Biorreator Picoliter Microfluídico para Análise Microbiana de Célula Única: Fabricação, Configuração do Sistema e Operação

O objetivo geral deste procedimento é analisar bactérias individuais e microcolônias isogênicas em evolução com resolução espacial e temporal completa sob condições ambientais constantes, utilizando um dispositivo de cultivo microfluídico. Isso é realizado primeiramente projetando um sistema de cultivo microfluídico com software CAD. Em seguida, dispositivos descartáveis de cultivo microfluídico são fabricados em polidimetilsiloxano e contêm biorreatores de picolitros, com um mícron de altura, para restringir o crescimento bacteriano a uma camada única.

A cultura microbiana é então infundida no dispositivo microfluídico para inocular células-mãe individuais dentro dos biorreatores. Essas células são expandidas por meio da infusão contínua de meio de crescimento através do sistema. Os resultados são obtidos por microscopia automatizada com lapso de tempo, mostrando o cultivo de uma linhagem de Corynebacterium glutamicum relevante para a indústria, dados de crescimento e heterogeneidade entre células.

Na biotecnologia convencional, a maioria das análises baseia-se em dados médios. Nosso dispositivo de microfluídica facilita a análise de células individuais de bactérias com resolução espacial e temporal. É uma ferramenta útil para observar de perto a heterogeneidade entre células em microcolônias isogênicas.

Aplicamos litografia fotográfica com SU-8 comum e moldagem de chip de polidimetilsiloxano para fabricar dispositivos microfluídicos descartáveis com resolução de meio submicrométrico. Demonstramos com sucesso nossa tecnologia com diversos microrganismos biotecnológicos, como Escherichia coli e Corynebacterium glutamicum. Para começar, projete o dispositivo microfluídico utilizando software CAD.

O design apresentado neste protocolo consiste em duas entradas para semeadura, um gerador de gradiente para misturar dois substratos diferentes, uma saída e seis matrizes compostas por cinco biorreatores cada. Em uma sala limpa, prepare uma pastilha de silício de quatro polegadas e aplique por centrifugação uma camada de um mícron de fotoresina SU-8 2000.5 sobre a pastilha, conforme descrito no protocolo textual complementar. Coloque a pastilha revestida sobre uma placa aquecedora a 95 graus Celsius para remover o solvente em excesso e, em seguida, insira a primeira máscara fotolitográfica, composta pelas regiões de aprisionamento dos reatores de picolitro, e a pastilha revestida dentro do alinhador de máscaras.

Em seguida, exponha a pastilha em modo de contato a vácuo à luz de 350 a 400 nanômetros por três segundos com uma intensidade de sete miliwatts por centímetro quadrado. Realize uma etapa de pré-cura em uma placa quente nivelada a 95 graus Celsius para iniciar a polimerização do SU-8. Em seguida, coloque a pastilha em um banho de revelador SU-8 por um minuto e, depois, transfira a pastilha para um segundo recipiente com revelador SU-8 fresco por alguns segundos.

Lave a pastilha em isopropanol para remover o revelador SU-8 e seque a pastilha usando fluxo de nitrogênio ou uma centrífuga para pastilhas. Em seguida, faça a cura térmica da pastilha por 10 minutos a 150 graus Celsius. Depois, fabrique a segunda camada conforme descrito no protocolo de texto acompanhante para completar o molde mestre.

Inicie a fabricação do chip de PDMS misturando a base e o agente transportador em uma proporção de 10 para 1. Dessature o conjunto de PDMS por aproximadamente 30 minutos dentro de um dessecador a vácuo até que todas as bolhas tenham desaparecido. Em seguida, coloque a wafer de SU-8 em um dispositivo de moldagem e despeje uma camada de três milímetros da mistura de PDMS sobre a wafer.

Em seguida, aqueça o PDMS por três horas a 80 graus Celsius em uma estufa. Após esfriar, retire cuidadosamente a placa de PDMS do wafer e corte-a em pastilhas individuais utilizando um bisturi limpo e afiado. Lave as pastilhas em um banho de n-pentano por 90 minutos, seguido de dois banhos de lavagem com acetona por 90 minutos cada.

Seque as pastilhas durante a noite para remover qualquer resíduo de solvente. Imediatamente antes do experimento, perfure os orifícios de entrada e saída na pastilha de PDMS utilizando uma agulha ou furador com diâmetro ligeiramente menor que o dos conectores usados para ligar os tubos à pastilha de PDMS. Em seguida, limpe cuidadosamente a pastilha microfluídica de PDMS com isopropanol e use fita adesiva para remover quaisquer partículas de poeira aderidas.

Além disso, limpe um lâmina de vidro com espessura de 170 mícrons primeiro com acetona, depois com isopropanol, seguido por água desionizada e seque a lâmina com um fluxo de nitrogênio. Uma vez limpa e seca, oxide por plasma a lâmina de vidro e o chip de PDMS por 25 segundos usando uma potência de 50 Watts e uma taxa de fluxo de oxigênio de 20 sccm. Em seguida, alinhe cuidadosamente o PDMS e o chip de vidro antes de colocar o PDMS sobre o vidro, o que fará com que eles se liguem em segundos.

Fixe a ligação assando o conjunto por 10 segundos a 80 graus Celsius. Para preparar as bactérias para um experimento em chip, inocular uma única colônia de uma linhagem bacteriana desejada, como C.glutamicum, em 20 mililitros de meio BHI fresco e incubar o cultivo durante a noite a 30 graus Celsius em agitador rotativo a 120 RPM. Na manhã seguinte, transfira 10 microlitros do cultivo inicial para um segundo cultivo contendo 20 mililitros do meio desejado e deixe as células crescerem durante a noite nas mesmas condições.

No dia seguinte, aqueça previamente o incubador de um microscópio invertido a 30 graus Celsius. Isso pode levar até duas horas, dependendo da configuração individual. Enquanto a configuração está aquecendo, abra o incubador e selecione a objetiva desejada, preparando-a com qualquer meio de montagem necessário.

Em seguida, monte o chip dentro do suporte e fixe-o firmemente. Centralize a amostra no microscópio e foque nos arranjos de biorreatores de picolitros. Com o chip em foco, conecte as entradas e saídas com tubos apropriados e, então, coloque os tubos de saída em um reservatório de resíduos.

Em seguida, encha uma seringa com meio fresco, coloque-a em uma bomba de seringa e lave os canais microfluídicos durante uma hora a uma taxa de fluxo de 200 nanolitros por minuto para escorificar o chip. Enquanto as células ainda estiverem na fase inicial de crescimento exponencial, transfira um mililitro da cultura bacteriana para uma seringa estéril e substitua a seringa e a tubulação contendo o meio pela suspensão celular e por tubulação nova. Infunda a suspensão celular nos canais a uma taxa de fluxo volumétrico de 200 nanolitros por minuto até que a maioria dos biorreatores de picolitro esteja preenchida.

Se apenas um pequeno número de biorreatores for preenchido, aumente a taxa de fluxo para 800 a 1200 nanolitros por minuto. Quando a quantidade desejada de células tiver sido semada, desconecte a suspensão celular, reconecte o meio de crescimento ao chip e perfuse com meio fresco a 100 nanolitros por minuto. Em seguida, escaneie o chip e selecione biorreatores específicos para imageamento em lapso de tempo.

Em seguida, configure uma sequência de microscopia com lapso de tempo para imaginar os biorreatores do início ao fim e iniciar o experimento. Assim que todos os biorreatores de picolitro estiverem supercrescidos, interrompa o experimento e descarte as lâminas adequadamente. Para iniciar a análise, primeiramente, determine quais biorreatores atendem a todos os critérios desejados para o experimento, como número e posição das células-mãe.

Utilizando um programa de análise, como o ImageJ, determine a taxa de crescimento de cada microcolônia contando o número de células em cada ponto temporal. Calcule a taxa máxima de crescimento traçando o tempo versus o logaritmo do número de células. O sistema aqui apresentado pode ser aplicado para estudar diversas espécies bacterianas em relação a diferentes parâmetros biológicos, como crescimento, morfologia ou um sinal fluorescente.

Neste exemplo, C.glutamicum foi cultivado sob condições padrão de cultivo e as curvas de crescimento resultantes derivadas de três microcolônias isogênicas são mostradas aqui. Os biorreatores de picolitro também se mostraram úteis para acessar a produção de proteínas por meio da microscopia de fluorescência com lapso de tempo, conforme mostrado aqui. Expondo as células a uma baixa concentração do indutor proteico IPTG, as variações de célula para célula da proteína podem ser estudadas ao nível de célula única dentro de colônias originadas de uma única célula mãe.

A técnica demonstrada pode ser aplicada para monitorar e analisar células bacterianas individuais com controle ambiental perfeito. Isso dificilmente é possível utilizando sistemas convencionais de cultivo em escala laboratorial. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar chips de cultivo microfluídicos para realizar análises comparáveis de célula única.