2.2: Passagem de células

A passagem, ou subcultura, de células, é um procedimento comum em que as células de uma determinada cultura são divididas, ou "divididas", em novas culturas e alimentadas com novos meios para facilitar a expansão. Embora o conceito em si seja relativamente simples, neste vídeo discutiremos algumas das etapas mais importantes para a manutenção e expansão bem-sucedidas das linhagens celulares.

Os metabólitos tóxicos se acumulam nos meios de cultura celular ao longo do tempo. Ao expandir as células, é particularmente importante trocar o meio regularmente para manter a saúde celular e monitorar a expansão celular para evitar o crescimento excessivo das células.

Geralmente, dois tipos principais de células são subcultivados: linhagens celulares imortalizadas e linhagens de células-tronco

Linhagens celulares imortalizadas são células derivadas de organismos multicelulares que sofreram algum tipo de mutação que afeta a regulação do ciclo celular, permitindo que proliferem indefinidamente. Talvez a linhagem celular imortalizada mais famosa seja a linhagem celular HeLa, que foi derivada de uma lesão de câncer cervical encontrada em uma biópsia retirada da Sra. Henrietta Lacks em 1951.

Em contraste com as linhagens celulares imortalizadas pelo câncer, as linhagens de células-tronco são geradas pelo isolamento de células auto-renovadoras e multipotentes de uma variedade de tecidos, tanto de tecidos adultos quanto embrionários. Sob as condições certas, essas células, como as células-tronco embrionárias humanas que você vê aqui, podem ser mantidas em cultura indefinidamente.

As células são cultivadas de forma ideal em suspensão, como células imortalizadas isoladas do sangue, ou crescem melhor quando aderidas a uma superfície, como é o caso de muitas células derivadas de tecidos.

O crescimento dessas células aderentes deve ser monitorado de perto para garantir a saúde celular. Dependendo do tipo de célula, a maioria das células aderentes precisa ser passada quando são 70-90% confluentes, ou seja, quando cobrem 70-90% da superfície do recipiente de cultura.

Lembre-se de que as linhagens celulares retêm muitas características da cultura de células original, mas a cada passagem sucessiva elas também podem começar a adquirir características exclusivas da cultura expandida. Portanto, considere limitar o número de vezes que você continua a passar uma cultura de células individual.

Ao passar as células, é importante usar a técnica estéril e os reagentes e equipamentos apropriados.

É essencial usar o meio apropriado para o crescimento e expansão ideais de sua linhagem celular. Cada linhagem celular exigirá um coquetel de suplemento de crescimento específico, no entanto, a maioria das linhagens celulares, no mínimo, requer suplementação com o seguinte: Soro, como o soro bovino fetal, que deve ser tratado termicamente para inativar o complemento bovino e que fornece fatores de crescimento vitais para as células, antibióticos, como penicilina e estreptomicina, que ajudam a limitar o crescimento contaminante na cultura, e outros fatores de crescimento, como o fator de crescimento de fibroblastos, para ajudar a prolongar o crescimento e a expansão das linhagens celulares. Armazene o meio de cultura de células suplementado ou "completo" a 4 C quando não estiver usando.

Primeiro, observe a cor do meio de cultura de tecidos. Os meios de cultura de células frescos são ricos em nutrientes e apresentam uma cor laranja clara, em parte devido à adição do indicador de pH, vermelho de fenol.

À medida que as células começam a usar os nutrientes do meio, resíduos e ácidos começam a se acumular na cultura de células, diminuindo o pH. Por esse motivo, muitos meios de cultura de tecidos contêm vermelho de fenol, que transforma o meio de laranja em amarelo quando as células tornam a cultura ácida. Mude a mídia antes que ela fique com essa cor!

Quando o vermelho de fenol deixa o meio com uma cor rosada, indicando que o pH se tornou muito básico para o crescimento celular saudável, talvez seja hora de trocar seu tanque de CO2, bem como seu meio.

A maioria das linhagens celulares aderentes se liga naturalmente ao plástico não revestido. Portanto, placas de cultura de células de plástico, como placas de Petri ou placas de 6 poços, são freqüentemente usadas para subcultura de células.

Frascos de cultura de células de plástico também são usados. O frasco de cultura de células T25, por exemplo, é frequentemente usado para expandir populações de pequenas linhagens celulares ou para iniciar o crescimento de uma linhagem celular em expansão lenta. Os frascos de cultura T75 são comumente usados para linhagens celulares que proliferam mais rapidamente ou para gerar um número maior de células do que pode caber em um frasco T25.

Ao remover as células aderentes, as proteínas que ligam as células ao plástico devem primeiro ser clivadas. Para isso, a enzima digestiva tripsina é frequentemente utilizada. É importante cronometrar cuidadosamente a exposição à tripsina, pois o tratamento por muito tempo pode resultar em danos a outras proteínas da superfície celular.

Os meios de cultura celular podem conter neutralizadores de tripsina. Portanto, a solução salina tamponada com fosfato, ou PBS, é frequentemente usada para lavar as células antes da tripsinização.

O EDTA, um quelante de cálcio, às vezes também é usado para melhorar a função proteolítica da tripsina.

Para a expansão da colônia de células, as células recém-passadas são então cultivadas em uma incubadora de cultura de células sob as condições apropriadas para essa linha celular, normalmente a cerca de 37 C, 5% de CO2 e 95% de umidade.

Antes de começar, é importante entender com que frequência suas células devem ser monitoradas, o que dependerá da rapidez com que suas células proliferam.

Agora que sua mídia está com uma cor laranja feliz, observe as outras condições de cultura, como se a cultura está nublada ou não? possivelmente indicando contaminação - o tamanho e a densidade das colônias de células e a qualidade geral das células.

Se as células atingirem cerca de 90% de confluência, remova o meio de cultura de tecidos e lave as células com PBS livre de cálcio e magnésio.

Agora adicione tripsina às células e incube-as a 37 C. Após cerca de 5 minutos, confirme se as células se desprenderam e, em seguida, interrompa a proteólise adicionando meios de cultura de tecidos frescos.

Transfira a suspensão da célula para um tubo cônico para centrifugação. Em seguida, depois de girar as células, remova cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet e ressuspenda as células em meio fresco. Conte quantas células você coletou e, em seguida, semeie as células de acordo com a densidade apropriada para expansão imediata ou posterior.

Agora que você sabe como passar células, vejamos algumas aplicações diferentes do método.

Como mencionado anteriormente, as células-tronco embrionárias humanas são um tipo de célula que deve ser passada. Eles são tipicamente cocultivados com fibroblastos embrionários de camundongos, ou MEFs, que fornecem fatores que ajudam as células-tronco a manter seu estado pluripotente.

As colônias de células-tronco cultivadas em células alimentadoras precisam ser "colhidas" uma vez que tenham atingido o estágio adequado de desenvolvimento. Eles podem ser selecionados por micropipeta ou por raspagem suave com uma ferramenta de coleta de vidro e, em seguida, revestidos em uma nova cultura para expansão.

Algumas linhagens celulares são sensíveis à digestão enzimática ou são tão fortemente aderentes que não podem ser ressuspensas apenas com o tratamento com tripsina. Um raspador de células pode ser usado para remover suavemente as células do fundo da placa de cultura. Se as células estiverem particularmente aderentes, tente mover uma pipeta sorológica em um movimento firme de raspagem enquanto enxagua o fundo do recipiente celular com meio ou outra solução apropriada. Tome cuidado com este método, pois células delicadas podem ser danificadas por este método mecânico de dissociação.

Para aumentar a expansão de suas células de forma mais rápida e reprodutível do que pode ser alcançado em frascos de camada única, podem ser usados frascos multicamadas, que podem expandir culturas de células de 3 a 5 vezes em comparação com frascos de camada única.

Você acabou de assistir a introdução de JoVE às células passageiras. Neste vídeo, revisamos o que é uma linhagem celular, como subcultivar uma e algumas aplicações diferentes de células passageiras. Obrigado por assistir e lembre-se de manter sua mídia atualizada!