Biorreator Picoliter Microfluídico para Análise Microbiana de Célula Única: Fabricação, Configuração do Sistema e Operação

O objetivo geral deste procedimento é analisar bactérias únicas e microcolônias isogênicas em evolução com resolução espacial e temporal total sob condições ambientais constantes usando um dispositivo de cultivo microfluídico. Isso é feito projetando primeiro um sistema de cultivo microfluídico usando software CAD. Em seguida, dispositivos de cultivo microfluídico descartáveis são fabricados a partir de polidimetilsiloxano, que contêm biorreatores picolitro, de um mícron e altura para restringir as bactérias ao crescimento de monocamadas.

A cultura microbiana é então infundida no dispositivo microfluídico para inocular células-mãe únicas dentro dos biorreatores. Essas células são expandidas por infusão contínua de meio de crescimento através do sistema. Os resultados são obtidos a partir de microscopia de lapso de tempo automatizada mostrando o cultivo de uma cepa industrialmente relevante de Corynebacterium glutamicum, dados de crescimento e heterogeneidade célula-célula.

Na biotecnologia convencional, a maioria das análises é baseada em dados médios. Nosso dispositivo microfluídico facilita a análise de célula única de bactérias individuais com resolução espacial e temporal. É uma ferramenta útil para examinar de perto a heterogeneidade célula a célula de microcolônias isogênicas.

Aplicamos fotolitografia SU-8 comum e moldagem de chip de polidimetilsiloxano para fabricar dispositivos microfluídicos de uso único com resolução de mídia submicro. Demonstramos com sucesso nossa tecnologia com vários microrganismos biotecnológicos, como Escherichia coli e Corynebacterium glutamicum. Para começar, projete o dispositivo microfluídico usando um software CAD.

O projeto apresentado neste protocolo consiste em duas entradas de semeadura, um gerador de gradiente para mistura de dois substratos diferentes, uma saída e seis matrizes compostas por cinco biorreatores cada. Em uma sala limpa, prepare um wafer de silício de quatro polegadas e gire o código de um mícron de fotorresistente SU-8 2000.5 no wafer, conforme descrito no protocolo de texto que acompanha. Coloque o wafer revestido em uma placa quente a 95 graus Celsius para remover o excesso de solvente e, em seguida, insira a máscara fotográfica da primeira camada consistindo nas regiões de retenção dos reatores do picolitros e o wafer revestido dentro do alinhador da máscara.

Em seguida, exponha o wafer no modo de contato a vácuo a uma luz de 350 a 400 nanômetros por três segundos a uma intensidade de sete miliwatts por centímetro quadrado. Execute um cozimento pós-exposição em uma placa quente nivelada a 95 graus Celsius para iniciar a polimerização do SU-8. Em seguida, coloque o wafer em um banho de revelador SU-8 por um minuto e, em seguida, transfira o wafer para um segundo recipiente com revelador SU-8 fresco por alguns segundos.

Enxágue o wafer em isopropanol para remover o revelador SU-8 e secar o wafer usando fluxo de nitrogênio ou um girador de wafer. Em seguida, asse bem o wafer por 10 minutos a 150 graus Celsius. Em seguida, fabrique a segunda camada conforme descrito no protocolo de texto que acompanha para completar o molde mestre.

Comece a fabricação do chip PDMS misturando a base e o agente transportador em uma proporção de 10 para um. Desgaseifique a mistura PDMS por aproximadamente 30 minutos dentro de um dessecador a vácuo até que todas as bolhas tenham desaparecido. Em seguida, coloque o wafer SU-8 em um dispositivo de moldagem e despeje uma camada de três milímetros de mistura PDMS no wafer.

Em seguida, asse o PDMS por três horas a 80 graus Celsius em um forno. Depois de resfriado, retire cuidadosamente a placa PDMS do wafer e corte a placa em lascas únicas usando um bisturi limpo e afiado. Lave as batatas fritas em um banho de n-pentano por 90 minutos, seguido de dois banhos de acetona por 90 minutos cada.

Seque os cavacos durante a noite para remover qualquer resíduo de solvente. Pouco antes do experimento, perfure os orifícios de entrada e saída no chip PDMS usando uma agulha ou perfurador com um diâmetro ligeiramente menor do que os conectores usados para conectar a tubulação ao chip PDMS. Em seguida, limpe cuidadosamente o chip PDMS microfluídico com isopropanol e use fita adesiva para remover quaisquer partículas de poeira grudadas.

Além disso, limpe uma lâmina de vidro fina de 170 mícrons primeiro com acetona, depois isopropanol, seguido de água deionizada e seque a lâmina com um jato de nitrogênio. Depois de limpo e seco, o plasma oxida a lâmina de vidro e o chip PDMS por 25 segundos usando uma potência de 50 Watts e uma taxa de fluxo de oxigênio de 20 sccm. Em seguida, alinhe cuidadosamente o PDMS e o chip de vidro antes de colocar o PDMS no vidro, o que fará com que ele se cole em segundos.

Prenda a ligação assando a configuração por 10 segundos a 80 graus Celsius. Para preparar as bactérias para um experimento com chips, inocule uma única colônia de uma cepa bacteriana desejada, como C. glutamicum, em 20 mililitros de meio BHI fresco, e incube a cultura durante a noite a 30 graus Celsius em um agitador rotativo a 120 RPMs. Na manhã seguinte, transfira 10 microlitros da cultura inicial para uma segunda cultura contendo 20 mililitros do meio desejado e deixe as células crescerem durante a noite nas mesmas condições.

No dia seguinte, pré-aqueça a incubadora de um microscópio invertido a 30 graus Celsius. Isso pode levar até duas horas, dependendo da configuração individual. Enquanto a configuração estiver aquecendo, abra a incubadora e selecione a objetiva desejada e prepare-a com qualquer meio de montagem necessário.

Em seguida, monte o chip dentro do porta-chip e prenda-o no lugar. Centralize a amostra no microscópio e concentre-se nas matrizes de biorreatores picolitros. Com o chip em foco, conecte as entradas e saídas com a tubulação apropriada e, em seguida, coloque a tubulação de saída em um reservatório de resíduos.

Em seguida, encha uma seringa com meio fresco, coloque-a em uma bomba de seringa e enxágue os canais microfluídicos por uma hora a uma taxa de fluxo de 200 nanolitros por minuto para preparar o chip. Enquanto as células ainda estão na fase inicial de crescimento exponencial, transfira um mililitro da cultura bacteriana para uma seringa estéril e substitua a seringa e o tubo contendo o meio pela suspensão celular e tubo fresco. Infundir a suspensão celular nos canais a uma taxa de fluxo volumétrico de 200 nanolitros por minuto até que a maioria dos biorreatores picolitros esteja cheia.

Se apenas um pequeno número de biorreatores for preenchido, aumente a vazão para 800 a 1200 nanolitros por minuto. Quando a quantidade desejada de células tiver sido semeada, desconecte a suspensão celular, reconecte o meio de crescimento ao chip e perfunda com meio novo a 100 nanolitros por minuto. Em seguida, escaneie o chip e selecione biorreatores específicos para imagens de lapso de tempo.

Em seguida, configure uma sequência de microscopia de lapso de tempo para obter imagens dos biorreatores do início ao fim e iniciar o experimento. Quando todos os biorreatores do picolitro estiverem crescidos demais, pare o experimento e descarte os chips adequadamente. Para iniciar a análise, primeiro determine quais biorreatores atendem a todos os critérios desejados para o experimento, como número e posição das células-mãe.

Usando um programa de análise, como a imagem J, determine a taxa de crescimento de cada microcolônia contando o número de células em cada ponto de tempo. Calcule a taxa máxima de crescimento plotando o tempo versus o log do número da célula. O sistema aqui apresentado pode ser aplicado para estudar várias espécies bacterianas em relação a diferentes parâmetros biológicos, como crescimento, morfologia ou sinal fluorescente.

Neste exemplo, C. glutamicum foi cultivado em condições padrão de cultivo e as curvas de crescimento resultantes derivadas de três microcolônias isogênicas são mostradas aqui. Os biorreatores picolitros também se mostraram úteis no acesso à produção de proteínas por meio do uso de microscopia de fluorescência de lapso de tempo, conforme mostrado aqui. Ao expor as células a uma baixa concentração do indutor de proteína IPTG, as variações célula a célula da proteína podem ser estudadas no nível de célula única dentro de colônias a partir de uma única célula-mãe.

A técnica demonstrada pode ser aplicada para monitorar e analisar células bacterianas individuais com perfeito controle ambiental. Isso dificilmente é possível usando sistemas convencionais de cultivo em escala de bancada. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar chips de cultivo microfluídico para realizar análises comparáveis de células únicas.