2.9: Purificação de plasmídeo

Os plasmídeos são moléculas de DNA circulares, extra cromossômicas e, em biologia molecular, atuam como transportadores, ou vetores, de um fragmento específico de DNA. As bactérias são usadas para replicar plasmídeos, de modo que seu DNA de interesse seja produzido em massa. O processo pelo qual os pesquisadores obtêm plasmídeos de bactérias é chamado de purificação de plasmídeos, que será explicado neste vídeo.

Obviamente, a purificação de plasmídeos envolve a purificação de plasmídeos, mas o que isso significa exatamente? Para purificar os plasmídeos, eles devem ser isolados do cromossomo bacteriano, proteínas, membrana bacteriana e ribossomos bacterianos.

Embora existam muitos kits diferentes para purificar plasmídeos, o princípio básico por trás da purificação de plasmídeos permanece o mesmo para todos. Primeiro, a colônia bacteriana selecionada é cultivada em um meio de cultura apropriado que contém os antibióticos corretos. Graças a um gene de resistência a antibióticos, codificado pelo plasmídeo, apenas as bactérias que contêm o plasmídeo crescerão neste meio. As bactérias são colhidas e lisadas sob um pH alto. O pH é neutralizado, o sal é adicionado e, em seguida, a mistura é centrifugada para remover os detritos e o DNA genômico.

O lisado de células neutralizadas é adicionado a uma coluna de sílica. Acredita-se que o DNA do plasmídeo adira à coluna por meio de um mecanismo chamado troca de ânions, onde o DNA, um ânion forte, se liga à coluna carregada negativamente por meio de uma ponte salina catiônica. Outros materiais do lisado, como proteínas, são lavados através da coluna com tampões de alto teor de sal. Finalmente, o plasmídeo purificado é liberado da coluna quando um tampão com baixo teor de sal é adicionado, interrompendo a ponte salina.

Para este procedimento, deve-se usar jaleco, luvas descartáveis e óculos de proteção.

As culturas bacterianas, que são transformadas com o DNA plasmídico desejado, devem ser cultivadas durante a noite em meio de crescimento com antibiótico apropriado em um 37? C agitando incubadora.

No dia seguinte, a cultura da bactéria é peletizada por centrifugação e o sobrenadante é removido. O grânulo restante é ressuspenso em tampão de lise.

Uma vez ressuspensas, as bactérias podem ser transferidas para um tubo menor onde o tampão de lise é adicionado. O tampão de lise tem um pH alto e contém detergentes, como o dodecil sulfato de sódio, que rompem as membranas bacterianas, lisando assim as bactérias. A solução ficará turva com a adição do tampão de lise e, após a mistura, a solução ficará mais clara. A mistura não deve ser transformada em vórtice devido à possibilidade de cisalhamento ou quebra do DNA genômico, o que poderia contaminar a purificação do DNA do plasmídeo.

Em seguida, o tampão de neutralização é adicionado para neutralizar as condições alcalinas e diminuir o pH. Com uma mistura suave, o DNA genômico, bem como quaisquer proteínas ligadas a ele, precipitarão, enquanto o DNA do plasmídeo permanecerá em solução. Mais uma vez, evite o vórtice, para que seus plasmídeos estejam livres de contaminação do DNA genômico.

A mistura é então centrifugada e o precipitado genômico de DNA/proteína é peletizado. O sobrenadante contém o DNA do plasmídeo, bem como proteínas solúveis.

Este sobrenadante é colocado na coluna por decantação, um nome chique para despejá-lo, ou pipetagem. O pellet pode ser descartado.

Em seguida, o tampão de lavagem com alto teor de sal passa pela coluna enquanto o DNA permanece ligado à sílica. Etapas de lavagem repetidas com tampão de alto teor de sal removem endonucleases, RNA, proteínas, corantes e impurezas de baixo peso molecular. O fluxo das etapas de lavagem deve ser descartado. Após a etapa final de lavagem, certifique-se de que o filtro esteja completamente seco, sem nenhum tampão restante. O DNA do plasmídeo ainda está localizado no filtro.

O DNA do plasmídeo é eluído com água estéril ou um tampão de eluição. O DNA está prontamente disponível para uso imediato em uma ampla gama de aplicações.

Existem várias maneiras de verificar a pureza dos plasmídeos após a purificação. Um espectrômetro pode ser usado para comparar a absorbância em diferentes comprimentos de onda para determinar a concentração de DNA do plasmídeo. Uma análise em gel de agarose do plasmídeo purificado pode determinar se o plasmídeo tem o tamanho correto e se não há contaminantes. Esta etapa garante que não haja contaminação do DNA genômico e que o plasmídeo não foi modificado em bactérias.

O procedimento de purificação do plasmídeo pode ser modificado para acomodar diferentes tamanhos de plasmídeo, número de cópias, volume de cultura e pode incluir diferentes equipamentos para as etapas de ligação, lavagem e eluição. O rendimento é uma das distinções mais proeminentes entre as preparações de plasmídeo e elas são frequentemente divididas em minipreparação, ou minipreparação, midiprep, maxiprep e megapreparação, dependendo do rendimento desejado.

Em termos de aplicações a jusante, um procedimento que comumente segue a purificação do plasmídeo é a transfecção, que envolve a introdução de DNA de plasmídeo em células eucarióticas. Muitas vezes, o objetivo de um experimento de transfecção é visualizar a estrutura de células e tecidos com proteínas repórteres, como as que rotulam os neurônios nas imagens que você vê aqui.

Às vezes, vários plasmídeos purificados por várias preparações de purificação podem ser introduzidos na mesma bactéria, reproduzindo assim toda uma via biossintética através da produção de várias enzimas codificadas pelos plasmídeos. O resultado final é a fabricação de um composto complexo, como o antibiótico que você vê aqui, pela célula.

Plasmídeos purificados podem ser reintroduzidos em bactérias, a fim de gerar grandes quantidades de proteínas codificadas pelo plasmídeo. Aqui você vê células bacterianas sendo homogeneizadas e lisadas antes que uma técnica chamada purificação de afinidade possa ser realizada para isolar a proteína alvo. A proteína purificada é cristalizada e sua estrutura então identificada.

Você acabou de assistir a introdução de JoVE à purificação de plasmídeos. Neste vídeo, discutimos os princípios básicos por trás desse método, sua descrição passo a passo e um punhado de aplicações de sua preparação de plasmídeo. Como sempre, obrigado por assistir!