RNAscope para Em situ Detecção de Papilomavírus Humano transcricionalmente ativo em Cabeça e Pescoço Carcinoma de células escamosas

O objetivo geral do experimento a seguir é demonstrar a detecção sensível e específica de mRNA HPVE seis e E sete de alto risco em células tumorais em cânceres de cabeça e pescoço usando uma nova técnica de hibridização in situ de RNA chamada escopo de RNA. Isso é conseguido primeiro pré-tratando, as amostras de tecido nas lâminas com calor e protease para permear as células para permitir o acesso à sonda. Como segunda etapa, incube as lâminas com um coquetel de sonda de HPV direcionado a sete tipos de HPV de alto risco, que hibridiza com E seis E sete mRNA.

Em seguida, amplifice os sinais de hibridização hibridizando sequencialmente com o amplificador pré-amplificador e a sonda de rótulo conjugada HRP. O sinal é então detectado com um cromógeno e visualizado sob resultados de microscopia de campo claro padrão são obtidos que mostram sinais de HPVE seis E sete mRNA como precipitantes marrons pontilhados em tumores HPV positivos, mas não em tumores HPV negativos. O ensaio de escopo RRA usa uma estratégia de design de sonda nova e proprietária para hibridização de insetos.

Ele permite a visualização de uma única molécula e quantificação de alvos. Essa tecnologia abre caminho para pesquisadores no campo da pesquisa de biomarcadores e do desenvolvimento de ácido diagnóstico para identificar e validar quaisquer biomarcadores de RNA descobertos por meio de estudos de macroraça ou sequenciamento de próxima geração. A maioria dos cientistas com experiência anterior em IHC ou cada um pode aprender esse método rapidamente.

Agora vou dar uma demonstração de todo o fluxo de trabalho destacando as principais etapas para ajudá-lo a dominar a técnica. As amostras de tecido a serem analisadas por esta técnica de hibridização in situ de RNA são formais e fixas. Seções embebidas em parafina de cinco mais ou menos um mícron de espessura montadas em lâminas uma hora antes do ensaio.

Asse as lâminas em forno seco a 60 graus Celsius enquanto as lâminas estão assando. Prepare o forno de hibridização. Traga a temperatura para 40 graus Celsius e coloque um papel umidificador na bandeja de controle de umidade.

Adicione 50 mililitros de água destilada ao papel umidificador para umedecê-lo completamente. Insira a bandeja coberta no forno para pré-aquecer por pelo menos 30 minutos antes de usar. Prepare 700 mililitros de uma solução de pré-tratamento diluindo 10 x solução de pré-tratamento em água destilada.

Aqueça a solução de um x pré-tratamento dois até ferver e mantenha a temperatura entre 100 e 104 graus Celsius. Ao mesmo tempo em que evita a fervura excessiva. Faça três litros de um tampão de lavagem diluindo 50 tampão de lavagem pré-aquecido em água destilada sob uma coifa.

Prepare os xilenos, etanol 70% e etanol 100% para finalização e desidratação de depa. Prepare a solução de coloração de hematina a 50% e a água de amônia a 0,01% ou reagente azulado para pós-coloração. Pré-aqueça as sondas alvo a 40 graus Celsius por 10 minutos.

Leve todos os reagentes do kit de detecção RTU, exceto o cromogênio DAB marrom A e marrom B, à temperatura ambiente. Para iniciar este ensaio, analise as seções de tecido cozido em xileno duas vezes por cinco minutos de cada vez com agitação frequente. Desidratar em 100% de etanol duas vezes por três minutos cada com agitação frequente.

Seque ao ar por cinco minutos e, em seguida, desenhe uma barreira hidrofóbica ao redor da seção de tecido com a caneta de barreira hidrofóbica. Inicie o pré-tratamento das seções de tecido incubando-as com uma solução de pré-tratamento por 10 minutos em temperatura ambiente. Isso extinguirá a atividade da peroxidase endógena

Enxágüe em água destilada. Em seguida, recupere o RNA incubando as seções de tecido por 15 minutos com pré-tratamento, duas soluções mantidas em temperatura de ebulição após 15 minutos, enxágue duas vezes em água destilada para digestão de proteínas. Trate as seções de tecido com três soluções de pré-tratamento e incube no forno de hibridização a 40 graus Celsius por 30 minutos.

Quando a incubação de 30 minutos estiver concluída, enxágue as seções de tecido duas vezes em água destilada. O próximo passo é a hibridização da sonda alvo usando um conjunto de sondas que detectam o mRNA E seis E sete de sete genótipos de HPV de alto risco HPV 16, 18, 31, 33, 35, 52 e 58. Adicione as sondas de HPV, a sonda de ubiquitina C e a sonda DAP B do gene bacteriano separadamente em três seções de tecido adjacentes.

Hibridizar a 40 graus Celsius no forno por duas horas no final das duas horas de incubação. Enxágue as seções de tecido no tampão de lavagem duas vezes por dois minutos de cada vez em temperatura ambiente para amplificação do sinal. Comece incubando seções de tecido com o pré-amplificador AMP one por 30 minutos a 40 graus Celsius no forno de hibridização.

Enxágue duas vezes no tampão de lavagem por dois minutos de cada vez em temperatura ambiente. As etapas subsequentes para amplificação de sinal envolvem a incubação das seções de tecido com os seguintes reagentes a 40 graus Celsius pelo período de tempo indicado com dois enxágues em tampão de lavagem à temperatura ambiente. Após cada incubação, AMP dois redutores de fundo por 15 minutos.

AMP três amplifier por 30 minutos e AMP quatro sonda rotulada por 15 minutos. Em seguida, incube as seções de tecido com ampere cinco por 30 minutos em temperatura ambiente após os dois enxágues no tampão de lavagem, incube com ampere seis por 15 minutos em temperatura ambiente, seguido por mais dois enxágues no tampão de lavagem. Para detecção de sinal, faça uma mistura DAB um-para-um misturando volumes iguais de marrom A e marrom B.Adicione a solução às lâminas e incube por 10 minutos em temperatura ambiente.

Enxágüe duas vezes em água destilada. Contra-manchar as seções de tecido com uma solução de toína 50% hemat por dois minutos em temperatura ambiente e depois enxaguar com água destilada até que as lâminas estejam limpas enquanto os tecidos permanecem. O mergulho roxo desliza em água de amônia 0,01% cinco vezes, seguido por cinco mergulhos e a água destilada desidrata as seções de tecido incubando por dois minutos cada em 70% de etanol, 100% de etanol e 100% de etanol, seguido de xileno por cinco minutos.

Por fim, monte as lâminas com mídia de montagem à base de xileno mostrada Aqui estão exemplos de imagens de seções formais e fixas manchadas de parafina embutidas de células escamosas de cabeça e pescoço Sonoma. No caso positivo para HPV, as sondas HR HPV detectaram fortes sinais pontilhados especificamente nas células tumorais. Isso é claramente visualizado na inserção com ampliação de 40x.

A sonda UBC de controle positivo detectou numerosos sinais citoplasmáticos puntiformes em células tumorais e células estromais. Enquanto a sonda DAP B de controle negativo demonstrou um fundo limpo no caso negativo do HPV, tanto a sonda HR HPV quanto a sonda DAP B não detectaram sinais, sinais fortes foram detectados pela sonda UBC. A pontuação para a determinação do status do HPV envolve o exame de todas as três lâminas para cada caso.

O nível de coloração na lâmina DAP B de controle negativo é usado como o ponto de corte da positividade do HPV é definido pela presença de coloração puntiforme, citoplasmática e/ou nuclear acima do sinal na lâmina DAP B. O ensaio de escopo de RNA pode ser concluído em oito horas se realizado corretamente durante a execução do ensaio. É fundamental adicionar quantidade suficiente de solução para cobrir toda a área do tecido em cada etapa.

Também é importante remover qualquer buffer residual passando os slides entre as etapas, mantendo os slides brancos. A tecnologia de rescope pode ser aplicada para detecção de essencialmente qualquer biomarcador de RNA em qualquer célula ou tecido de qualquer espécie.