lançamento do Software MicroVigene (VigeneTech, Carlisle, MA, EUA). </li><li> Abra. Tiff arquivo de imagem contendo a digitalização do slide RPPA. </li><li> Seleccionar um ficheiro de modelo predefinido que terá uma grelha para sobrepor a imagem do slide RPPA. </li><li> Clique no botão definir regiões de interesse (ROI), para abrir a grade. </li><li> Posicione a grade sobre os pontos RPPA. Figura 6a (imagem da grade sobre a imagem). </li><li> Clique no botão Selecionar ALL destacar tudo o ROI. </li><li> Clique em Localizar tudo. MicroVigene vai automaticam encontrar o ROI, encontrar os pontos, subtrair o fundo, remova a poeira e quantificar pontos. </li><li> Clique no botão Exibir curva de diluição para trazer os resultados para todas as amostras no slide RPPA. </li><li> Clique em Salvar Dados diluição. </li><li> À medida que cada amostra é impresso em 5 pontos a cada diluição em triplicado, são 15 pontos a analisar, o que reduz o risco de erros e melhora a qualidade do ajustamento de curva. MicroVigene produz uma logística de 4 parâmetros de registo de modelo de algoritmo &quot;Supercurve&quot; (Figura 6b), que incorpora todos os pontos para produzir uma curva sigmoidal de antigénio-anticorpo cinética de ligação. A suposição é que os mesmos anticorpos antígeno-cinética de ligação está ocorrendo em cada ponto da amostra, mesmo em diferentes amostras, assim, tomando todos os pontos em uma matriz para atender a uma curva de resposta comum pode aumentar a confiança do ajuste de curva 10,11 Y = a + ((ba) / (1 + e-(c * d-ln (x))) em que x é o dilution factor e Y é a intensidade do sinal. As amostras podem ser analisadas comparativamente, usando o valor de y0, que, em nossa análise correspondia ao valor de y no ponto médio dos valores de x, após o mapeamento aqueles para o supercurve. </li><li> Exportar os dados em Microsoft Excel e enredo y0 como na Figura 7. </li><li> Variância proteína intratumoral foi calculado separadamente para tratados e não tratados pacientes tratados em um quadro ANOVA. Distribuições de variância combinando dados a partir de todas as proteínas analisadas foram comparados pelo teste de Mann-Whitney (TMV). Variações intratumorais para proteínas individuais foram comparadas pelo teste F, onde os pressupostos de normalidade e homocedasticidade realizadas, respectivamente avaliada utilizando o Lillefours e testes Fligner; taxa de descoberta de falsas (FDR) correção foi aplicada 12. A expressão diferencial de proteínas entre as amostras dos pacientes tratados e não tratados foi testada para cada proteína utilizando teste t de Student, onde normalidade e homocedasticidade suposiçãos foram atendidas, caso contrário, MWT foi realizada; FDR foi aplicado sobre os valores combinados t-teste e MWT 12. Significado da expressão de proteínas e correlação de Pearson variância para as proteínas foram estimados usando uma abordagem padrão [R referência] e FDR aplicada 12. </li></ol>

<ol><li>Stewart, G. D., O'Mahony, F. C., Powles, T., Riddick, A. C., Harrison, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+can+molecular+pathology+contribute+to+the+management+of+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Urol%22%5BJournal%5D)">What can molecular pathology contribute to the management of renal cell carcinoma.</a> Nat. Rev. Urol. 8, 255-265 (2011).</li>
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<li>Spurrier, B., Ramalingam, S., Nishizuka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse-phase+protein+lysate+microarrays+for+cell+signaling+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Reverse-phase protein lysate microarrays for cell signaling analysis.</a> Nat. Protoc. 3, 1796-1808 (2008).</li>
<li>Hu, J., He, X., Baggerly, K. A., Coombes, K. R., Hennessy, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-parametric+quantification+of+protein+lysate+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Non-parametric quantification of protein lysate arrays.</a> Bioinformatics. 23, 1986-1994 (2007).</li>
<li>Wang, X., Dong, Y., Jiwani, A. J., Zou, Y., Pastor, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+protein+arrays+for+quantitative+systems+analysis+of+the+dynamics+of+signaling+pathway+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proteome+Sci%22%5BJournal%5D)">Improved protein arrays for quantitative systems analysis of the dynamics of signaling pathway interactions.</a> Proteome Sci. 9, 53(2011).</li>
<li>Benjamini, Y., Hochberg, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+the+False+Discovery+Rate%3A+A+Practical+and+Powerful+Approach+to+Multiple+Testing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Statistical+Society+Series+B+%28Methodological%29%22%5BJournal%5D)">Controlling the False Discovery Rate: A Practical and Powerful Approach to Multiple Testing.</a> Journal of the Royal Statistical Society Series B (Methodological). 57, 289-300 (1995).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O método aqui apresentado RPPA representa uma alternativa para a produção elevada amplamente utilizada mas comparativamente baixa taxa de transferência western blot técnica de análise de proteínas. O método permite que centenas de amostras para ser semi-quantitativamente analisadas e comparadas simultaneamente permitindo a comparação directa de proteínas-chave através de uma grande variedade de linhas celulares e amostras de tecido. Multiplexagem com espécies diferentes de anticorpos aumenta ainda mais o poder da técnic...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> aprotinina </td><td> Sigma </td><td> A6279 </td></tr><tr><td> cocktail inibidor de fosfatase duas </td><td> Sigma </td><td> P5726 </td></tr><tr><td> cocktail de inibidores de fosfatase 3 </td><td> Sigma </td><td> P0044 </td></tr><tr><td> cocktail inibidor de protease </td><td> Roche </td><td> 11836153001 </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Triton-X </td><td> T8787 </td></tr><tr><td> Li-Cor Odyssey tampão de bloqueio </td><td> Li-Cor </td><td> 927-40000 </td></tr><tr><td> TissueLyser </td><td> Qiagen </td><td> 85600 </td></tr><tr><td> MicroGrid II robótica spotter </td><td> Biorobotics </td><td></td></tr><tr><td> Quatro FastFrame &#39;suporte de slides baía </td><td> Whatman </td><td> 10486001 </td></tr><tr><td> Deslize FAST - 2-Pad </td><td> Whatman </td><td> 10485317 </td></tr><tr><td> IRDye Cabra 680LT anti-IgG </td><td> Licor </td><td> 926-68020 </td></tr><tr><td> IRDye Cabra 800CW anti-IgG de coelho </td><td> Licor </td><td> 926-32211 </td></tr></tbody></table>

o uso de matrizes de fase reversa proteínas (rppa) para explorar variação protein expression individuais dentro de câncer de células renais

The Use of Reverse Phase Protein Arrays (RPPA) to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers

Actualmente não existe tratamento curativo para cancro metastático da célula clara de células renais, o mais comum dos variante da doença. Um factor chave neste resistência ao tratamento é considerado a complexidade molecular da doença 1. Terapia-alvo, tais como o inibidor da tirosina cinase (TKI)-sunitinib têm sido utilizados, mas apenas 40% dos pacientes respondem, com a grande maioria destes pacientes recidivantes dentro de 1 ano 2. Como tal a questão da resistência intrínseca e adquirida em pacientes com câncer de células renais é altamente relevante 3. Para estudar a resistência a inibidores da tirosina quinase, com o objetivo final de desenvolver tratamentos eficazes e personalizados, tecido seqüencial após um período específico de terapia-alvo é necessária, uma abordagem que tinha sido bem sucedida em mielóide crônica 4 leucemia. No entanto, a aplicação de uma tal estratégia em carcinoma de células renais é complicada pelo elevado nível de both heterogeneidade inter-e intra-tumoral, o que é uma característica do carcinoma de células renais, 5,6, assim como outros tumores sólidos 7. Heterogeneidade Intertumoral devido a diferenças transcriptomic e genética está bem estabelecido, mesmo em pacientes com apresentação semelhante, estágio e grau do tumor. Além disso, é evidente que existe uma grande heterogeneidade (intratumoral) morfológica no RCC, a qual é susceptível de representar ainda maior heterogeneidade molecular. Mapeamento detalhado e classificação de tumores CCR por análise morfológica e classificação combinada Fuhrman permite a seleção de áreas representativas para análise proteômica. Análise de proteínas baseada em 8 RCC é atraente devido a sua ampla disponibilidade em laboratórios de patologia, no entanto, a sua aplicação pode ser problemática devido à disponibilidade limitada de anticorpos específicos 9. Devido à natureza dot blot dos arrays de proteínas, em fase reversa (RPPA), a especificidade do anticorpo deve be pré-validado, como o controlo de qualidade rigoroso de tais anticorpos utilizados é de importância primordial. Apesar desta limitação, o formato dot blot não permite a miniaturização do ensaio, permitindo a impressão de centenas de amostras para uma lâmina de nitrocelulose único. Slides impressos podem então ser analisadas de uma forma semelhante à análise de Western com o uso de alvos específicos anticorpos primários e anticorpos secundários marcados com fluorescência, permitindo a multiplexagem. A expressão diferencial de proteínas em todas as amostras numa lâmina pode então ser analisados ​​simultaneamente através da comparação do nível relativo de fluorescência de uma forma mais rentável e de alto rendimento.

Um exemplo de uma lâmina de RPPA digitalizada pode ser visto na Figura 4 (i), com ambos os canais 680 e 800 nm indicadas. Separando as imagens por comprimento de onda, a Figura 4 (ii) permite que cada bloco na corrediça RPPA a ser analisado e a expressão da proteína individual determinada Figura 4 (iii). Como pode ser visto na Figura 4 (iii) a expressão de proteínas individuais através das amostras é o único com gelsolina tendo um elevado nível de expre...

RPPA permite a expressão da proteína de centenas de amostras, impressos em lâminas de nitrocelulose para serem interrogados ao mesmo tempo, utilizando anticorpos marcados com fluorescência. Esta técnica tem sido utilizada para estudar o efeito do tratamento com medicamentos na heterogeneidade claro carcinoma de células renais.

O uso de matrizes de fase reversa Proteínas (RPPA) para explorar variação Protein Expression individuais dentro de câncer de células renais

Currently there is no curative treatment for metastatic clear cell renal cell cancer, the commonest variant of the disease. A key factor in this treatment ...

O objetivo deste procedimento é estudar a variação da expressão proteômica no câncer de células renais usando matrizes de proteínas de fase reversa ou RPPA. Isso é feito primeiro mapeando e selecionando áreas heterogêneas de tumores individuais. O segundo passo é extrair proteínas das amostras.Em seguida, as proteínas são normalizadas e impressas em lâminas RPPA. A etapa final é analisar as lâminas usando anticorpos contra proteínas de interesse. Em última análise, a RPPA é usada para mostrar a variação da expressão proteômica diferencial em dois grupos de tratamento do câncer de células renais.Este método pode ajudar a responder a algumas das principais questões no campo do câncer de células renais. Pois existe uma grande heterogeneidade de proteínas. As implicações para esta técnica são que ela pode impactar positivamente no tratamento de pacientes com câncer de células renais que são tratados com terapias direcionadas.Isso ocorre porque podemos investigar a heterogeneidade pré e pós-tratamento em amostras de tecido e, portanto, identificar novos alvos drogáveis para pacientes que desenvolvem resistência adquirida a esses tratamentos. Demonstrando o procedimento de criostato e joelho H estará a gerente do laboratório de pesquisa Helen Caldwell, demonstrando a técnica de extração de proteínas será a técnica de pesquisa do nosso grupo, Jo Nanda. Demonstrando a impressão OR PPA estará nosso colega de St.Andrews, Peter Mullen.Para iniciar este procedimento, remova os tumores do freezer de 80 graus Celsius negativos e mantenha em gelo seco. Divida os tumores em seções de aproximadamente um centímetro cúbico. Mapeie a posição original de cada seção do tumor em relação uma à outra e rotule com um nome exclusivo.Revestir as amostras em OCT e cortar num criostato de menos 22 graus Celsius após as amostras serem coradas. Usando o método de coloração dos contadores hemat, toin e DSN, analise as seções congeladas por microscopia. Certifique-se de que as seções sejam um tumor viável de carcinoma de células renais de células claras e classifique-as como de alto grau, baixo grau ou misto, baixo e alto grau.Selecione até quatro amostras de cada região morfologicamente diferente dentro de cada tumor para extração de proteína, que será demonstrada ao lado de extrair proteína de amostras de tumor. Coloque 50 a 75 miligramas de tecidos. Corte de uma tomografia computadorizada em tubos de dois mililitros.Adicione 990 microlitros de tampão de lise, suplementado com uma proteína e inibidores de fosfatase e protease. Adicione uma única bola de aço de cinco milímetros a cada tubo e homogeneize a 50 hertz por cinco minutos. Usando um laser de tecido.Verifique o nível de homogeneização e homogeneize por mais cinco minutos. Usando uma pipeta, transfira a amostra homogeneizada para um novo tubo de dois mililitros, deixando a esfera de aço atrás de 10 microlitros de Triton X 100 para cada amostra e, em seguida, centrifugue a 13.000 vezes G por 30 minutos a quatro graus Celsius. Transferir os sobrenadantes S para tubos de microcentrífuga frescos e determinar a concentração de proteínas utilizando o ensaio BCA.Concentrações de proteína normalizadas para um miligrama por mililitro antes de nossa impressão de PPA. Uma série de cinco diluições duplas é feita a partir de cada amostra. Um dos aspectos mais demorados deste procedimento é fazer com que centenas de resultados bem-sucedidos de diluição possam ser garantidos por verificação dupla antes de imprimir as lâminas.Um observador robótico de microrrede é então usado para detectar lisados de proteínas em lâminas de vidro revestidas de nitrocelulose. Cada amostra é manchada em triplicata, resultando em um total de 15 pontos por amostra. As lâminas usadas neste experimento continham duas almofadas nas quais as amostras são localizadas.Cada almofada foi manchada com amostras idênticas, neste caso, 100 amostras. Outros formatos disponíveis incluem um oito e 16 slides de almofada. Quanto maior o número de almofadas, menor o número de amostras que podem estar em cada uma.Para iniciar o procedimento de detecção de proteínas lâminas úmidas, um tampão de bloqueio em excesso e incubar a temperatura ambiente Por uma hora em uma plataforma de balanço, prepare 800 microlitros de anticorpos primários em tampão de bloqueio nas concentrações desejadas e mantenha no gelo. Após a incubação de uma hora. Ao bloquear as corrediças de montagem do buffer no clipe de chip de quadro único ou no suporte de slide de base de quatro quadros rápidos, de modo que uma vedação firme seja formada entre a lâmina e a câmara de incubação.Remova o tampão residual dos poços e adicione 600 microlitros de anticorpo primário aos respectivos poços. Coloque as lâminas e a câmara em uma caixa úmida selada e incube em uma plataforma de balanço durante a noite a quatro graus Celsius na manhã seguinte. Remova as lâminas da câmara fria.Remova cuidadosamente os anticorpos primários de cada um. Bem, adicione 600 micro liberações de 0,1% PBS entre 20 ou PBST e lave as lâminas em uma plataforma de balanço em temperatura ambiente por cinco minutos. Substitua o PBST por um novo PBST desta forma.Lave as lâminas um total de três vezes. Remova o tampão dos poços e adicione 600 microlitros de anticorpos secundários marcados com fluorescência na diluição apropriada aos respectivos poços. Incubar com anticorpos secundários à temperatura ambiente durante 45 minutos com agitação suave, é importante proteger a membrana da luz até ao momento em que é digitalizada.Após 45 minutos, remova os anticorpos secundários dos poços e lave brevemente três vezes em 600 microlitros de PBST à temperatura ambiente. Remova as lâminas do transportador, transfira para um recipiente adequado e lave o excesso de PBST por 15 minutos. Mantendo a membrana no escuro.Remova o PBST e lave a membrana com PBS em temperatura ambiente por 15 minutos para remover novamente a interpolação residual 20, mantendo a membrana no escuro. Experimente os slides rápidos em um forno a 50 graus Celsius por 10 minutos. Finalmente, escaneie as lâminas como 680 nanômetros e ou 800 nanômetros, dependendo dos anticorpos secundários usados.Certifique-se de manter as lâminas no escuro até que sejam digitalizadas. Salve imagens como arquivos T. Um exemplo de uma lâmina RPPA digitalizada pode ser visto nesta figura com canais de 680 e 800 nanômetros mostrados.A separação das imagens por comprimento de onda permite que cada almofada na lâmina RPPA seja analisada e a expressão proteica individual seja determinada conforme mostrado aqui. A expressão de proteínas individuais nas amostras é única, com gel soin tendo um alto nível de expressão em toda a lâmina em comparação com cmic, que tem uma expressão proteica muito menor, mas ainda universalmente expressa em todas as amostras testadas. Em contraste, o CD 10 deu expressão variável com certas amostras dando um alto nível de expressão, apesar de outras amostras terem pouca ou nenhuma expressão detectável.Finalmente, p JK dois não conseguiu produzir qualquer expressão proteica detectável acima do nível de fundo. A próxima figura destaca a falta de reatividade cruzada entre anticorpos secundários e anticorpos primários de outra espécie. A imagem no canto inferior esquerdo mostra a detecção da expressão da proteína usando anticorpos secundários escaneados no comprimento de onda correto de 680 nanômetros.A expressão da proteína não é detectada na imagem à direita, escaneada no comprimento de onda incorreto de 800 nanômetros. Um exemplo da supercurva usada para análise comparativa de todas as amostras na lâmina RPPA é mostrado aqui. Os pontos verdes representam pontos aceitáveis e os pontos vermelhos representam valores discrepantes com base em limites predefinidos no software de análise.A supercurva é usada para produzir dados de expressão relativos baseados em proteínas. Esta figura mostra os níveis de expressão de uma proteína representativa mlh em três lâminas de RPPA, destacando como a RPPA pode detectar diferenças entre amostras tratadas e não tratadas. Cada amostra aqui corresponde a uma sub-região do tumor.A próxima figura mostra a expressão diferencial da proteína para mlh um após as amostras terem sido agrupadas com base no tratamento. Maior expressão de MLH um foi encontrada no grupo pré-tratamento quando a variância intratumoral na expressão de mlh um entre as amostras pré e pós-tratamento é calculada. Após o agrupamento das amostras com base no tratamento, observou-se maior variância nas amostras pós-tratamento.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como utilizar o PPA para o estudo da heterogeneidade da proteína.

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Implementação de um modelo ortotópico de carcinoma de células renais, em ratinhos imunocompetente proporciona o investigador um sistema clinicamente relevante definida pela presença de um primárias metástases tumorais e pulmonares renais no mesmo animal. Este sistema pode ser usado para testar pré-clinicamente uma variedade de tratamentos in vivo.

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O uso de matrizes de fase reversa Proteínas (RPPA) para explorar variação Protein Expression individuais dentro de câncer de células renais

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