Protocolo melhorado para microdissecção a laser de ilhotas pancreáticas humanas a partir de espécimes cirúrgicos
January 6th, 2013
Microdissecção a laser é uma técnica que permite a recuperação de células selecionadas a partir de pequenas quantidades de parênquima. Aqui descrevemos um protocolo de aquisição ilhotas pancreáticas humanas a partir de espécimes cirúrgicos para serem utilizados para estudos de transcriptomic. Nosso protocolo melhora a autofluorescência intrínseca das células beta humanas, facilitando assim a sua coleção.
Olá, meu nome é Dorte do Thea Hands Institute da Universidade de Tecnologia, Reen Laser. A microdissecção é uma técnica que permite obter uma população celular especial a partir de quantidades muito pequenas de tumor original. As células dissecadas podem ser usadas para estudos transcriptômicos e proteômicos, avaliação de DNA ou análise cromossômica.
Aqui, fornecemos nosso protocolo para aquisição de metacélulas pancreáticas humanas de espécimes cirúrgicos para serem usados em estudos transcriptômicos. Corte o tecido pancreático em pedaços pequenos. Coloque uma peça no centro de um molde criogênico e cubra-a com composto de incorporação refrigerado.
Congele o tecido imediatamente com dois materiais refrigerados Butão e armazenados a menos 80 graus Celsius. Seccionar a etiqueta 40 lâminas adesivas e pré-resfriá-las dentro da Câmara Crística. Fixe o tecido congelado no suporte da amostra com o composto OCT depois de aparar o bloco criogênico.
Corte 40 seções de 10 micrômetros de espessura. Transfira uma seção para uma lâmina tocando na parte de trás da lâmina com o dedo para aquecer apenas a posição de colocar a seção sobre ela.Experimente as seções dois a três minutos dentro do criogênico morto e armazene-as depois a 80 graus Celsius negativos, prepare os reagentes de ação e resfrie todos os líquidos, exceto a selina no gelo. Isso aumentará a autofluorescência intrínseca das células PET antes da microdissecção.
Quatro seções serão reduzidas a cada vez. Lidar com duas seções ao mesmo tempo. Fixe-os primeiro em etanol a 70% por 30 segundos.
Em seguida, lave as seções com cinco a seis mergulhos rápidos. Em água tratada DPC a seguir. Desidrate o tecido um minuto em 100% de etanol e repita Esta etapa, incube as lâminas em seline por quatro minutos.
Enquanto isso, inicie a desidratação de outro par de seções. Finalmente, seque as lâminas ao ar por três a cinco minutos no escuro. Proteja o tecido da umidade e a autofluorescência do branqueamento, colocando as duas lâminas costas com costas em uma folha Enrole o tubo de 50 ml Antes da seção, limpe o microscópio com RNAs e prenda a tampa adesiva no robô Mover.
Insira o slide no stage e mova a tampa sobre a seção sem tocá-la. Localize os ilhós identificando as melhores áreas celulares autofluorescentes. A autofluorescência intrínseca das células humanas melhores aparece amarela na configuração, enquanto os ductos pancreáticos mostram autofluorescência verde brilhante.
Selecione as melhores áreas celulares com a ferramenta de seleção à mão livre e microdisseque-as iniciando o laser. Disseque os ilhós de quatro seções criogênicas reduzidas em uma tampa adesiva dentro de 40 a 60 minutos. Se desejar, verifique o tecido capturado movendo a tampa para o ponto de verificação do microscópio.
Remova a tampa do motor robótico e canalize-a. Tampão de extração de 10 microlitros na tampa da tampa para ruptura celular. Incube a tampa de cabeça para baixo a 42 graus Celsius por 30 minutos.
Gire o lisado, rotule o tubo e armazene-o a menos 80 graus Celsius diminuídos até que a extração de RNA possa ocorrer. Execute o laser de ação, micro dissecção e lise com todas as 40 dissecações criogênicas. Em seguida, unir os 10 lisados e continuar com o isolamento de RNA usando o kit de isolamento de RNA de PU UR seguindo o protocolo fornecido para obter 11 microlitros de RNA.
Em geral, não encontramos uma relação direta entre a quantidade de tecido microdissectivo e o rendimento de RNA As diferenças no intervalo de tempo entre a coleta pelos cirurgiões e o congelamento da amostra pancreática após seu exame pelo patologista, poderiam explicar em parte a qualidade e a quantidade de RNA recuperado. Outros fatores-chave a serem considerados são a energia do laser aplicada para microdissecção com a energia mais baixa, usando a integridade do RNA mais alta, bem como o foco do laser e a distância dos pontos de apontamento do cortador de pressão do laser. Além disso, a quantidade de RNA pode ser otimizada mantendo a distância entre a tampa adesiva e a mais baixa possível.
Evite a perda de tecido microdissecado durante o processo de captura, desde que o microscópio de microdissecção a laser esteja disponível. Este procedimento pode ser implementado em qualquer instituição de pesquisa que realize ectomias parciais do pâncreas, aumentando assim o acesso ao material palpebral humano de indivíduos não diabéticos e diabéticos.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo para microdissecção a laser para recuperar ilhotas pancreáticas humanas de espécimes cirúrgicos. A técnica melhora a coleta de células beta para estudos transcriptômicos.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Transcriptômica
Fundo
- A microdissecção a laser permite o isolamento de populações celulares específicas.
- É particularmente útil para pequenas amostras de tecido.
- A técnica pode ser aplicada a vários estudos, incluindo análises transcriptômicas e proteômicas.
- Melhorar a autofluorescência auxilia na coleta de células-alvo.
Objetivo do Estudo
- Fornecer um protocolo detalhado para aquisição de ilhotas pancreáticas humanas.
- Facilitar o estudo de células beta em pesquisas transcriptômicas.
- Melhorar a eficiência da coleta de células a partir de espécimes cirúrgicos.
Métodos Utilizados
- Técnica de microdissecção a laser aplicada ao tecido pancreático.
- Preparação de amostras de tecido cortando em pequenos pedaços.
- Incorporação de tecido em um composto refrigerado para dissecção ideal.
- Coleta de células beta para análise adicional.
Principais Resultados
- Isolamento bem-sucedido de ilhotas pancreáticas humanas.
- Melhora da autofluorescência das células beta observada.
- Protocolo demonstrou eficácia para estudos transcriptômicos.
- Facilitou a coleta de populações celulares-alvo de pequenas amostras.
Conclusões
- O protocolo melhora a recuperação de ilhotas pancreáticas humanas.
- A microdissecção a laser é uma ferramenta valiosa para análise celular.
- Métodos aprimorados podem levar a melhores insights em pesquisas transcriptômicas.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Laser microdissection enables precise isolation of human pancreatic beta cells from limited surgical specimens, addressing a critical bottleneck in transcriptomic studies of diabetes-relevant tissues. By enhancing intrinsic autofluorescence through ice-cold reagent processing, the protocol reduces tissue handling time and improves RNA preservation, directly supporting target validation in metabolic disease research. This approach strengthens mechanistic de-risking by providing purified cell populations for downstream omics applications in early discovery workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating pure beta cell populations for pathway analysis in type 2 diabetes models.
- Operational Value: Facilitates biological de-risking through rapid, accurate identification of target cells via enhanced autofluorescence, reducing false positives in target selection.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for assay standardization by providing consistent, high-integrity RNA inputs from microdissected islets.
- Operational Value: Supports reproducible quantitative outputs essential for screening readiness and platform reuse in biomarker discovery pipelines.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease relevance by enabling transcriptomic analysis of human pancreatic islets directly linked to diabetic pathophysiology.
- Operational Value: Ensures continuity from discovery through preclinical validation by supplying defined cell populations for mechanistic follow-up studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by enabling hypothesis testing in early biology, supporting assay development through standardized inputs, and informing translational decisions via quantitative molecular profiling.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and biological de-risking by isolating beta cells for functional target validation in metabolic disease models.
- Screening: Delivers assay-ready samples with reproducible RNA yields, critical for screening compound effects on isolated islets.
- Analytics: Generates quantitative transcriptomic readouts that allow comparison between diabetic and non-diabetic states to inform lead identification.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by providing human-relevant samples that bridge in vitro findings to disease mechanisms.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for accessing primary human islets across multiple projects, reducing dependency on variable donor sources.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in beta cell-specific signaling pathways.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility through controlled tissue processing and defined dissection parameters.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early assessment of target engagement in human-relevant cells, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of diabetes targets based on validated human islet transcriptomic profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in histology, cryosectioning, and laser microdissection instrumentation.
- Dependent on access to a PALM MicroBeam system or equivalent LMD platform with AutoLPC capability.
- Necessitates standardized reagent handling protocols to maintain autofluorescence and RNA integrity across users.
- Involves adaptation considerations for varying pancreatic specimen quality and ischemic time between harvest and freezing.
- Limited by RNA yield constraints, necessitating pooling of multiple microdissected samples for sufficient input to downstream kits.
