Cedo metamórfica de Inclusão Tecnologia para o Comportamento de Monitoramento de insetos de vôo

Olá, sou Alex Derber do laboratório do Dr. Albert Bos. Sou do Departamento de Engenharia Elétrica da Universidade Estadual da Carolina do Norte. Hoje vamos demonstrar um procedimento cirúrgico inovador para implantação de eletrodos na manica sex durante os estágios iniciais da metamorfose.

Neste procedimento, denominado tecnologia de inserção metamórfica precoce, os eletrodos implantados são integrados ao tecido do inseto durante a fase pupal da metamorfose. Uma grande vantagem deste procedimento é que ele resulta em acoplamento mecanicamente estável e eletricamente confiável com o tecido neuromuscular, permitindo o estudo da neurofisiologia do voo do inseto. Na fase adulta, IC Mensa passa por um ciclo de vida metamórfico que dura cerca de 40 dias.

Mensa começa seu ciclo de vida em um estágio de ovo. Após sete a dez dias, a larva terá eclodido e atingido o terceiro estágio larval estrela. Existem cinco estágios larvais estrela no total, e em cada um desses estágios, a larva realiza a coleta de energia e crescimento.

Cinco a seis dias após a quinta fase larval, o inseto entrará na fase inicial de pupa. Durante a fase de pupa, ocorre extensa degeneração programada e subsequente regeneração dos tecidos do inseto. Em preparação para a emergência como mariposa adulta, o inseto passa 17 a 19 dias.

No estágio inicial de pupa, antes de entrar no estágio de pupa tardio, durante o estágio de pupa tardio, inserimos cirurgicamente um eletrodo condutor elétrico na tórax dorsal da pupa. O tecido se desenvolve ao redor dos eletrodos implantados e garante sua fixação ao corpo do inseto. Ao longo de alguns dias, os eletrodos inseridos no tórax da pupa tornam-se parte integrante do corpo do inseto no estágio adulto final, como mariposa, aproveitando assim a reconstrução de todo o sistema tecidual do inseto.

Durante o desenvolvimento metamórfico, os eletrodos são implantados nos músculos indiretos do voo localizados no tórax. Esses grupos musculares, responsáveis indiretamente pelo movimento das asas, são os músculos dorsoventrais e dorsolongitudinais. Aqui demonstraremos a inserção de um eletrodo nos músculos dorsoventrais, responsáveis indiretamente pela elevação das asas.

Com esta inserção, registraremos sem fio o eletromiograma dos músculos dorsoventrais durante o movimento da. Como o inseto é suspenso por uma plataforma levitada eletromagneticamente dentro de uma arena de LED, que estimula o movimento. O procedimento para a tecnologia de inserção na fase inicial da metamorfose começa com a construção de uma placa de circuito impresso que será usada como interface entre os eletrodos inseridos e o instrumento de registro.

Os eletrodos de fio são soldados na placa de circuito impresso, que está conectada a um conector plano e flexível de cabo. Para começar, meça e corte um pedaço de 0,5 por cinco centímetros quadrados de laminado revestido com cobre usando uma caneta permanente de ponta fina e tesoura, utilizando novamente a caneta permanente de ponta fina. Desenhe três pastilhas de 0,1 por cinco centímetros quadrados como padrões de máscara para gravação.

Utilize um dispositivo de borda reta, como uma régua, para fazer as marcações ao longo de todo o comprimento do recorte de cobre laminado. Certifique-se de que as marcações sejam nítidas e não se sobreponham umas às outras. Se as linhas de marcação se sobrepuserem, os eletrodos ficarão em curto-circuito.

Ao fazer a conexão com o conector de cabo plano e flexível, o que torna as placas inutilizáveis, leve o recorte de laminado de cobre para uma área ventilada, preferencialmente com capela para a corrosão das marcações sobre o laminado de cobre. Tenha cuidado ao manipular o processo de corrosão da placa de circuito impresso, pois é tóxico. Se ingerido ou engolido e puder causar irritação na pele mediante contato, coloque a fita de teflon em uma das extremidades do recorte de laminado de cobre, cobrindo cerca de um centímetro ao longo do comprimento.

Em seguida, prenda o recorte do laminado de cobre no interior de um béquer graduado usando fita adesiva transparente, de modo que metade da tira de laminado de cobre fique submersa na solução de ataque. Coloque o béquer sobre uma plataforma rotativa durante 20 minutos. Retire o laminado de cobre gravado do béquer e coloque-o em um béquer contendo água por 10 minutos.

Para a lavagem do resíduo, aplique álcool isopropílico em um pedaço de tecido macio e limpe os marcadores para expor os pontos de cobre não gravados. Remova todos os vestígios do marcador permanente. Corte a placa de circuito impresso em quadrados menores com aproximadamente um centímetro de lado.

Agora que as placas de circuito impresso foram gravadas, os eletrodos precisam ser preparados para a fixação. Sugere-se que esses passos sejam realizados com auxílio visual de um microscópio. Corte dois pedaços de fio de aço inoxidável revestido, com diâmetro de 0,11 polegada revestido e 0,008 polegadas descoberto, utilizando uma lâmina afiada, com dois comprimentos de três centímetros cada.

Esses pedaços de fio de aço inoxidável são os eletrodos ativos que serão inseridos no tórax do inseto. Usando uma lâmina de barbear, remova quatro a cinco milímetros do revestimento plástico de cada extremidade de cada fio. Em seguida, corte.

Um pedaço de 0,7 centímetro de fio de aço inoxidável isolado para criar uma extensão da ponta do eletrodo de terra. Remova cuidadosamente o revestimento com a lâmina de barbear, conforme realizado no passo anterior, ou derreta-o com o calor de um ferro de solda. Em seguida, corte um pedaço de fio lititz em um comprimento de 4,5 centímetros.

O fio do indutor também pode ser usado para esta solda. O pedaço previamente preparado de 0,7 centímetro da ponta de aço inoxidável ao fio de conexão terra do lititz. Uma ponta de aço inoxidável exposta deve estar no final da conexão terra.

Fixe a placa de circuito gravada na área de soldagem usando fita de teflon. Coloque a fita sobre a placa de circuito de modo que um a dois milímetros das pistas fiquem expostos para permitir a soldagem dos eletrodos à placa. As extremidades das pistas protegidas pela fita e livres de solda serão inseridas no conector FCC.

Alinhe os três fios do eletrodo com fita de teflon de modo que uma extremidade de cada um possa ser soldada aos respectivos contatos na placa do eletrodo. Os dois eletrodos ativos devem ser soldados nos contatos próximos às bordas da placa. Os eletrodos de terra iluminados devem ser soldados no contato central.

Aplicar uma camada de fluxo de aço inoxidável sobre os contatos dos eletrodos para facilitar a soldagem. Tenha cuidado para evitar curto-circuitos entre as conexões dos contatos, aplicando uma quantidade excessiva de solda. Mergulhar os eletrodos em acetona e em álcool isopropílico por 10 minutos cada.

Para limpar os resíduos de solda. As soluções podem ser despejadas em recipientes ou béqueres separados. Para melhorar o desempenho da limpeza, é possível colocar os eletrodos em um banho ultrassônico durante a imersão e nas soluções de limpeza. Os insetos estarão mais ativos durante as transições entre dia e noite.

Portanto, um ciclo artificial de dia e noite deve ser estabelecido dentro de uma câmara de insetos utilizando temporizadores automáticos de tomada. Estes devem ser ajustados para simular um ciclo de sete horas de escuro e 17 horas de luz. Examine diariamente o manduka sex eye pu eye para determinar o momento apropriado de inserção.

Os olhos pu estão prontos para inserção aproximadamente um dia após as asas. As inserções em pontos escuros têm mais sucesso quando realizadas de sete a quatro dias antes do fechamento aqui. O pu mais escuro na parte inferior está pronto para a inserção cirúrgica dos eletrodos para anestesiar o pui.

Coloque-os na geladeira a quatro graus Celsius por cerca de seis horas. Em seguida, prepare a inserção do espaço de trabalho. O espaço de trabalho deve incluir álcool isopropílico, lâminas de pinça afiadas em uma agulha hipodérmica de 30 graus.

Como opção, pode-se usar adesivo de cianoacrilato para reforçar a fixação do eletrodo, esterilizando a pinça de agulha e os eletrodos mergulhando-os ou limpando-os com álcool isopropílico. Remova o olho da geladeira após seis horas e transfira-o para a área de trabalho. Determine a localização na região torácica dorsal que corresponde ao grupo muscular de interesse.

Aqui estamos interessados nos músculos dorsoventrais responsáveis pelo movimento de elevação da asa. Usando uma lâmina afiada ou uma agulha hipodérmica, risque suavemente um retângulo quadrado de um por um centímetro através da camada de exocutícula. Com o auxílio de pinças, remova lentamente esses pedaços.

Use a pinça para remover os pelos das asas da região exposta do tórax. Pode-se usar opcionalmente um aspirador para auxiliar no processo de limpeza. É importante remover o máximo possível dos pelos para evitar interferência com os eletrodos inseridos.

Insira lentamente a agulha cerca de cinco milímetros na mesotórax, onde as asas se prendem ao tórax, para criar dois pontos de inserção direcionados ao grupo muscular. Lembre-se de onde os orifícios foram feitos, pois podem ser difíceis de localizar se forem perdidos. Estabilize a pupa sobre a mesa e use pinças para guiar os dois eletrodos de registro para dentro dos dois pontos de inserção, como uma opção para aumentar a durabilidade mecânica.

Limpe todos os pelos ao redor dos eletrodos e aplique generosamente adesivo de cianoacrilato ao redor de cada ponto de inserção no tórax com o aplicador de arame. Prepare a gaiola para ELO com um material áspero e texturizado revestindo as paredes e o teto, no qual o inseto possa subir. Após a emergência, podem ser utilizadas caixas de papelão perfurado ou papel de embalagem.

Prepare uma fixação rígida. Utilize uma haste com cerca de seis centímetros de comprimento e dois milímetros de diâmetro. Deslize cuidadosamente esta haste através do orifício localizado abaixo das pros salientes.

Agite com o palito de plástico. Um cotonete ou fios metálicos podem ser usados nesta etapa. Fixe ambas as extremidades do palito na superfície da gaiola de modo que a pupa não possa rolar.

Posicione a pupa dentro da gaiola de modo que o mesotórax esteja voltado para cima. Movimentos extensivos podem causar danos aos eletrodos, perda de heli ou tornar a inserção inútil. O eletrodo de terra deve ser inserido no abdômen ou em partes distais do tórax.

Para evitar acoplamento de sinal, a inserção pode ser realizada durante os estágios finais do desenvolvimento da pupa ou após a emergência do inseto. O local de inserção do eletrodo de terra precisa ser preparado nesse estágio de pupa, seja para inserção no estágio de pupa ou no estágio adulto. Aqui é demonstrada a inserção do eletrodo de terra no estágio adulto.

Coloque a mariposa na geladeira a quatro graus Celsius por seis horas. Para a imobilização por tratamento a frio, prepare o espaço de inserção, incluindo álcool isopropílico, pinça fina, uma agulha hipodérmica de calibre 30 e adesivo creol, um pedaço de fio para aplicação da cola, um cauterizador térmico opcional e um bastão opcional de cera dental. Como antes, mergulhe a agulha hipodérmica no álcool isopropílico antes do contato com a mariposa localizada em um ponto de inserção aproximadamente um a dois centímetros distante dos eletrodos de gravação ao longo do abdome posterior; insira lentamente a agulha para perfurar o abdome e fornecer um local de inserção.

A agulha não deve penetrar mais de quatro milímetros. Se hemo-linfha emergir no local de inserção, significa que a agulha foi inserida muito profundamente e o procedimento tem menos probabilidade de ser bem-sucedido. Usando pinças, insira cuidadosamente o eletrodo de terra no local de inserção e aplique pressão até que atinja uma profundidade de três a quatro milímetros.

Mantenha o eletrodo no lugar e use um fio para aplicar cola ao redor do local de inserção como um passo opcional. Para aumentar ainda mais a resistência mecânica da inserção, utilize o cautéri térmico e colete uma pequena gota de cera de dois a três milímetros na ponta. Coloque a ponta próxima ao local de inserção e aplique calor de modo que a cera envolva o eletrodo e o mantenha firmemente fixo.

Após o resfriamento, permita que o inseto um dia para se recuperar da inserção antes de realizar experimentos. Uma placa adaptadora com conectores de cabo flexível plano é necessária para conectar a placa de eletrodos no inseto à unidade de estágio de cabeça internacional da Triangle Biosystems. A placa adaptadora utiliza uma placa laminada de cobre gravada que precisa ser preparada seguindo as etapas apresentadas anteriormente para preparar a borda até a placa de eletrodos na estação de solda; solde um conector de cabo flexível plano a uma extremidade da placa preparada.

Um conector de cabo flexível plano com 10 pinos pode ser soldado à placa com os dois pares de pinos nas bordas do conector e o par central de pinos em contato com os três pads de cobre. Em seguida, solde três fios de ligação de bitola 30 AWG a três pads. Na outra extremidade da placa, conecte três conectores miniatura aos três pads na placa adaptadora para leituras no osciloscópio, conforme descrito.

No próximo estágio, posicione dois dos conectores perpendicularmente às bordas da placa. O conector central deve estar ligeiramente inclinado para cima, afastando-se do plano da placa, e ligue a outra extremidade desses três fios ao conector do estágio da cabeça. Fornecido pela Triangle Biosystems International.

A placa de circuito do estágio inicial deve então ser fixada sobre o quadro de levitação para ajudar na confiabilidade dos eletrodos e observar a relação sinal-ruído. Podem ser obtidas gravações com osciloscópio por meio de cabo. Antes de implantar o sistema de gravação sem fio, conecte o osciloscópio a um amplificador neurológico de gravação AC multicanal.

Defina os parâmetros do amplificador com uma frequência de corte de passagem alta de um hertz, uma frequência de corte de passagem baixa de 20 quilohertz e um ganho de 100. Conecte cada um dos conectores fêmeas de fio miniatura na placa adaptadora aos canais de entrada do amplificador. Remova o inseto com a placa de eletrodos implantada da gaiola.

Quando estiver em estado ativo, um pedaço de tecido pode ser colocado sob a mariposa para seu repouso antes de as medições serem realizadas; usando pinças, deslize a placa do eletrodo para dentro do conector do cabo flexível plano na placa adaptadora. Remova o tecido sob o inseto e observe a geração de picos de eletromiograma. À medida que o inseto bate as asas, capture e salve os dados no osciloscópio.

Esta figura mostra o sinal do potencial muscular adquirido com o osciloscópio a partir de um dos músculos antes e durante o bater das asas. O sinal foi processado com uma amplificação de cem vezes e um filtro passa-alta de um hertz e um filtro passa-baixa de 20 quilohertz e o período de quiescência. Nenhum potencial muscular é observado.

Os potenciais musculares durante o bater das asas ocorrem aproximadamente entre 15 e 20 hertz. Após as medições do osciloscópio terem sido coletadas e verificadas, os sinais de EMG sem fio devem ser adquiridos. Uma plataforma de levitação eletromagnética pode ser construída para a gravação sem fio de sinais de EMG durante o voo preso de Manus sex.

A plataforma de levitação consiste em um quadro projetado para equilibrar um mecanismo de fixação. A levitação livre permite que o quadro e, consequentemente, o inseto se movam. Durante testes sem a restrição de fios de fixação, o quadro pode ser rapidamente prototipado utilizando uma máquina de modelagem por deposição fundida.

Esta estrutura com ímãs é levitada por uma série de eletroímãs na plataforma de base. Esta plataforma levitante está localizada no interior da arena de LED, construída com 60 painéis compostos por uma matriz de cinco por sete LEDs individuais. A arena é controlada por um microcontrolador APIC 18 F 45 20, permitindo a simulação de rotação no sentido horário e anti-horário, bem como o controle da velocidade de rotação.

Configure o sistema de gravação sem fio TBSI. Conecte o estágio craniano TBSI ao conector da placa adaptadora na plataforma de levitação. Remova o inseto da gaiola quando ele estiver ativo, preferencialmente durante o período do amanhecer.

Usando pinças, insira cuidadosamente a placa do eletrodo no conector do cabo flexível plano na estrutura levitante, de modo que o inseto fique firmemente suspenso dentro do aparato. Posicione a haste magnética próxima ao interruptor magnético na plataforma para ativar a transmissão de dados sem fio.

Uma luz azul acenderá indicando que o estágio da cabeça está ativo e pronto para a gravação. Apague as luzes da sala para obter escuridão total e abra o software TBSI Neuro Aware em um computador. Você pode usar uma lâmpada vermelha para adicionar iluminação adicional à sala.

Selecione o arquivo de configuração apropriado. O arquivo de configuração utilizado neste procedimento é a configuração padrão W cinco. Em seguida, clique no botão iniciar deck no canto superior esquerdo da interface inicial.

Para iniciar a visualização dos sinais, selecione a guia da janela de todos os canais para observar os sinais de EMG no sistema de gravação TBSI. Para garantir uma conexão sem fio confiável e o funcionamento adequado dos eletrodos, ligue todos os componentes LED da arena, a fonte de alimentação DC regulada e o microcontrolador. Equilibre lentamente a plataforma de levitação dentro da arena.

Selecione o registro na guia binária no painel esquerdo da interface do nor aware. Designe o tempo de gravação e o destino para salvar o arquivo. Escolha as configurações de saída apropriadas para salvar seus dados.

Clique no botão iniciar para iniciar uma sessão de gravação no software de gravação TBSI. Isso salvará seu arquivo como um arquivo .next, que pode ser importado em programas comumente usados para processamento de dados.

Observe como o inseto voa na direção que corresponde ao movimento dos LEDs. Inverta a direção dos LEDs e confirme que o inseto inverte o sentido. Realize este procedimento quantas vezes desejar. A seta mostrada indica a direção de rotação do padrão de LEDs.

A seta fica amarela. Quando o inseto completa uma volta no sentido anti-horário, a seta fica azul quando o inseto completa uma volta no sentido horário. A reprodução do filme exibida é 50% mais rápida que o normal.

Esta figura mostra o sinal de potencial muscular adquirido a partir do instrumento sem fio para um músculo antes e durante o movimento de asa no período de quiescência. Não são observados potenciais musculares. Os potenciais musculares durante o movimento de asa ocorrem aproximadamente entre 15 e 20 hertz.

Aqui mostramos apenas uma gravação de um canal. No entanto, uma gravação multicanal realizada com este equipamento pode ser utilizada para observar a coordenação entre múltiplos grupos musculares durante manobras de voo. Acabamos de mostrar como realizar a inserção de eletrodos em estágio metamórfico inicial em um macho de pupa.

É importante sincronizar a inserção no estágio tardio da pupa, de modo que ela não ocorra muito cedo ou muito tarde nesse estágio. Caso contrário, você poderá ter dificuldades para obter uma configuração confiável do eletrodo. Também mostramos como montar os componentes elétricos necessários para realizar a gravação sem fio de dados de EMG dos músculos indiretos de voo enquanto o inseto é levitado na arena de LED.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.