Protocolo melhorado para microdissecção a laser de ilhotas pancreáticas humanas a partir de espécimes cirúrgicos
6 de janeiro de 2013
Microdissecção a laser é uma técnica que permite a recuperação de células selecionadas a partir de pequenas quantidades de parênquima. Aqui descrevemos um protocolo de aquisição ilhotas pancreáticas humanas a partir de espécimes cirúrgicos para serem utilizados para estudos de transcriptomic. Nosso protocolo melhora a autofluorescência intrínseca das células beta humanas, facilitando assim a sua coleção.
Olá, meu nome é Dorte do Thea Hands Institute da Universidade de Tecnologia, Reen Laser. A microdissecção é uma técnica que permite obter uma população celular especial a partir de quantidades muito pequenas de tumor original. As células dissecadas podem ser usadas para estudos transcriptômicos e proteômicos, avaliação de DNA ou análise cromossômica.
Aqui, fornecemos nosso protocolo para aquisição de metacélulas pancreáticas humanas de espécimes cirúrgicos para serem usados em estudos transcriptômicos. Corte o tecido pancreático em pedaços pequenos. Coloque uma peça no centro de um molde criogênico e cubra-a com composto de incorporação refrigerado.
Congele o tecido imediatamente com dois materiais refrigerados Butão e armazenados a menos 80 graus Celsius. Seccionar a etiqueta 40 lâminas adesivas e pré-resfriá-las dentro da Câmara Crística. Fixe o tecido congelado no suporte da amostra com o composto OCT depois de aparar o bloco criogênico.
Corte 40 seções de 10 micrômetros de espessura. Transfira uma seção para uma lâmina tocando na parte de trás da lâmina com o dedo para aquecer apenas a posição de colocar a seção sobre ela.Experimente as seções dois a três minutos dentro do criogênico morto e armazene-as depois a 80 graus Celsius negativos, prepare os reagentes de ação e resfrie todos os líquidos, exceto a selina no gelo. Isso aumentará a autofluorescência intrínseca das células PET antes da microdissecção.
Quatro seções serão reduzidas a cada vez. Lidar com duas seções ao mesmo tempo. Fixe-os primeiro em etanol a 70% por 30 segundos.
Em seguida, lave as seções com cinco a seis mergulhos rápidos. Em água tratada DPC a seguir. Desidrate o tecido um minuto em 100% de etanol e repita Esta etapa, incube as lâminas em seline por quatro minutos.
Enquanto isso, inicie a desidratação de outro par de seções. Finalmente, seque as lâminas ao ar por três a cinco minutos no escuro. Proteja o tecido da umidade e a autofluorescência do branqueamento, colocando as duas lâminas costas com costas em uma folha Enrole o tubo de 50 ml Antes da seção, limpe o microscópio com RNAs e prenda a tampa adesiva no robô Mover.
Insira o slide no stage e mova a tampa sobre a seção sem tocá-la. Localize os ilhós identificando as melhores áreas celulares autofluorescentes. A autofluorescência intrínseca das células humanas melhores aparece amarela na configuração, enquanto os ductos pancreáticos mostram autofluorescência verde brilhante.
Selecione as melhores áreas celulares com a ferramenta de seleção à mão livre e microdisseque-as iniciando o laser. Disseque os ilhós de quatro seções criogênicas reduzidas em uma tampa adesiva dentro de 40 a 60 minutos. Se desejar, verifique o tecido capturado movendo a tampa para o ponto de verificação do microscópio.
Remova a tampa do motor robótico e canalize-a. Tampão de extração de 10 microlitros na tampa da tampa para ruptura celular. Incube a tampa de cabeça para baixo a 42 graus Celsius por 30 minutos.
Gire o lisado, rotule o tubo e armazene-o a menos 80 graus Celsius diminuídos até que a extração de RNA possa ocorrer. Execute o laser de ação, micro dissecção e lise com todas as 40 dissecações criogênicas. Em seguida, unir os 10 lisados e continuar com o isolamento de RNA usando o kit de isolamento de RNA de PU UR seguindo o protocolo fornecido para obter 11 microlitros de RNA.
Em geral, não encontramos uma relação direta entre a quantidade de tecido microdissectivo e o rendimento de RNA As diferenças no intervalo de tempo entre a coleta pelos cirurgiões e o congelamento da amostra pancreática após seu exame pelo patologista, poderiam explicar em parte a qualidade e a quantidade de RNA recuperado. Outros fatores-chave a serem considerados são a energia do laser aplicada para microdissecção com a energia mais baixa, usando a integridade do RNA mais alta, bem como o foco do laser e a distância dos pontos de apontamento do cortador de pressão do laser. Além disso, a quantidade de RNA pode ser otimizada mantendo a distância entre a tampa adesiva e a mais baixa possível.
Evite a perda de tecido microdissecado durante o processo de captura, desde que o microscópio de microdissecção a laser esteja disponível. Este procedimento pode ser implementado em qualquer instituição de pesquisa que realize ectomias parciais do pâncreas, aumentando assim o acesso ao material palpebral humano de indivíduos não diabéticos e diabéticos.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo para microdissecção a laser com o objetivo de recuperar ilhotas pancreáticas humanas a partir de espécimes cirúrgicos. A técnica melhora a coleta de células beta para estudos transcriptômicos.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Transcriptômica
Contexto
- A microdissecção a laser permite o isolamento de populações celulares específicas.
- É particularmente útil para amostras pequenas de tecido.
- A técnica pode ser aplicada a diversos estudos, incluindo análises transcriptômicas e proteômicas.
- A melhoria da autofluorescência auxilia na coleta de células-alvo.
Objetivo do Estudo
- Fornecer um protocolo detalhado para a obtenção de ilhotas pancreáticas humanas.
- Facilitar o estudo de células beta em pesquisas transcriptômicas.
- Aprimorar a eficiência da coleta de células a partir de espécimes cirúrgicos.
Métodos Utilizados
- Técnica de microdissecção a laser aplicada a tecido pancreático.
- Preparação de amostras de tecido mediante corte em pequenos fragmentos.
- Inclusão do tecido em um composto refrigerado para dissecção ideal.
- Coleta de células beta para análises posteriores.
Resultados Principais
- Isolamento bem-sucedido de ilhotas pancreáticas humanas.
- Autofluorescência melhorada de células beta observada.
- O protocolo demonstrou eficácia para estudos transcriptômicos.
- Facilitou a coleta de populações celulares específicas a partir de amostras pequenas.
Conclusões
- O protocolo melhora a recuperação de ilhotas pancreáticas humanas.
- A microdissecção a laser é uma ferramenta valiosa para análise celular.
- Métodos aprimorados podem levar a melhores insights na pesquisa transcriptômica.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A microdissecção a laser permite o isolamento preciso de células beta pancreáticas humanas a partir de espécimes cirúrgicos limitados, abordando um gargalo crítico nos estudos transcriptômicos de tecidos relevantes para o diabetes. Ao realçar a autofluorescência intrínseca por meio do processamento com reagentes gelados, o protocolo reduz o tempo de manipulação do tecido e melhora a preservação do RNA, apoiando diretamente a validação de alvos na pesquisa de doenças metabólicas. Essa abordagem fortalece a desvinculação mecanicista ao fornecer populações celulares purificadas para aplicações omicas downstream em fluxos de trabalho de descoberta precoce.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas ao isolar populações puras de células beta para análise de vias em modelos de diabetes tipo 2.
- Valor Operacional: Facilita a desmistificação biológica por meio da identificação rápida e precisa de células-alvo por autofluorescência aprimorada, reduzindo falsos positivos na seleção de alvos.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos validados para padronização de ensaios ao fornecer entradas de RNA consistentes e de alta integridade a partir de ilhotas microdissecadas.
- Valor Operacional: Apoia saídas quantitativas reprodutíveis, essenciais para a prontidão de triagem e reutilização de plataformas em pipelines de descoberta de biomarcadores.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Mantém a relevância para a doença ao permitir a análise transcriptômica de ilhotas pancreáticas humanas diretamente associadas à fisiopatologia diabética.
- Valor Operacional: Garante a continuidade desde a descoberta até a validação pré-clínica, fornecendo populações celulares definidas para estudos mecanicistas complementares.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra ao continuum de descoberta ao permitir a testagem de hipóteses na biologia inicial, apoiar o desenvolvimento de ensaios por meio de insumos padronizados e orientar decisões translacionais por meio de perfis moleculares quantitativos.
- Biologia da Descoberta: Apoia a clarificação de vias e a redução de riscos biológicos mediante o isolamento de células beta para validação funcional de alvos em modelos de doenças metabólicas.
- Triagem: Fornece amostras prontas para ensaio com rendimentos reprodutíveis de RNA, essenciais para a triagem dos efeitos de compostos sobre ilhotas isoladas.
- Análises: Gera leituras transcriptômicas quantitativas que permitem comparação entre estados diabéticos e não diabéticos, auxiliando na identificação de compostos líderes.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica ao fornecer amostras relevantes para humanos, que interligam achados in vitro aos mecanismos da doença.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma capacidade reutilizável de acesso a ilhotas humanas primárias em múltiplos projetos, reduzindo a dependência de fontes de doadores variáveis.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva ao reduzir a ambiguidade mecanicista nas vias de sinalização específicas de células beta.
- Valor Operacional: Aprimora a padronização e reprodutibilidade por meio do processamento controlado de tecidos e parâmetros de dissecação definidos.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguimento ou interrupção ao permitir a avaliação precoce do engajamento do alvo em células relevantes para humanos, reduzindo riscos biológicos em fases tardias.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de alvos para diabetes com base em perfis transcriptômicos validados de ilhotas humanas.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em histologia, criomicrotomia e instrumentação de microdissecção a laser.
- Depende do acesso a um sistema PALM MicroBeam ou plataforma de DML equivalente com capacidade AutoLPC.
- Necessita de protocolos padronizados de manipulação de reagentes para manter a autofluorescência e a integridade do RNA entre diferentes usuários.
- Envolve considerações de adaptação para a qualidade variável de espécimes pancreáticos e tempo isquêmico entre a coleta e o congelamento.
- Limitado pelas restrições no rendimento de RNA, exigindo o agrupamento de múltiplas amostras microdissecadas para obter quantidade suficiente para kits downstream.
