Cedo metamórfica de Inclusão Tecnologia para o Comportamento de Monitoramento de insetos de vôo

Olá, sou Alex Derber do laboratório do Dr. Albert Bos. Sou o Departamento de Engenharia Elétrica da Universidade Estadual da Carolina do Norte. Hoje vamos demonstrar um novo procedimento cirúrgico para implantar eletrodos no sexo manica Durante os estágios metamórficos iniciais.

Neste procedimento, que é chamado de tecnologia de inserção metamórfica precoce, os eletrodos implantados são integrados no tecido do inseto durante o estágio metamórfico da pupila. Um grande benefício desse procedimento é que ele resulta em acoplamento mecanicamente estável e eletricamente confiável com o tecido neuromuscular e permite o estudo da neurofisiologia de vôo do inseto. Na fase adulta, o IC Mensa passa por um ciclo de vida metamórfico que dura cerca de 40 dias.

Mensa começa seu ciclo de vida em um estágio de ovo. Após sete a 10 dias, a larva terá eclodido e atingido o estágio larval da terceira estrela. Há um total de cinco estágios de larva estrela e, em cada um desses estágios, as larvas passam por coleta de energia e crescimento.

Cinco a seis dias após o quinto estágio larval de instalação, o inseto entrará no estágio inicial da pupila. Durante o estágio de pupila, há uma extensa degeneração do programa e subsequente regeneração dos tecidos dos insetos. Em preparação para a emergência como mariposa adulta, o inseto passa de 17 a 19 dias.

No estágio inicial da pupila, antes de entrar no estágio final da pupila, durante o estágio final da pupila, inserimos cirurgicamente um eletrodo eletricamente condutor no tórax dorsal da pupila. O tecido se desenvolve ao redor dos eletrodos implantados e garante sua fixação ao corpo do inseto. Ao longo de alguns dias, os eletrodos inseridos no tórax da pupila, emergem como parte do corpo do inseto no estágio adulto final como uma mariposa, aproveitando assim a reconstrução de todo o sistema tecidual do inseto.

Durante o desenvolvimento metamórfico, os eletrodos são implantados nos músculos de vôo indireto no tórax. Esses grupos musculares indiretamente responsáveis pelo movimento das asas são os músculos dorsal ventral e dorsal longitudinal. Aqui estaremos demonstrando uma inserção de eletrodo nos músculos ventrais dorsais, indiretamente responsáveis pelo movimento ascendente da asa.

Com esta inserção, registraremos sem fio o eletromiograma dos músculos dorsais ventrais durante o movimento. Como o inseto é suspenso por uma plataforma levitada eletromagneticamente dentro de uma arena de LED, isso estimula o movimento. O procedimento para a tecnologia de inserção de metamorfose precoce começa com a construção de uma placa de circuito impresso que será utilizada como interface entre os eletrodos inseridos e a instrumentação de registro.

Os eletrodos de fio são soldados na placa de circuito impresso, que é conectada em um conector de cabo plano e flexível. Para começar, meça e corte um pedaço quadrado de 0,5 por cinco centímetros de laminado revestido de cobre usando uma ponta fina, marcador permanente e uma tesoura usando a mesma ponta fina, marcador permanente. Desenhe três blocos quadrados de 0,1 por cinco centímetros como padrões de máscara de gravação.

Use um dispositivo de borda reta, como uma régua, para fazer as marcações ao longo de todo o comprimento do recorte laminado de cobre. Certifique-se de que as marcações estejam em negrito e não se sobreponham umas às outras. Se as linhas de marcação se sobrepuserem umas às outras, os eletrodos entrarão em curto.

Ao fazer a conexão ao conector de cabo plano e flexível, tornando as placas inúteis, leve o recorte do laminado de cobre para uma área ventilada, de preferência com a capela para gravação das marcações no laminado de cobre. Tenha cuidado ao manusear a gravação da placa de circuito impresso, pois ela é tóxica. Se ingerida ou engolida e puder irritar a pele ao contato, coloque a fita de Teflon em uma extremidade do recorte do laminado de cobre cobrindo cerca de um centímetro ao longo do comprimento.

Em seguida, prenda o recorte do laminado de cobre no interior de um béquer graduado usando fita adesiva, de modo que metade da tira laminada de cobre fique submersa na água-forte. Colocar o copo sobre uma plataforma giratória durante 20 minutos. Retire o laminado de cobre gravado do copo e coloque-o num copo cheio de água durante 10 minutos.

Para enxaguar o resíduo, aplique álcool isopropílico em um pedaço de lenço de papel delicado e limpe as marcações Para expor as almofadas de cobre não gravadas. Remova todos os vestígios do marcador permanente. Corte a placa de circuito impresso em quadrados menores de aproximadamente um centímetro de comprimento.

Agora que as placas de circuito impresso foram gravadas, os eletrodos precisam ser preparados para fixação. Sugere-se que essas etapas sejam realizadas com o auxílio visual de um microscópio. Corte dois pedaços de fio de aço inoxidável revestido, ajoelhado, com um diâmetro de 0,11 polegada revestido e 0,008 polegadas nu, usando uma lâmina afiada, dois comprimentos de três centímetros cada.

Esses pedaços de fio de aço inoxidável são os eletrodos ativos que serão inseridos no tórax do inseto. Usando uma lâmina de barbear, remova de quatro a cinco milímetros do revestimento plástico de cada extremidade de cada fio. Em seguida, corte.

Um pedaço de 0,7 centímetro de fio de aço inoxidável isolado para criar uma extensão de ponta para o eletrodo de aterramento. Remova suavemente o revestimento com a lâmina de barbear conforme realizado na etapa anterior ou derreta-o com o calor de um ferro de solda. Em seguida, corte um pedaço de fio lititz com um comprimento de 4,5 centímetros.

O fio indutor também pode ser usado para esta solda. A peça de aço inoxidável de 0,7 centímetro previamente preparada para o fio de conexão de aterramento lititz. Uma ponta de aço inoxidável exposta deve estar no final da conexão de aterramento.

Cole a placa de circuito gravada no espaço de trabalho de solda usando uma fita de Teflon. Coloque a fita sobre a placa de circuito de forma que um a dois milímetros das almofadas permitam a soldagem dos eletrodos à placa. As extremidades livres de solda mascaradas das almofadas serão inseridas no conector FCC.

Alinhe os três fios do eletrodo com fita de Teflon de forma que uma extremidade de cada um possa ser soldada às almofadas correspondentes na placa do eletrodo. Os dois eletrodos ativos devem ser soldados nas almofadas próximas às bordas da placa. Os eletrodos de aterramento acesos devem ser soldados na almofada central.

Aplique fluxo de aço inoxidável nas almofadas do eletrodo para facilitar a soldagem. Tenha cuidado para evitar curto-circuito nas conexões da almofada aplicando muita solda. Mergulhe os eletrodos em acetona em álcool isopropílico por 10 minutos cada.

Para limpar os resíduos de solda. As soluções podem ser derramadas em pratos ou copos separados Para melhorar o desempenho da limpeza, você pode colocar os eletrodos em um banho ultrassônico durante a imersão E as soluções de limpeza. Os insetos serão mais ativos durante as transições entre o dia e a noite.

Portanto, um ciclo diurno e noturno artificial deve ser estabelecido dentro de uma câmara de insetos usando temporizadores automáticos de saída. Eles devem ser configurados para simular um ciclo de escuridão de sete horas e um ciclo de luz de 17 horas. Examine o olho de pu do sexo manduka diariamente para determinar o tempo de inserção apropriado.

O olho pu está pronto para inserção aproximadamente um dia após as asas. As inserções de manchas escuras de exibição são mais bem-sucedidas quando realizadas sete a quatro dias antes de fecharmos aqui. O pu mais escuro na parte inferior está pronto para a inserção cirúrgica dos eletrodos para anestesiar o pui.

Coloque-os na geladeira a quatro graus Celsius por cerca de seis horas. Em seguida, prepare a inserção do espaço de trabalho. O espaço de trabalho deve incluir álcool isopropílico, lâminas de pinças afiadas em uma agulha hipodérmica de calibre 30.

Como opção, o adesivo de cianoacrilato pode ser usado para melhorar a fixação do eletrodo, esterilizar as pinças de agulha e os eletrodos, mergulhando-os ou limpando-os com álcool isopropílico. Retire a pupila da geladeira após seis horas e transfira-a para o espaço de trabalho. Determine a localização no tórax dorsal que corresponde ao grupo muscular de interesse.

Aqui estamos interessados nos músculos ventrais dorsais responsáveis pelo movimento da asa para cima. Usando uma lâmina afiada ou uma agulha hipodérmica, raspe suavemente um retângulo quadrado de um por um centímetro através da camada de cutícula exo. Usando a pinça, retire lentamente essas peças.

Use a pinça para remover os pelos da asa da região exposta do tórax. Um aspirador pode ser usado opcionalmente para auxiliar no processo de limpeza. É importante remover o máximo possível de pelos para evitar interferir nos eletrodos inseridos.

Insira lentamente a agulha cerca de cinco milímetros no meso thax, onde as asas se prendem ao tórax para criar dois pontos de inserção direcionados ao grupo muscular. Lembre-se de onde os buracos são feitos porque eles podem ser difíceis de encontrar se perdidos. Estabilize a pupa na mesa e use uma pinça para guiar os dois eletrodos de gravação nos dois pontos de inserção como uma opção para aumentar a durabilidade mecânica.

Limpe todo o cabelo ao redor dos eletrodos e aplique generosamente o adesivo ciano accolate ao redor de cada ponto de inserção no tórax com o aplicador de fio. Prepare a gaiola para ELO com um material áspero e texturizado cobrindo as paredes e o teto em que o inseto possa subir. Na emergência, caixas de papelão perfuradas ou papel de embalagem podem ser usados.

Prepare uma fixação rígida. Fique com cerca de seis centímetros de comprimento e dois milímetros de diâmetro. Deslize cuidadosamente este bastão pelo orifício embaixo dos prós salientes.

O plástico se mexe. Um cotonete ou fios de metal podem ser usados para esta etapa. Fixe os dois lados do bastão na superfície da gaiola de forma que a pupa não possa rolar.

Posicione a pupa dentro da gaiola de forma que o meso thax fique voltado para cima. O movimento extensivo pode causar danos aos eletrodos, perda de heli ou inutilizar a inserção. O eletrodo terra deve ser inserido no abdômen ou nas partes distais do tórax.

Para evitar o acoplamento de sinal, a inserção de disin pode ser feita durante os estágios posteriores do desenvolvimento da pupila ou após o surgimento do inseto. O local de inserção do eletrodo de aterramento precisa ser preparado neste estágio da pupila para a inserção do estágio da pupila ou para a inserção do estágio adulto. Aqui, em um estágio adulto, a inserção do eletrodo de aterramento é demonstrada.

Coloque-os na geladeira a quatro graus Celsius por seis horas. Para imobilização por tratamento a frio, prepare o espaço de trabalho de inserção, incluindo álcool isopropílico, pinças afiadas, uma agulha hipodérmica de calibre 30 ciano, um adesivo crioulo, um pedaço de arame para aplicação de cola, um cauterizador térmico opcional em um bastão de cera dental opcional. Como antes, mergulhe a agulha hipodérmica no álcool isopropílico antes de entrar em contato com a mariposa localizada em um ponto de inserção a aproximadamente um a dois centímetros de distância dos eletrodos de registro ao longo do abdômen posterior, insira lentamente a agulha para perfurar o abdômen e forneça um lado de inserção.

A agulha não deve penetrar mais de quatro milímetros. Se a hemolinfa surgir no lado da inserção, você inseriu a agulha muito longe e o procedimento tem menos probabilidade de ser bem-sucedido. Usando uma pinça, insira cuidadosamente o eletrodo de aterramento no local de inserção e aplique pressão até que esteja de três a quatro milímetros de profundidade.

Segure o eletrodo no lugar e use um fio para aplicar cola ao redor do local de inserção Como uma etapa opcional. Para aumentar ainda mais a resistência mecânica da inserção, use o cauterizador térmico e colete uma pequena batida de cera de dois a três milímetros na ponta. Coloque a ponta perto do local de inserção e aplique calor de forma que a cera envolva o eletrodo e o mantenha firmemente no lugar.

Após o resfriamento, permita que o inseto um dia se recupere da inserção antes de realizar os experimentos. Uma placa adaptadora com conectores de cabo flexíveis planos necessários para conectar a placa de eletrodo no inseto à unidade de estágio principal internacional da triangle Biosystems. A placa adaptadora usa uma placa laminada de cobre gravada que precisa ser preparada seguindo as etapas apresentadas anteriormente para preparar a borda para a placa de eletrodo na estação de solda, solde um conector de cabo flexível plano em uma extremidade da placa preparada.

Um conector de cabo flexível plano de 10 pinos pode ser soldado à placa com os dois pares de pinos nas bordas do conector e o par de pinos centrais em contato com as três almofadas de cobre. Em seguida, solde três fios de conexão de bitola de fio americano 30 em três almofadas. Na outra extremidade da placa, abata três mini conectores para as três almofadas na placa adaptadora para leituras do osciloscópio conforme descrito.

Na próxima etapa, posicione dois dos conectores perpendicularmente às bordas da placa. O conector central deve ser ligeiramente inclinado para cima do plano da placa e abater a outra extremidade desses três fios até o conector do estágio principal. Fornecido pela Triangle Biosystems International.

A placa de circuito do estágio principal deve então ser fixada na parte superior da estrutura de levitação para auxiliar na confiabilidade dos eletrodos e observar a relação sinal-ruído. Gravações de osciloscópio amarrado podem ser obtidas. Antes de implantar o sistema de gravação sem fio, conecte o osciloscópio a um amplificador de gravação AC neuro multicanal.

Defina os parâmetros do amplificador para uma frequência de corte passa-alta de um hertz, uma frequência de corte passa-baixa de 20 kilohertz e um ganho de 100. Conecte cada um dos conectores de minifio fêmea na placa adaptadora aos canais de entrada do amplificador. Remova o inseto com a placa de eletrodo implantada da gaiola.

Quando está em um estado ativo, um pedaço de tecido pode ser colocado sob a mariposa para descansar antes que as medições sejam feitas usando uma pinça, deslize a placa do eletrodo no receptor de conexão de cabo flexível plano na placa adaptadora. Remova o tecido abaixo do inseto e observe a geração de picos de eletromiograma. À medida que o inseto bate suas asas, capture e salve os dados no osciloscópio.

Esta figura mostra o sinal de potencial muscular adquirido com o osciloscópio de um dos músculos antes e durante o bater das asas. O sinal foi processado com amplificação cem vezes e um filtro passa-alta de um hertz e um filtro passa-baixa de 20 kilohertz e o período quiescente. Nenhum potencial muscular é observado.

Os potenciais musculares durante o bater das asas ocorrem em aproximadamente 15 a 20 hertz. Uma vez que as medições do osciloscópio tenham sido coletadas e verificadas, os sinais EMG sem fio devem ser coletados. Uma plataforma de levitação eletromagnética pode ser construída para gravação sem fio de sinais EMG durante o sexo Manus amarrado ao vôo.

A plataforma de levitação consiste em uma estrutura projetada para equilibrar um mecanismo de amarração. A levitação flutuante livre permite que o quadro e, portanto, o inseto para você. Durante o teste sem restrição de fios de amarração, a estrutura pode ser prototipada rapidamente usando uma máquina de modelagem de deposição fundida.

Esta estrutura carregada com ímã é levitada por uma série de eletroímãs na plataforma de base. Esta plataforma de levitação está localizada dentro da arena de LED, que foi construída usando 60 painéis compostos por uma matriz de cinco por sete LEDs individuais. A arena é controlada pelo microcontrolador APIC 18 F 45 20, permitindo a simulação da rotação no sentido horário e anti-horário, bem como o controle da velocidade de rotação.

Configure o sistema de gravação sem fio TBSI. Conectando o estágio principal TBSI ao conector da placa adaptadora na plataforma de levitação. Remova o inseto da gaiola quando estiver ativo, de preferência durante o amanhecer.

Usando pinças. Insira cuidadosamente a placa do eletrodo no receptor de cabo flexível plano na estrutura de levitação, de modo que o inseto fique firmemente suspenso dentro da configuração. Coloque a varinha magnética perto do interruptor magnético no cabeçote stage para ativar a transmissão de dados sem fio.

Uma luz azul acenderá indicando que o head stage está ativo e pronto para gravação. Apague as luzes da sala para escuridão total e abra o software TBSI neuro aware em um computador. Você pode usar uma lâmpada vermelha para adicionar iluminação adicional à sala.

Selecione o arquivo de configuração apropriado. Os arquivos de configuração usados neste procedimento são a configuração padrão do W cinco. Em seguida, clique no botão iniciar deck no canto superior esquerdo da interface inicial.

Para começar a view sinais, selecione a guia da janela de todos os canais para observação de sinais EMG no sistema de gravação TBSI. Para garantir uma conexão sem fio confiável e operação do eletrodo, ligue todos os componentes da arena de LED, a fonte de alimentação CC regulada e o microcontrolador. Equilibre lentamente a plataforma de levitação dentro da arena.

Selecione a guia de registro para binário no painel esquerdo da interface sem reconhecimento. Designe o tempo de gravação e o destino de salvamento do arquivo. Escolha as configurações de saída apropriadas para salvar seus dados.

Clique no botão Iniciar para iniciar uma sessão de gravação no software de gravação TBSI. Isso salvará seu arquivo como um próximo arquivo, que pode ser importado para programas de processamento de dados comumente usados.

Observe como o inseto voa na direção que corresponde ao movimento dos LEDs. Inverta a direção dos LEDs e confirme se o inseto inverte a direção Execute isso quantas vezes desejar. A seta mostrada indica a direção de rotação do padrão de LED.

A seta fica amarela. Quando o inseto completa uma volta no sentido anti-horário, a seta fica azul quando o inseto completa uma volta no sentido horário. A fala de reprodução de filme mostrada é 50% mais rápida que o normal.

Esta figura mostra o sinal de potencial muscular adquirido da instrumentação sem fio para um músculo antes e durante o bater das asas no período quiescente. Nenhum potencial muscular é observado. Os potenciais musculares durante o bater das asas ocorrem em aproximadamente 15 a 20 hertz.

Aqui acabamos de mostrar uma gravação de um canal. No entanto, uma gravação multicanal feita com essa configuração pode ser usada para observar a coordenação entre vários grupos musculares durante as manobras de voo. Acabamos de mostrar como realizar uma inserção de eletrodo em estágio metamórfico inicial em um homem que faz sexo com pupa.

É importante cronometrar a inserção no estágio final da pupila, de modo que a inserção não seja muito precoce ou tardia no estágio da pupila. Caso contrário, você pode ter problemas para obter uma configuração confiável do eletrodo. Também mostramos como montar componentes elétricos necessários para realizar a gravação sem fio de dados EMG de músculos de voo indireto enquanto o inseto é levitado na arena de LED.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.