1.13: Introdução à Microscopia de Luz

O microscópio leve é um instrumento usado para ampliar espécimes de pesquisa. Microscópios leves são uma ferramenta analítica inestimável que tem o potencial de permitir que investigadores científicos visualizem objetos a 1000 vezes seu tamanho original. Como você verá, o microscópio de luz opera através de alguns princípios muito básicos, mas tem aplicações quase ilimitadas para visualizar espécimes no laboratório.

Como seu nome implica, o microscópio de luz requer uma fonte de luz, que produz luz que pode ser focada, por uma lente condensadora, na amostra.

A luz que ilumina o espécime atinge uma lente conhecida como lente objetiva, que cria uma imagem ampliada que é invertida, ou virada de cabeça para baixo. A ocular, ou lente ocular, amplia ainda mais a imagem, que o olho recebe então. Elementos ópticos adicionais podem ser introduzidos no caminho da luz para corrigir a imagem, de modo que o olho a veja na orientação correta. Microscópios que utilizam múltiplas lentes como a que você vê aqui são referidos como microscópios compostos.

Em um microscópio composto, a ampliação total é calculada multiplicando-se a ampliação da lente objetiva pela ampliação da lente ocular, ou peça ocular. Com uma lente objetiva de 40X e uma lente ocular 10X, a ampliação total é de 400X.

Para ajudar a estimar o tamanho dos objetos sob o microscópio, uma reticle da ocular, uma escala projetada sobre a imagem pode ser usada. Em uma ampliação mais elevada, as marcas de carrapato na retístia da ocular representarão distâncias menores do que quando vistas em ampliações mais baixas.

Além da ampliação, outro aspecto da óptica do microscópio é a resolução. A resolução refere-se à menor distância solucionável entre dois objetos sob o escopo. À medida que as cabeças desses personagens se tornam cada vez mais claras, e a resolução aumenta, a menor distância observável entre eles diminui.

Os principais componentes do microscópio de luz incluem os objetivos, as oculares, o estágio da amostra e o suporte do espécime, a fonte de luz, o diafragma de campo, o condensador e a abertura, e os botões de foco grosseiro e fino.

Os objetivos são responsáveis pela maior parte da ampliação e resolução do microscópio. Eles são montados em uma peça de nariz rotativa de tal forma que, à medida que os objetivos são alterados, o plano focal permanece o mesmo – uma propriedade chamada de parafocalidade. Um objetivo pode ser marcado com a ampliação, a aperatura numérica ou N.A., o tipo de meio de imersão necessário, a espessura do deslizamento que deve ser usado na montagem de amostras, e a distância de trabalho - a distância da ponta do elemento da lente até o plano focal na amostra.

A abertura numérica, novamente definida como N.A., é uma medida de quão bem um objetivo de microscópio pode reunir luz. Objetivos altos da N.A. permitem que a luz em ângulos oblíquos passe, enquanto os objetivos baixos da N.A. requerem luz mais direta. A resolução de um objetivo pode ser calculada a partir da abertura numérica, dado o comprimento de onda da luz.

A fonte de luz, o diafragma de campo, a abertura e o condensador são todos responsáveis por produzir a luz e entregá-la à amostra.

A fonte de luz é tipicamente uma lâmpada halógena de baixa tensão que pode ser ajustada para controlar a intensidade da luz.

A luz então passa por uma variedade de filtros e para o diafragma de campo, que controla a área do espécime a ser iluminada.

Em seguida é o condensador, que foca luz brilhante no espécime, o cone de iluminação ao redor do espécime é controlado pelo condensador e deve ser ajustado dependendo do objetivo que é usado.

Para começar a usar o microscópio de luz, coloque uma amostra contendo a região de interesse no palco do microscópio, centralizá-lo diretamente sobre o objetivo e fixá-lo no lugar usando os clipes do palco.

Em seguida, ligue a fonte de luz e mude para o objetivo mais baixo alimentado.

Em seguida, concentre o objetivo de baixa potência movendo-o na direção z usando um ajuste inicial do botão de ajuste grosseiro e, em seguida, girando os botões de ajuste fino para trazer o objeto em foco acentuado. Tome cuidado para não acertar o slide ou o estágio com o objetivo, pois isso pode danificar a lente.

Em seguida, localize a área de interesse olhando através das peças dos olhos enquanto ajusta os botões para mover o slide nas direções x e y. O tamanho do campo de visão diminuirá drasticamente à medida que você passa de uma baixa ampliação, para uma ampliação maior.

Centralizar o objetivo mais baixo na área de interesse antes de passar para um poder mais alto aumenta consideravelmente as chances de encontrar o espécime desejado.

Uma vez que a amostra tenha sido localizada em baixa potência e esteja em foco, mova-se para o objetivo de maior poder que será usado para a aquisição de imagens.

Otimize a qualidade da iluminação ajustando primeiro o diafragma de campo para que o diafragma em si esteja fora do campo de visão.

Em seguida, ajuste o diafragma condensador para que as configurações correspondam à abertura numérica do objetivo em uso.

Finalmente, ajuste o foco novamente. Desta vez, apenas usando o botão de ajuste fino.

Você está pronto para tirar imagens do seu espécime.

A microscopia leve tem o potencial de visualizar uma ampla gama de espécimes, e várias configurações do microscópio composto existem para atender a muitas aplicações diferentes.

Aqui, você vê um pesquisador se preparando para trabalhar sob um microscópio cirúrgico. Esses microscópios são geralmente suspensos em um braço móvel e são estereoscópicos, o que significa que eles permitem que a luz passe para o espectador e também uma câmera montada no microscópio. Este microscópio cirúrgico está sendo usado em um procedimento de transplante de rim, em camundongos.

Neste clipe, você vê um pesquisador olhando através de um microscópio dissecando, enquanto escolhe as larvas de drosophila perfeitas para dissecção adicional, a fim de expor os músculos da parede corporal para que a junção neuromuscular possa ser estudada.

Aqui você pode ver um microscópio composto invertido, que tem um objetivo abaixo do palco, sendo preparado para uma técnica de microinjeção. Este procedimento, conhecido como transferência nuclear de células somáticas, é um método importante para a geração de animais transgênicos e a criação de clones.

Você acabou de assistir a introdução do JoVE à Microscopia Leve.

Neste vídeo revisamos: o que é um microscópio e como ele funciona, seus muitos componentes, como fazer ajustes neles e como adquirir imagens de qualidade. Obrigado por assistir!