Geração de uma nova vacina de células dendríticas usando melanoma e células-tronco de câncer escântico

O objetivo geral deste procedimento é avaliar a imunidade anti-tumoral de uma célula-tronco cancerígena ou vacina de células dendríticas (DC) baseada em CSCs em um hospedeiro imunocompetente. Isso é realizado primeiramente isolando CSCs alor positivas com alta atividade de aldeído desidrogenase ou ALDH alta a partir de células tumorais heterogêneas. Na segunda etapa, as DCs derivadas de CSCs são isoladas e então estimuladas com lisado para a produção da vacina.

Em seguida, o lisado de CSC que estimula a DC ou a vacina DC TP é administrado a hospedeiros imunocompetentes normais e singênicos. Então, na etapa final, avalia-se a eficácia antitumoral protetora da vacina C-S-C-T-P-D-C. Por fim, pode-se realizar ELISA para avaliar a imunidade anti-CSC induzida pela vacina C-S-C-T-P-D-C por linfócitos T e anticorpos do hospedeiro.

Este projeto reúne duas das áreas mais promissoras da pesquisa em câncer: a área das células-tronco do câncer e a área da imunoterapia tumoral. Nosso laboratório foi um dos primeiros a descobrir as células-tronco do câncer em tumores sólidos. Essas são as sementes do câncer que impulsionam seu crescimento e também a metástase.

O que você verá hoje é uma nova abordagem utilizando imunoterapia para direcionar especificamente essas células-tronco cancerígenas. Utilizamos um marcador específico chamado aldeído desidrogenase, que pode ser detectado pelo ensaio Alde fluoro. Você verá os doutores Lin Liu e Huon Tau trabalhando junto com o Dr. Chow Lee.

Esperamos que, ao direcionar essas células-tronco tumorais, possamos melhorar o prognóstico para pacientes com diversos tipos de câncer. Comece suspendendo as células tumorais de interesse em tampão de ensaio alor na concentração de um vezes 10 à sexta células por mililitro. Em seguida, transfira todo o volume exceto três mililitros das células tumorais para cada um dos tubos de amostra e rotule quatro tubos de ensaio de poliestireno de 12 por 75 milímetros como segue: não corado alor, ALOR mais DEAB e sete A A D. Distribua um mililitro da suspensão celular nos tubos não corado e sete A A D e dois mililitros no tubo alde forro.

Em seguida, adicione cinco microlitros de DEAB ao tubo de ALOR mais DEAB. Coloque os tubos no gelo e então misture 10 microlitros de substrato alor ativado ao tubo de alor. Transfira imediatamente um mililitro da solução de substrato para o tubo de ALOR mais DEAB e, em seguida, adicione dois microlitros de substrato alor ativado por 1 milhão de células a cada um dos tubos de amostra.

Incube todos os tubos em banho-maria a 37 graus Celsius por 30 minutos e, em seguida, adicione cinco microlitros de sete a a d ao tubo de sete A a D e um microlitro de sete A a d por 1 milhão de células a cada tubo de amostra. Mantenha esses tubos a quatro graus Celsius por 10 minutos. Centrifugue todos os tubos por cinco minutos a 250 vezes G à temperatura ambiente e ressuspenda os pellets em tampão do ensaio Alde Fluor para triagem celular ativada por fluorescência.

Para definir os limites de separação, utilize as células Aldefluor mais DEAB como controle negativo e as células coradas com sete A a D como controle de viabilidade. Com base nesses controles, estabeleça um limite para distinguir as células positivas para Alor A LDH, D elevado cinco e SCC sete. Em seguida, utilize este critério para separar as células da amostra em populações positivas para Alor A LDH, D elevado cinco e SCC sete.

Para gerar as células dendríticas, primeiro isole os ossos fêmur e tíbia de um camundongo C57 black six e de um camundongo C3H. Esterilize os ossos em etanol 75% por um minuto à temperatura ambiente e, em seguida, lave-os em HBSS. Em seguida, corte as extremidades dos ossos e use uma seringa de 10 mililitros equipada com uma agulha de 21 gauge para lavar a medula óssea para dentro de uma placa de Petri, aspire e libere as células algumas vezes para criar uma suspensão simples de células e depois centrifugue as células.

Incube o pellet em cinco mililitros de tampão de lise de glóbulos vermelhos durante um minuto em banho-maria a 37 graus Celsius. Após a contagem das células, ajuste o volume para um vezes 10 à sexta células por mililitro em meio de cultura suplementado com G-M-C-S-F e IL quatro. Em seguida, cultive as células a 37 graus Celsius e 5%CO2, renovando o meio e as citocinas após três dias.

No quinto dia, colete as células dendríticas imaturas. Após centrifugar as células, re-suspenda os pellets em cinco mililitros de meio de cultura e, então, sobreponha lentamente a suspensão celular sobre o meio de isolamento recém-preparado. Após nova centrifugação, colete as DCs entre as camadas do meio de cultura e do meio de isolamento.

Em seguida, após a contagem das células, ajuste o volume para uma concentração de um vezes 10 elevado a seis células por mililitro no meio de cultura, suplementado com G-M-C-S-F e IL-4. Agora, crie os lisados tumorais submetendo as células classificadas a quatro ciclos de congelamento-descongelamento rápido, seguidos por centrifugação para coletar a fração de membrana dos lisados. Em seguida, pulse as DCs com o lisado das células autólogas A LDH alta classificadas. Para preparar as CSC TPCs.

Para preparar o pulso H-T-P-D-C, utilize os DCs com o lisado de células tumorais heterogêneas não classificadas para vacinar os animais receptores experimentais por injeção subcutânea de uma vez 10 à sexta potência das células pulsadas, suspensas em 100 microlitros de PBS, na região esquerda de cada camundongo. Após a vacinação, administre por via intravenosa uma vez 10 à quinta potência de células tumorais D5 heterogêneas em 100 microlitros de PBS para desafiar os camundongos receptores C57 Black Six. Para o modelo SCC7, desafie os camundongos receptores C3H subcutaneamente com uma vez 10 à sexta potência de células tumorais SCC7 não classificadas em 100 microlitros de PBS no lado oposto da vacina com DCs.

Crie uma suspensão de células únicas a partir dos baços dos camundongos receptores C3 H. Em seguida, ative as células T e B esplênicas com anticorpos monoclonais anti-CD3 e anti-CD28 imobilizados em meio de cultura suplementado com o estímulo apropriado. Após quatro dias, colete os sobrenadantes e, então, recubra placas de ELIZA com anticorpos contra interferon gama, G-M-C-S-F ou IgG a quatro graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, bloqueie a ligação não específica, adicione os padrões e os sobrenadantes recém-coletados e, em seguida, incube as placas à temperatura ambiente. Após lavagem, adicione o anticorpo de detecção conjugado à HRP por uma hora e, então, adicione o substrato TMB.

Finalmente, meça a absorbância em um leitor de placas ELISA a 450 nanômetros dentro de 30 minutos após interromper a reação. O alor tem sido usado como marcador para isolar células-tronco em múltiplas neoplasias, incluindo as duas populações enriquecidas em células-tronco cancerígenas, D cinco e SCC sete, especificamente conforme demonstrado nestes gráficos de dispersão; as células positivas para alor contribuem aproximadamente com 0,5% e 5,2% das linhagens celulares tumorais cultivadas D cinco e SCC sete, respectivamente. Determinou-se também que células tumorais recém-colhidas contêm 2,5% e 4,2% das células positivas para alor provenientes de tumores D cinco e SCC sete estabelecidos in vivo, respectivamente.

Células tumorais tratadas com o inibidor específico D-E-A-B-A da A-LDH foram utilizadas como controle negativo. A imunogenicidade das células-tronco cancerígenas foi avaliada mediante a análise da imunidade anti-tumoral protetora induzida pelos CSC TPCs, utilizando o modelo de vacinação recém-demonstrado. Conforme mostrado nesta tabela, os camundongos tratados com os H TPCs desenvolveram menos metástases pulmonares do que os camundongos tratados apenas com PBS.

Importante, os camundongos tratados com PCs de CSC-T tiveram ainda menos metástases pulmonares do que os animais tratados com H-T-P-D-C ou PBS isoladamente. No modelo SCC sete, camundongos C3H normais foram vacinados conforme demonstrado acima, em comparação com o grupo controle. Os TPCs de H induziram imunidade anti-tumoral moderada, enquanto os TPCs de CSC induziram inibição significativa do crescimento tumoral. Esses resultados indicam que as CSCs podem ser utilizadas como fonte de antígenos mais eficaz para o carregamento de DCs do que células tumorais tradicionais não ordenadas, para induzir imunidade protetora contra o desafio com células tumorais.

Para compreender melhor os mecanismos subjacentes à imunidade anti-tumoral protetora induzida pelas CSCs observada, os cítos de animais vacinados com DC foram ativados e sua produção de citocinas foi medida por EISA; como acabou de ser demonstrado, houve produção significativamente maior de citocinas pelos cítos obtidos de animais vacinados com D cinco TPCs de CSCs ou S CCC sete PCs de CSCs, em comparação com aqueles obtidos de animais vacinados com D cinco TPCs de HTCs ou SCC sete HTCs. Hoje você viu como utilizar o ensaio Alor para isolar células-tronco cancerígenas.

Essas células-tronco cancerígenas podem então ser utilizadas para desenvolver imunoterapias que utilizam células dendríticas. É nossa esperança que essas imunoterapias, usadas isoladamente ou em combinação com terapias existentes, melhorem o prognóstico para pacientes com diversos tipos de câncer.