O Citrobacter rodentium Modelo de Rato: Contribuições Estudar patógeno e hospedeiro para Colite Infecciosa

O objetivo geral deste procedimento é induzir colite infectando camundongos com o patógeno espelhado gram-negativo, roedor citrobacter, permitindo o estudo das interações patógeno e hospedeiro no trato gastrointestinal. Isso é feito pela inoculação primeiro, uma cultura de redenção zero da noite para o dia. Na segunda etapa, os camundongos são infectados por gavagem oral com o inóculo noturno.

Em seguida, no sétimo dia pós-infecção, o cólon ceco e o conteúdo luminal são coletados durante a etapa final. Os tecidos são plaqueados, as colônias bacterianas são contadas e os tecidos são imunocorados para as proteínas hospedeiras de interesse. Em última análise, a carga do patógeno, a função de barreira, o dano histológico e as alterações na resposta do hospedeiro podem ser avaliados por meio de imuno-histoquímica.

Embora este método ofereça um modelo robusto de colite infecciosa, permitindo o estudo das interações do patógeno hospedeiro e das respostas imunes, ele também pode ser adaptado para examinar os efeitos da infecção bacteriana no risco de câncer de cólon. Geralmente, nos indivíduos novos neste método, naturalmente lutariam com a infecção bacteriana dos camundongos, com ou com, ou calibre. Comece usando uma alça de inoculação estéril para listrar o resgate viável de C de um estoque de glicerol congelado em uma galvaniza LB.

Após a incubação noturna a 37 graus Celsius, use uma alça de inoculação para transferir colônias da placa LB para três mililitros de caldo estéril lb. Em seguida, incube a cultura ERO Dunum aerobicamente em um agitador de incubação de bancada a 200 RPM durante a noite a 37 graus Celsius. Na manhã seguinte, o caldo de libra inoculado deve parecer turvo.

Agite suavemente a cultura para distribuir uniformemente a cultura de células bacterianas e, em seguida, carregue uma seringa de um mililitro com caldo e conecte-a a uma agulha de gavagem gástrica. Selecione um mouse para gavagem segurando firmemente a pele solta sobre o pescoço e as costas com fem e dedos. Em seguida, puxe a cabeça do animal para trás com o dedo indicador para imobilizar a cabeça do animal e endireite o esôfago para inserção.

Mantendo o rato na posição vertical, direcione a ponta do bulbo da agulha de gavagem gástrica ao longo da lateral da boca do animal e sobre a língua. Passe suavemente a agulha ao longo do céu da boca do animal e avance a agulha pelo esôfago. Por fim, use a seringa para injetar lentamente 100 microlitros do inóculo bacteriano e, em seguida, remova suavemente a agulha de gavagem.

Monitore a taxa de respiração e o comportamento do camundongo após devolvê-lo, sua gaiola no dia do ensaio, scruff o camundongo como acabamos de demonstrar e, em seguida, gavalhe o animal com 150 microlitros de dextrina Fitzy recém-preparada. Retire a comida da gaiola neste momento, quatro horas após a gavagem, e depois a sedação do animal. Use punção cardíaca para coletar o máximo de sangue possível do animal anestesiado.

Adicione o sangue a uma concentração final de citrato ácido dextrose a 3% em um tubo de microcentrífuga para impedir a coagulação. Em seguida, gire as amostras de sangue por 12 minutos a 1000 queijo e quatro graus Celsius. Em seguida, colete o soro e dure-o a um a 10 e um a 100 em PBS a 100 microlitros de cada amostra.

Nessas duas diluições para uma placa de 96 poços em duplicata. Para preparar a curva padrão, dilua amostras de 100 microlitros dos 80 miligramas originais por mililitro. Fitz Dextrin costumava gavagar os camundongos em PBS em tubos de microcentrífuga escuros.

Em seguida, adicione as amostras padrão a uma placa de 96 poços em triplicado. Em seguida, use um fluorímetro para quantificar a fluorescência de cada amostra e para determinar a concentração de dextrina FXI usando técnica asséptica, comece esta etapa adicionando um mililitro de PBS estéril e um cordão de metal de autoclave para arredondar o fundo de dois tubos de centrífuga de mililitro. Em seguida, pese cada tubo.

Em seguida, depois de remover o sêmen e o cólon do mouse, separe o sêmen do cólon e corte-os longitudinalmente. Colete o conteúdo luminal com uma pinça e adicione o conteúdo a um tubo de PBS. Lave a sequela e os tecidos colônicos com PBS estéril antes de colocá-los em tubos separados.

Agora pese os tubos de tecido e homogeneize as amostras usando um batedor de contas por seis minutos. A 30 hertz, adicione 180 microlitros de PBS estéril por poço a uma placa de 96 poços. Em seguida, adicione 20 microlitros de cada amostra homogeneizada ao primeiro poço de cada linha e misture bem.

Dilua as amostras em série adicionando 20 microlitros de cada poço anterior para obter diluição de 10 elevado a menos um no primeiro poço até 10 elevado a menos seis. Em seguida, coloque 10 microlitros de cada diluição de cada amostra em triplicado em uma placa LB de fundo quadrado com uma grade após incubação noturna a 37 graus Celsius. Conte as unidades formadoras de colônias em uma placa.

Calcular a média dos triplicados para cada amostra e, em seguida, registar a diluição a que cada amostra foi contada. Multiplique a UFC média por 50 e pelo fator de diluição no qual a amostra foi contada, resultando em UFC por mililitro. Finalmente, divida pelo peso do tecido para determinar as UFC por grama após a fixação durante a noite, formal e de fixação do cólon e secum de 0,5 centímetro previamente salvo.

Na manhã seguinte, lave os tecidos com etanol a 70% e coloque em um para enviar a uma unidade de histologia para serem incluídos em parafina e corados com hematina e eosina para desparizar os tecidos. Coloque as lâminas em um frasco de coloração de coplan em banho-maria a 65 graus Celsius por 10 minutos. Agora, coloque as lâminas em xileno por quatro lavagens de dois minutos.

Cada um reidrata as lâminas com duas lavagens de cinco minutos e 100% de etanol, seguidas de uma lavagem de cinco minutos em cada um dos seguintes. 95% de etanol, 75% de etanol e água destilada. Coloque as lâminas lavadas em um frasco de coplan com tampão de citrato de sódio pré-aquecido e, em seguida, coloque o frasco em um vaporizador por 30 minutos depois de deixar o frasco descansar em temperatura ambiente por mais 30 minutos, lave as lâminas três vezes com PBS Zied por cinco minutos.

Quando as lâminas estiverem secas, marque a área ao redor do tecido com uma caneta de papanicolau. Em seguida, bloqueie o tecido com tampão de bloqueio em uma câmara de umidade de imunocoloração à temperatura ambiente. Após uma hora, despeje o tampão de bloqueio e incube os tecidos em 50 a 100 microlitros de anticorpo primário a quatro graus Celsius durante a noite.

Após o período de incubação, lave os tecidos três vezes com PBS Azi por cinco minutos. Em seguida, incube as lâminas em 50 a 100 microlitros do anticorpo secundário no escuro à temperatura ambiente após uma hora, lave as lâminas três vezes com água destilada por cinco minutos. Finalmente, desidrate os tecidos, cubra as lâminas com dpi, meio de montagem de ouro prolongado e, em seguida, aplique uma lamínula visualizada nas lâminas sob um microscópio de fluorescência.

Esta primeira figura mostra a dextrina Fitz medida no soro de camundongos C 57 black six, bem como do receptor toll-like para camundongos knockout, que já exibiram integridade da barreira epitelial prejudicada durante a infecção na presença de uma barreira epitelial intestinal intacta. A dextrina ZI é pouco permeável através desta camada. Portanto, níveis aumentados de dextrina Fitz no soro sugerem um comprometimento da integridade da barreira epitelial intestinal durante a infecção, permitindo que essa molécula vaze como controle dos níveis séricos em camundongos não infectados.

Gavagem com dextrina Fitz também são apresentadas. O assentimento é um patógeno luminal que pode aderir intimamente às células epiteliais intestinais. As cargas bacterianas no conteúdo luminal, sequela e tecidos colônicos podem ocorrer no sétimo dia. Pós-infecção.

Descobriu-se que as cargas bacterianas no cólon atingem o pico em torno de 10 elevado ao nono UFC por grama. A maior parte da patologia observada durante a infecção por C DUM em camundongos C 57 PL seis ocorre nos dois centímetros distais do cólon macroscopicamente no sétimo dia pós-infecção. Um espessamento da mucosa colônica, bem como um encurtamento e comprimento do cólon são observados normalmente durante a infecção.

C 57 PL seis camundongos sofrem apenas inflamação e patologia moderadas, caracterizadas histologicamente por infiltração de células imunes, alongamento de criptas colônicas e depleção de células coit. Para caracterizar ainda mais as respostas do hospedeiro montadas durante a infecção com resgate zero, a coloração imunofluorescente pode ser utilizada para examinar mudanças nas proteínas de interesse, como os marcadores de proliferação, ou no exame de aspectos da resposta bacteriana, como sua localização dentro do tecido infectado. Um exemplo dessa técnica de coloração, examinando a proteína hospedeira KI 67, um marcador de proliferação celular que aparece em vermelho e a ruptura da proteína zero de, que aparece em verde para examinar a localização bacteriana no dia 12 após a infecção, é ilustrado nesta figura.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser executada em minutos, se feita corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante que a técnica de medição seja realizada corretamente para garantir que os camundongos estejam infectados e que a saúde do animal seja monitorada durante todo o curso da infecção. Nos últimos 10 a 15 anos, o modelo de roedor citrobacter tornou-se o padrão-ouro para o estudo da fixação de patógenos bacterianos de frente, como o epec.

Além disso, tornou-se um modelo bem reconhecido para o estudo das respostas imunes da mucosa às bactérias, como o desenvolvimento de respostas TH 17 no intestino.