Name: Geração de uma nova vacina de células dendríticas usando melanoma e células-tronco de câncer escântico (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 43 s
Description: Aprenda a gerar uma vacina de células dendríticas baseada em células-tronco de câncer para imunoterapia antitumoral. Este método demonstra eficácia superior em induzir resposta imune protetora.

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Este trabalho foi apoiado pelo Will e Jeanne Caldwell Doowed Research Fund do Centro de Câncer Integral da Universidade de Michigan e, em parte, pela nih grant CA82529 e pela Gillson Longenbaugh Foundation.

1. Coloração ALDEFLUOR
<ol><li>Preparação de amostras celulares: Preparar suspensão celular única de células tumorais, seja de células tumorais cultivadas ou de amostras de tumores recém-colhidas. Conte as células e ajuste a suspensão celular a uma concentração de 1 x 106 células/ml no tampão de ensaio ALDEFLUOR.</li>
	<li>Rotular quatro tubos de teste de poliestireno de 12 mm x 75 mm como tubos de controle da seguinte forma: #1: Não manchado, #2: ALDEFLUOR, #3: ALDEFLUOR mais DEAB, e #4: 7AAD.</li>
	<li>Para estes tubos de controle, coloque a suspensão celular de 1ml em #1 e #4, mas 2 ml em tubos #2. Adicione 5 μl DEAB (inibidor de ALDH) no tubo #3 e mantenha no gelo. Em seguida, adicione 10 μl ativado substrato ALDEFLUOR ao tubo #2, misture e transfira imediatamente 1 ml da mistura para #3 do tubo.</li>
	<li>Ao mesmo tempo, adicione 2 μl ativado substrato ALDEFLUOR por milhão de células ao resto das células (tubos de amostra) também em 1 x 106 células/ml no Tampão de Ensaio ALDEFLUOR.</li>
	<li>Incubar tanto os 4 tubos de controle quanto os tubos de amostra por 30 minutos em banho-maria de 37 °C.</li>
	<li>Após a incubação, adicione 5 μl 7AAD no tubo de controle #4 e 1 μl 7AAD 1 x 106 células ao tubo de amostra. Incubar 10 min a 4 °C.</li>
	<li>Centrifugar todos os tubos por 5 min a 250 x g e remover supernaspe.</li>
	<li>Células resuspend em ALDEFLUOR Assay Buffer.</li>
	<li>Realize a classificação baseada em citometria de fluxo.</li>
	<li>Defina os portões de triagem usando células manchadas de ALDEFLUOR tratadas com DEAB como controle negativo e as células manchadas de propidium (PI) 7AAD para controle de viabilidade. Com base nesses controles, foi estabelecido um portão para distinguir as células ALDEFLUOR+/ALDHalta,D5 e SCC7. Esses portões serão então usados para classificar todas as células amostrais preparadas acima para as células ALDEFLUOR+/ALDHhigh D5 e SCC7.</li>
</ol>2. Preparação da vacina célula dendrítica de células-tronco-tronco do câncer (CSC-TPDC)
<ol><li>Eutanize camundongos (síngênicos B6 e C3H, respectivamente) usando CO2 e isolam ossos de fêmur e tíbia.</li>
	<li>Coloque os ossos em 75% de etanol por 1 min a temperatura ambiente. Em seguida, lave os ossos usando HBSS.</li>
	<li>Corte a cabeça dos ossos e use uma agulha de 21 G e uma seringa de 10 ml para empurrar as células em um prato.</li>
	<li>Aspire e assopre as células usando a seringa para fazer a suspensão de célula única.</li>
	<li>Após centrifugação em 1.500 rpm por 5 min, descarte o supernasce. Em seguida, adicione 5 ml de tampão de lise RBC à lise do RBC por 1 min em banho de água de 37 °C.</li>
	<li>Conte o número da célula e ajuste a suspensão celular para uma concentração de 1 milhão de células/ml em meio completo (CM) contendo 10 ng/ml GM-CSF e 10 ng/ml IL-4.</li>
	<li>Cultume as células e compense CM mais IL-4 e GM-CSF 3 dias depois.</li>
	<li>No5º dia, colhe as células dendríticas imaturas (DCs) e prepare o meio de isolamento DC contendo 4,2 ml de solução C mais 1 ml de gradiente de densidade OptiPrep.</li>
	<li>Suspenda as pelotas de célula em 5 ml CM. Adicione a suspensão da célula ao meio de isolamento lentamente. Centrífuga a 2.000 rpm à temperatura ambiente.</li>
	<li>Colete os DCs entre o CM e o meio de isolamento. Conte o número celular e ajuste a suspensão celular para uma concentração de 1 milhão de células/ml em meio de cultura contendo 10 ng/ml GM-CSF e 10 ng/ml IL-4.</li>
	<li>Prepare as células de tumores suspendendo as células D5 ou SCC7altas ou não sortidas de ALDH em meio de cultura e sujeitas a rápidas exposições de congelamento quatro vezes seguidas de giro em ∼100 x g por 5 min para coletar a porção de membrana dos lises.</li>
	<li>Para preparar csc-tpdc, pulso DCs com o lysate de célulasaltas ALDH autólogas. Para preparar h-TPDC, pulso DCs com linsato heterogêneo de células tumorais não variadas. A razão entre DC e células tumorais é a mesma.</li>
</ol>3. Vacinação e Avaliação da Eficácia
<ol><li>Vacinar camundongos B6 normais, respectivamente, com 2.500 células tumorais D5 CSC-TPDC ou D5 H-TPDC subcutânea(s.c). Vacinar animais C3H normais.c. com 5.000 células tumorais CSC-TPDC ou SCC7 H-TPDC, respectivamente.</li>
	<li>Após a vacinação, desafie os camundongos B6 com as células tumorais heterogêneas D5 i.v. Eutanize os camundongos usando CO2 20 dias depois. Colher os pulmões e enumerar metástases pulmonares.</li>
	<li>No modelo SCC7, desafie os camundongos C3H com células tumorais SCC7 não sortidas.c do lado oposto da vacina DC. Monitore o tamanho do tumor.</li>
	<li>No final dos experimentos eutanize os camundongos B6 e C3H usando CO2. No dia 34 após a primeira vacina, eutanize camundongos com CO2, e ao mesmo tempo colete os baços de cada grupo com um procedimento asséptico.</li>
	<li>Ative o baço células T e/ou B com anti-CD3 imobilizado mais anti-CD28 mAbs em CM contendo hrIL-2 ou LPS mais mAb anti-CD40 (FGK45).</li>
	<li>Após a ativação, colete supernacantes e use para ensaio ELISA.</li>
	<li>Para ensaio ELISA, cubra placas com anticorpos para IFNγ, GM-CSF e IgG a 4 °C O/N.</li>
	<li>Após a aplicação do buffer de bloqueio, adicione amostras e padrões e incubar à temperatura ambiente.</li>
	<li>Lave a placa e adicione anticorpo de detecção HRP e substrato TMB para incubação.</li>
	<li>Meça a absorvância em um leitor de placa ELISA em 450 nm dentro de 30 minutos após parar a reação.</li>
</ol>

<ol><li>Shafee, N., Smith, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+contribute+to+cisplatin+resistance+in+Brca1%2Fp53-mediated+mouse+mammary+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells contribute to cisplatin resistance in Brca1/p53-mediated mouse mammary tumors.</a> Cancer Res. 68, 3243-3250 (2008).</li>
<li>Nandi, S., Ulasov, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-dose+radiation+enhances+survivin-mediated+virotherapy+against+malignant+glioma+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Low-dose radiation enhances survivin-mediated virotherapy against malignant glioma stem cells.</a> Cancer Res. 68, 5778-5784 (2008).</li>
<li>Dallas, N. A., Xia, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoresistant+colorectal+cancer+cells%2C+the+cancer+stem+cell+phenotype%2C+and+increased+sensitivity+to+insulin-like+growth+factor-I+receptor+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Chemoresistant colorectal cancer cells, the cancer stem cell phenotype, and increased sensitivity to insulin-like growth factor-I receptor inhibition.</a> Cancer Res. 69, 1951-1957 (2009).</li>
<li>Yamauchi, K., Yang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+cancer+metastasis+by+cyclophosphamide+pretreatment+of+host+mice%3A+an+opposite+effect+of+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Induction of cancer metastasis by cyclophosphamide pretreatment of host mice: an opposite effect of chemotherapy.</a> Cancer Res. 68, 516-520 (2008).</li>
<li>Chang, A. E., Redman, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phase+I+trial+of+tumor+lysate-pulsed+dendritic+cells+in+the+treatment+of+advanced+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A phase I trial of tumor lysate-pulsed dendritic cells in the treatment of advanced cancer.</a> Clin. Cancer Res. 8, 1021-1032 (2002).</li>
<li>Ito, F., Li, Q., Shreiner, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-CD137+monoclonal+antibody+administration+augments+the+antitumor+efficacy+of+dendritic+cell-based+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Anti-CD137 monoclonal antibody administration augments the antitumor efficacy of dendritic cell-based vaccines.</a> Cancer Res. 64, 8411-8419 (2004).</li>
<li>Kirk, C. J., Hartigan-O'Connor, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell-dependent+antitumor+immunity+mediated+by+secondary+lymphoid+tissue+chemokine%3A+augmentation+of+dendritic+cell-based+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">T cell-dependent antitumor immunity mediated by secondary lymphoid tissue chemokine: augmentation of dendritic cell-based immunotherapy.</a> Cancer Res. 61, 2062-2070 (2001).</li>
<li>Ning, N., Pan, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cell+vaccination+confers+significant+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cell vaccination confers significant antitumor immunity.</a> Cancer Res. 72, 1853-1864 (2012).</li>
<li>Ginestier, C., Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CXCR1+blockade+selectively+targets+human+breast+cancer+stem+cells+in+vitro+and+in+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">CXCR1 blockade selectively targets human breast cancer stem cells in vitro and in xenografts.</a> J. Clin. Invest. 120, 485-497 (2010).</li>
<li>Carpentino, J. E., Hynes, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aldehyde+dehydrogenase-expressing+colon+stem+cells+contribute+to+tumorigenesis+in+the+transition+from+colitis+to+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Aldehyde dehydrogenase-expressing colon stem cells contribute to tumorigenesis in the transition from colitis to cancer.</a> Cancer Res. 69, 8208-8215 (2009).</li>
<li>Charafe-Jauffret, E., Ginestier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+cell+lines+contain+functional+cancer+stem+cells+with+metastatic+capacity+and+a+distinct+molecular+signature%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Breast cancer cell lines contain functional cancer stem cells with metastatic capacity and a distinct molecular signature.</a> Cancer Res. 69, 1302-1313 (2009).</li>
</ol>

A STEMCELL Technologies tem suportado as taxas de publicação do Open Access.

Os hospedeiros imunocomprometidos, como os camundongos SCID, impedem avaliações imunológicas de CSCs devido à falta de imunidade adaptativa dentro dos hospedeiros. Neste estudo, avaliamos a imunogenicidade dos CSCs em hospedeiros imunocompetntes, o que poderia imitar mais de perto as configurações dos pacientes. Os CSCs enriquecidos são imunogênicos e podem induzir imunidade protetora de tumores mais eficaz quando seus lisosatos são carregados para DCs como uma vacina em comparação com DCs com pulso de células tumorais não eleitos.  Mecanicamente, a proteção foi conferida por indução seletiva de anticorpos CSC-reativos e células T8, bem como a produção de citocina tipo 1, por exemplo, IFNγ e GM-CSF.
A maioria das imunoterapias atuais, incluindo vacinas baseadas em células dendríticas e a transferência de células T adotivas, são projetadas para atingir antígenos diferenciados por tumores. CSCs, que podem não expressar esses antígenos diferenciados, podem, portanto, escapar desses alvos imunológicos. Em contraste, a vacina CSC projetada para atingir especificamente células-tronco cancerígenas pode destruir essa população especial das células cancerosas e, assim, melhorar a eficácia terapêutica da vacina prevenindo a recaída tumoral e a metástase.
Em ambas as células tumorais cultivadas e tumores recém-colhidos, identificamos a população enriquecida com CSC por citometria de fluxo baseada na atividade desidrogenase de alto aldeído. Tais célulasaltas de ALDH poderiam ser isoladas pela triagem de fluxo para serem usadas como fonte de antígeno para pulsar DC para gerar CSC-TPDCs. A comparação com célulasaltas aldh isoladas de células tumorais cultivadas versus de tumores recém-colhidos não demonstrou diferença significativa em termos de indução da imunidade anti-CSC8. Esses resultados revelaram o potencial de uso de CSCs isolados de células tumorais cultivadas ou de tumores recém-colhidos para aplicação clínica.
Para ser clinicamente relevante, a vacina precisa ser examinada em um ambiente terapêutico. Esses experimentos estão sendo realizados em nosso laboratório.

As células-tronco cancerígenas são relativamente resistentes à quimioterapia convencional e radioterapia1,2. Por outro lado, essa população de células pode ser as células responsáveis pela recaída e progressão dos cânceres após as terapias tradicionais de câncer1-4. Devido à falta de expressão de antígenos tumorais diferenciados em células-tronco cancerosas, as células-tronco cancerígenas podem escapar das intervenções imunológicas atuais da terapia para o câncer, que são principalmente projetadas para atingir os antígenos nas células tumorais diferenciadas. Portanto, o desenvolvimento de novas estratégias especificamente voltadas e destruindo as células-tronco cancerígenas pode manter promessas de aumentar a eficácia terapêutica do tratamento atual do câncer. Para isso, isolamos populações de células-tronco cancerígenas (CSC) enriquecidas a partir de dois tumores animais (melanoma D5 e câncer de células escamosas SCC7), e as usamos como fonte de antígeno para pulsar células presentes de antígenos (células dendríticas, DC) para preparar a vacina CSC-TPDC. Em seguida, avaliamos a imunidade antitumor induzida pela vacina CSC-TPDC nos hospedeiros de imunocompetente sintérico, camundongos B6 e camundongos C3H, respectivamente. A eficácia do antitumor induzido pelo CSC-TPDC foi comparada com a vacina tradicional dc pulsada com lise de células tumorais heterogêneas não sortidas (H-TPDC), que já foi usada pelo nosso grupo5,6, bem como por outros pesquisadores7 tanto em estudos pré-clínicos quanto em ensaios clínicos.

<table><tbody><tr><td>ALDHEFLOUR KIT</td><td>Stemcell Technologies</td><td>1700</td><td></td></tr><tr><td>Murine IL-4</td><td>Pepro Tech</td><td>214-14</td><td></td></tr><tr><td>Murine GM-CSF</td><td>Pepro Tech</td><td>315-03</td><td></td></tr><tr><td>Mouse GM-CSF ELISA KIT</td><td>BD Biosciences</td><td>555167</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep Gradiente de Densidade Médio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D1556</td><td></td></tr><tr><td>BD OptEIA TMB Reagente Substrato Conjunto</td><td>de</td> Equipamento <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> 555214 BD <tr><td>Biosciences BD FACS Aria Cell Sorter</td><td>BD Biosciences</td><td>336834</td><td></td></tr><tr><td>Kcjunior</td><td>Bio-Tek Instruments</td><td>176058</td><td></td></tr></tbody></table>

geração de uma nova vacina de células dendríticas usando melanoma e células-tronco de câncer escântico

Generation of a Novel Dendritic-cell Vaccine Using Melanoma and Squamous Cancer Stem Cells

Identificamos populações de células-tronco cancerígenas (CSC) enriquecidas de melanoma murino D5 síngênico a C57BL/6 camundongos escamosos SCC7 scc7 scc7 sgênicas para camundongos C3H usando ALDEFLUOR/ALDH como marcador, e testamos sua imunogenicidade usando o lisato celular como fonte de antígenos para pulsar células dendríticas (DCs). Os DCs pulsados com lises de CSCelevados aldh induziam imunidade antitumor protetora significativamente maior do que os DCs pulsados com os lises de células tumorais inteiras não variadas em ambos os modelos e em um ajuste de metástase pulmonar e um s.c. ajuste de crescimento do tumor, respectivamente. Este fenômeno deveu-se às respostas humorais induzidas pela vacina CSC, bem como às respostas anti-CSC celulares. Em particular, esplenócitos isolados do hospedeiro submetido à vacina CSC-DC produziram uma quantidade significativamente maior de IFNγ e GM-CSF do que esplenócitos isolados do hospedeiro submetidos à vacina de linsatrato pulsado de células tumorais não sortidas. Esses resultados apoiam os esforços para desenvolver uma vacina terapêutica baseada em CSC autóloga para uso clínico em um ambiente adjuvante.

ALDEFLUOR/ALDH tem sido usado como um único marcador para isolar células-tronco em múltiplas malignidades8-11. Identificamos populações cancerígenas enriquecidas com células-tronco em dois modelos tumorais D5 e SCC7 usando ALDEFLUOR como marcador. Detectamos células ALDEFLUOR+ no melanoma murino B16-D5 e câncer de células escângenas SCC7. Verificou-se que as células ALDEFLUOR+ contribuem com aproximadamente 0,5% e 5,2% nas linhas de células tumorais cultivadas D5 e SCC7, respectivamente (Figura 1). Células tumorais recém-colhidas de tumores estabelecidos foram analisadas para confirmar a existência de células ALDEFLUOR+. Como também mostrado na Figura 1,houve 2,5% e 4,2% das células ALDEFLUOR+ dos tumores In vivo estabelecidos D5 e SCC7, respectivamente. A tumorigenicidade e a capacidade de autoconexão dessaspopulações classificadas D5 e SCC7 ALDEFLUOR+/ALDH foram avaliadas no hospedeiro de imunocompetente síngênico, os camundongos C57BL/6 e C3H,respectivamente 8.
Utilizamos células tumorais heterogêneas para pulsar DCs (H-TPDC) tanto em estudos em animais quanto em ensaios clínicos5,6. Para examinar a imunogenicidade dos CSCs, isolamos o CSCalto da ALDH e pulsamos DC com o lisato dos CSCs para gerar CSC-TPDC(Figura 2) e usamos o H-TPDC como um controle convencional de vacina contra o câncer para testar se o CSC-TPDC tem algum efeito benéfico na prevenção do crescimento tumoral.
Avaliamos a imunogenicidade dos CSCs examinando a imunidade antitumoral protetora induzida pelo CSC-TPDC. No modelo D5, foram vacinados camundongos imunocompetntes ingênuos.c com CSC-TPDC ou H-TPDC (na mesma razão: razão DC). Os grupos de controle receberam soro fisiológico (PBS). Uma semana após a última vacina, os camundongos foram desafiados com células tumorais D5 não variadas por via intravenosa(i.v.),e os pulmões foram colhidos 3 semanas depois para enumerar metástases pulmonares. Como mostrado na Tabela 1, em comparação com o grupo PBS, os camundongos tratados com o H-TPDC desenvolveram menos metástases pulmonares. É importante ressaltar que os camundongos tratados com CSC-TPDC apresentaram significativamente menos metástases pulmonares do que o grupo de vacinas H-TPDC em ambos os experimentos realizados. No modelo SCC7, foram vacinados animais C3H normais.c com SCC7 CSC-TPDC ou H-TPDC, respectivamente, no flanco direito, seguidos por desafiadores com células tumorais SCC7 não sortidas.c no flanco esquerdo. Comparado com o grupo PBS, h-TPDC induziu imunidade anti-tumor modesta contra o crescimento do tumor. No entanto, houve inibição significativa do crescimento tumoral em camundongos que foram tratados com CSC-TPDC quando comparados tanto com o grupo controle quanto com o grupo H-TPDC (p<0,05, Figura 3). Esses resultados indicam que os CSCs poderiam ser usados como uma fonte de antígeno mais eficaz para carregar DCs do que as células tumorais tradicionais induzindo imunidade protetora contra o desafio das células tumorais.
Para entender melhor os mecanismos subjacentes à imunidade antitumor protetora induzida pelo CSC, colhemos os baços dos animais submetidos à vacinação de DC no final dos experimentos. As células do baço foram então ativadas por anti-CD3/CD28/IL-2 ou anti-CD3/CD28/IL-2 + LPS/anti-CD40. Em seguida, os supernacantes culturais foram coletados para detectar a expressão de citocinas e anticorpos.  Houve produções significativamente maiores de IFNγ e GM-CSF pelas células do baço dos animais vacinados com D5 CSC-TPDC ou SCC7 CSC-TPDC (Figura 4). Além disso, houve uma produção significativa (p<0,05) maior de IgG por células de baço ativadas LPS/anti-CD40 coletadas dos animais vacinados com D5 CSC-TPDC ou SCC7 CSC-TPDC em comparação com D5 H-TPDC ou SCC7 H-TPDC. Esses anticorpos foram encontrados para se ligarem aos CSCs D5 e SCC7, respectivamente, e tal vinculação poderia resultar na lise CSC na presença do complemento8.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50561/50561fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50561/50561fig1.jpg"> Figura 1. Asaltas populações de ALDHFLUOR+/ALDH foram detectadas em tumores de células escângenas murinas recém-colhidas e tumores escânceres SCC7. As células tumorais tratadas com 50 mmol/L DEAB, inibidor específico da ALDH, foram utilizadas como controle negativo.
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50561/50561fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem maior.</a> 
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50561/50561fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50561/50561fig2.jpg"> Figura 2. Geração de vacinas contra células-tronco baseadas em células dendríticas. Para a preparação de CSC-TPDC e H-TPDC, as células dendríticas derivadas da medula óssea foram pulsadas com células tumoraisaltas ou não sortidas de ALDH, respectivamente.
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50561/50561fig2highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem maior.</a> 
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50561/50561fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50561/50561fig3.jpg"> Figura 3. A vacina dc pulsada com csc (CSC-TPDC) poderia induzir imunidade de antitumor protetor protetor mais eficaz na .c. Modelo de tumor SCC7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50561/50561fig3highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem maior.</a> 

<img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50561/50561fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50561/50561fig4.jpg"> Figura 4. Respostas celulares sistêmicas mais potentes no hospedeiro imunocompetente vacinados com CSC-TPDC.  Os esplenócitos foram colhidos dos animais submetidos à vacinação H-TPDC ou CSC-TPDC, e foram ativados conforme indicado. Os supernacantes culturais foram então coletados para detecção de citocinas usando ELISA.
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50561/50561fig4highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem maior.</a>

Avaliada em hospedeiros de imunocompetente sintônico, a vacina de células dendríticas baseadas em células dendríticas baseadas em câncer (CSC) demonstrou imunidade antitumoral significativamente maior do que as vacinas tradicionais de DC pulsadas com células tumorais a granel heterogêneas.

Geração de uma nova vacina de células dendríticas usando melanoma e células-tronco de câncer escântico

We identified cancer stem cell (CSC)-enriched populations from murine melanoma D5 syngeneic to C57BL/6 mice and the squamous cancer SCC7 syngeneic to C3H ...

O objetivo geral deste procedimento é avaliar a imunidade anti-tumoral de uma célula-tronco cancerígena ou vacina de células dendríticas (DC) baseada em CSCs em um hospedeiro imunocompetente. Isso é realizado primeiramente isolando CSCs alor positivas com alta atividade de aldeído desidrogenase ou ALDH alta a partir de células tumorais heterogêneas. Na segunda etapa, as DCs derivadas de CSCs são isoladas e então estimuladas com lisado para a produção da vacina.Em seguida, o lisado de CSC que estimula a DC ou a vacina DC TP é administrado a hospedeiros imunocompetentes normais e singênicos. Então, na etapa final, avalia-se a eficácia antitumoral protetora da vacina C-S-C-T-P-D-C. Por fim, pode-se realizar ELISA para avaliar a imunidade anti-CSC induzida pela vacina C-S-C-T-P-D-C por linfócitos T e anticorpos do hospedeiro.Este projeto reúne duas das áreas mais promissoras da pesquisa em câncer: a área das células-tronco do câncer e a área da imunoterapia tumoral. Nosso laboratório foi um dos primeiros a descobrir as células-tronco do câncer em tumores sólidos. Essas são as sementes do câncer que impulsionam seu crescimento e também a metástase.O que você verá hoje é uma nova abordagem utilizando imunoterapia para direcionar especificamente essas células-tronco cancerígenas. Utilizamos um marcador específico chamado aldeído desidrogenase, que pode ser detectado pelo ensaio Alde fluoro. Você verá os doutores Lin Liu e Huon Tau trabalhando junto com o Dr. Chow Lee.Esperamos que, ao direcionar essas células-tronco tumorais, possamos melhorar o prognóstico para pacientes com diversos tipos de câncer. Comece suspendendo as células tumorais de interesse em tampão de ensaio alor na concentração de um vezes 10 à sexta células por mililitro. Em seguida, transfira todo o volume exceto três mililitros das células tumorais para cada um dos tubos de amostra e rotule quatro tubos de ensaio de poliestireno de 12 por 75 milímetros como segue: não corado alor, ALOR mais DEAB e sete A A D. Distribua um mililitro da suspensão celular nos tubos não corado e sete A A D e dois mililitros no tubo alde forro.Em seguida, adicione cinco microlitros de DEAB ao tubo de ALOR mais DEAB. Coloque os tubos no gelo e então misture 10 microlitros de substrato alor ativado ao tubo de alor. Transfira imediatamente um mililitro da solução de substrato para o tubo de ALOR mais DEAB e, em seguida, adicione dois microlitros de substrato alor ativado por 1 milhão de células a cada um dos tubos de amostra.Incube todos os tubos em banho-maria a 37 graus Celsius por 30 minutos e, em seguida, adicione cinco microlitros de sete a a d ao tubo de sete A a D e um microlitro de sete A a d por 1 milhão de células a cada tubo de amostra. Mantenha esses tubos a quatro graus Celsius por 10 minutos. Centrifugue todos os tubos por cinco minutos a 250 vezes G à temperatura ambiente e ressuspenda os pellets em tampão do ensaio Alde Fluor para triagem celular ativada por fluorescência.Para definir os limites de separação, utilize as células Aldefluor mais DEAB como controle negativo e as células coradas com sete A a D como controle de viabilidade. Com base nesses controles, estabeleça um limite para distinguir as células positivas para Alor A LDH, D elevado cinco e SCC sete. Em seguida, utilize este critério para separar as células da amostra em populações positivas para Alor A LDH, D elevado cinco e SCC sete.Para gerar as células dendríticas, primeiro isole os ossos fêmur e tíbia de um camundongo C57 black six e de um camundongo C3H. Esterilize os ossos em etanol 75% por um minuto à temperatura ambiente e, em seguida, lave-os em HBSS. Em seguida, corte as extremidades dos ossos e use uma seringa de 10 mililitros equipada com uma agulha de 21 gauge para lavar a medula óssea para dentro de uma placa de Petri, aspire e libere as células algumas vezes para criar uma suspensão simples de células e depois centrifugue as células.Incube o pellet em cinco mililitros de tampão de lise de glóbulos vermelhos durante um minuto em banho-maria a 37 graus Celsius. Após a contagem das células, ajuste o volume para um vezes 10 à sexta células por mililitro em meio de cultura suplementado com G-M-C-S-F e IL quatro. Em seguida, cultive as células a 37 graus Celsius e 5%CO2, renovando o meio e as citocinas após três dias.No quinto dia, colete as células dendríticas imaturas. Após centrifugar as células, re-suspenda os pellets em cinco mililitros de meio de cultura e, então, sobreponha lentamente a suspensão celular sobre o meio de isolamento recém-preparado. Após nova centrifugação, colete as DCs entre as camadas do meio de cultura e do meio de isolamento.Em seguida, após a contagem das células, ajuste o volume para uma concentração de um vezes 10 elevado a seis células por mililitro no meio de cultura, suplementado com G-M-C-S-F e IL-4. Agora, crie os lisados tumorais submetendo as células classificadas a quatro ciclos de congelamento-descongelamento rápido, seguidos por centrifugação para coletar a fração de membrana dos lisados. Em seguida, pulse as DCs com o lisado das células autólogas A LDH alta classificadas. Para preparar as CSC TPCs.Para preparar o pulso H-T-P-D-C, utilize os DCs com o lisado de células tumorais heterogêneas não classificadas para vacinar os animais receptores experimentais por injeção subcutânea de uma vez 10 à sexta potência das células pulsadas, suspensas em 100 microlitros de PBS, na região esquerda de cada camundongo. Após a vacinação, administre por via intravenosa uma vez 10 à quinta potência de células tumorais D5 heterogêneas em 100 microlitros de PBS para desafiar os camundongos receptores C57 Black Six. Para o modelo SCC7, desafie os camundongos receptores C3H subcutaneamente com uma vez 10 à sexta potência de células tumorais SCC7 não classificadas em 100 microlitros de PBS no lado oposto da vacina com DCs.Crie uma suspensão de células únicas a partir dos baços dos camundongos receptores C3 H. Em seguida, ative as células T e B esplênicas com anticorpos monoclonais anti-CD3 e anti-CD28 imobilizados em meio de cultura suplementado com o estímulo apropriado. Após quatro dias, colete os sobrenadantes e, então, recubra placas de ELIZA com anticorpos contra interferon gama, G-M-C-S-F ou IgG a quatro graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, bloqueie a ligação não específica, adicione os padrões e os sobrenadantes recém-coletados e, em seguida, incube as placas à temperatura ambiente. Após lavagem, adicione o anticorpo de detecção conjugado à HRP por uma hora e, então, adicione o substrato TMB.Finalmente, meça a absorbância em um leitor de placas ELISA a 450 nanômetros dentro de 30 minutos após interromper a reação. O alor tem sido usado como marcador para isolar células-tronco em múltiplas neoplasias, incluindo as duas populações enriquecidas em células-tronco cancerígenas, D cinco e SCC sete, especificamente conforme demonstrado nestes gráficos de dispersão; as células positivas para alor contribuem aproximadamente com 0,5% e 5,2% das linhagens celulares tumorais cultivadas D cinco e SCC sete, respectivamente. Determinou-se também que células tumorais recém-colhidas contêm 2,5% e 4,2% das células positivas para alor provenientes de tumores D cinco e SCC sete estabelecidos in vivo, respectivamente.Células tumorais tratadas com o inibidor específico D-E-A-B-A da A-LDH foram utilizadas como controle negativo. A imunogenicidade das células-tronco cancerígenas foi avaliada mediante a análise da imunidade anti-tumoral protetora induzida pelos CSC TPCs, utilizando o modelo de vacinação recém-demonstrado. Conforme mostrado nesta tabela, os camundongos tratados com os H TPCs desenvolveram menos metástases pulmonares do que os camundongos tratados apenas com PBS.Importante, os camundongos tratados com PCs de CSC-T tiveram ainda menos metástases pulmonares do que os animais tratados com H-T-P-D-C ou PBS isoladamente. No modelo SCC sete, camundongos C3H normais foram vacinados conforme demonstrado acima, em comparação com o grupo controle. Os TPCs de H induziram imunidade anti-tumoral moderada, enquanto os TPCs de CSC induziram inibição significativa do crescimento tumoral. Esses resultados indicam que as CSCs podem ser utilizadas como fonte de antígenos mais eficaz para o carregamento de DCs do que células tumorais tradicionais não ordenadas, para induzir imunidade protetora contra o desafio com células tumorais.Para compreender melhor os mecanismos subjacentes à imunidade anti-tumoral protetora induzida pelas CSCs observada, os cítos de animais vacinados com DC foram ativados e sua produção de citocinas foi medida por EISA; como acabou de ser demonstrado, houve produção significativamente maior de citocinas pelos cítos obtidos de animais vacinados com D cinco TPCs de CSCs ou S CCC sete PCs de CSCs, em comparação com aqueles obtidos de animais vacinados com D cinco TPCs de HTCs ou SCC sete HTCs. Hoje você viu como utilizar o ensaio Alor para isolar células-tronco cancerígenas.Essas células-tronco cancerígenas podem então ser utilizadas para desenvolver imunoterapias que utilizam células dendríticas. É nossa esperança que essas imunoterapias, usadas isoladamente ou em combinação com terapias existentes, melhorem o prognóstico para pacientes com diversos tipos de câncer.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este vídeo demonstra um ensaio de vacinação tumoral baseado em células. Um camundongo, injetado por via intradérmica com células de melanoma B16-F10 para formação de tumor, é vacinado com células B16-F10 secretando citocina Flt3L perto do tumor desenvolvido. O Flt3L secretado da vacina promove a maturação e proliferação de células dendríticas que então apresentam antígenos tumorais para células T nos gânglios linfáticos, desencadeando uma resposta imune antitumoral direcionada.

Implantação tumoral e injeção de uma vacina tumoral em um modelo de camundongo

O método mais vulgarmente usado para a geração de grandes números de células dendríticas autólogas (DCs), para uso na imunoterapia de tumores é descrita. O método utiliza a IL-4 e GM-CSF a partir de monócitos diferenciam DCs. As DC imaturas são estimuladas a maduro e, em seguida, carregado com os antigénios, antes de serem injectadas de novo no paciente.

Preparação do antigénio tumoral-carregados células dendríticas maduras para a imunoterapia

Este artigo descreve a preparação do tecido acabado de melanoma obtidas em culturas primárias de células, e como para remover contaminações de eritrócitos e fibroblastos a partir de células tumorais. Finalmente, descrevemos como...

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Um sistema tridimensional da cultura Thymic para gerar os Emigrants Thymic antígeno-específicos induzidos pilha-derivados do tumor derivado murine

O dispositivo de transimmunização (TI) ou a placa e os protocolos relacionados foram desenvolvidos para replicar as principais características da fotoquimioterapia extracorpórea (ECP), em um ambiente experimental, permitindo a produção de células dendríticas ativadas fisiologicamente, células (DCs) para a imunoterapia do cancro.

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Este artigo descreve um método para gerar células-tronco pluripotentes induzidas por antígeno funcional do tumor derivadas de CD8αβ+ únicas células T positivas usando o sistema de cocultura OP9/DLL1.

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