Name: RNAscope para Em situ Detecção de Papilomavírus Humano transcricionalmente ativo em Cabeça e Pescoço Carcinoma de células escamosas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-11T18:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Aprenda a técnica RNAscope para detecção de HPV E6/E7 mRNA em carcinomas de células escamosas de cabeça e pescoço. Este método permite visualização sensível de biomarcadores em tecidos fixados em formol.

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1. Sample, Equipamento e Preparação do reagente <ol><li> Corte amostra de tecido em blocos de 3-4 mm de espessura, fixar em fresco formalina a 10% neutra tamponada por 16-32 horas à temperatura ambiente (25 º C) e inserir em parafina. Corte FFPE em seções de 5 ± 1 mM espessura dos blocos FFPE, montar seções em slides e ar seco. Nota: Os slides podem ser armazenados à temperatura ambiente sob dessecação por até 3 meses. As lâminas de tecido montadas deve ser cozido numa seco durante a 60 ° C durante 1 hora antes do ensaio RNAscope. </li><li> Traga Hibridização forno a 40 ° C. Coloque um papel umidificação no Tabuleiro do controle de umidade. Adicionar 50 ml de dH 2 O para o Livro umidificação de molhá-lo completamente. Insira a bandeja coberta para o forno para pré-aquecimento por pelo menos 30 minutos antes de usar. </li><li> Adicione 700 ml de 1x Solução Pretreat 2 (10 nl, pH 6, tampão de citrato) por diluição 10x Solução de pré-tratamento em dH2O Aqueça o 1x Pretreat 2 Solução para ferver e maintain a temperatura entre 100-104 ° C enquanto prevenindo sobre-ebulição. </li><li> Faça 3 L 1x Wash Buffer (0,1 x SSC), diluindo pré-aquecido 50x Wash Buffer em dH 2 O. </li><li> Preparar 2 x 200 ml de xileno e 2 x 200 ml de EtOH a 100% para desparafinização sob um exaustor. </li><li> Preparar a solução de coloração Hematoxilina 50% e reagente bluing (0,01% de amônia da água) para o pós-coloração sob uma coifa. </li><li> Preparar 200 ml de xileno, a 200 ml de 70%, e 2 x 200 ml de EtOH a 100% para a desidratação sob um exaustor. </li><li> Pré-aquecer as sondas alvo a 40 ° C por 10 min e trazer Detecção RTU reagente Kit à temperatura ambiente, incluindo RTU AMP1, Amp2, AMP3, AMP4, Amp 5-Brown, e Amp6-Brown, exceto DAB Chromogen Brown-A e Brown-B . </li></ol> 2. RNAscope Assay Desparafinização e desidratação Após o cozimento, Retire a parafina cortes de tecido em xileno para 2 x 5 minutos com agitação freqüente, e desidratarem EtOH a 100% durante 2 x 3 min, com agitação frequente. Secar ao ar durante 5 minutos e extrair uma barreira hidrofóbica em torno da secção de tecido com uma barreira hidrofóbica Pen. Pré-tratamentos <ol><li> Incubar as secções de tecido com Pretreat 1 durante 10 minutos a RT para extinção da actividade de peroxidase endógena, enxaguar em dH2O </li><li> Incubar as secções de tecido com Pretreat 2 mantidos à temperatura de ebulição durante 15 minutos para a recuperação de ARN, lavar duas vezes em dH2O </li><li> Incubar as secções de tecido com Pretreat 3 durante 30 min a 40 ° C durante a digestão da proteína no forno HybEZ, lavar duas vezes em dH2O </li></ol> Alvo sonda de hibridação Sondas alvo HPV-HR 7 piscina incluem: HPV16, 18, 31, 33, 35, 52 e 58. Adicionar sondas de HPV, ubiquitina C (UBC) e bacterianas sondas dapB gene separadamente em três seções do tecido adjacente. A hibridização a 40 ° C no forno durante 2hr, depois enxaguar em tampão 1x Wash por 2 x 2 min à temperatura ambiente. A amplificação de sinal <ol><li> Incubar as secções de tecido com AMP1 (pré-amplificador) durante 30 min a 40 ° C, Amp2 (fundo redutor) durante 15 min a 40 ° C, AMP3 (amplificador) durante 30 min a 40 ° C, e AMP4 (sonda de marcação) durante 15 min a 40 ° C no forno HybEZ. Depois de cada passo de hibridação, lavagem em tampão 1x de lavagem para 2 x 2 min à temperatura ambiente. </li><li> Incubar as secções de tecido com AMP5 durante 30 min e Amp6 durante 15 min a RT. Depois de cada passo de incubação, lavagem em tampão 1x de lavagem para 2 x 2 min à temperatura ambiente. </li></ol> Detecção de Sinal Incubar as secções de tecido com DAB 01:01 Mistura misturando igual volume de castanho e castanho-A-B por 10 min à temperatura ambiente, lavar duas vezes em dH2O Contracoloração <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; cortes de tecido mancha com solução a 50% de hematoxilina por 2 min à temperatura ambiente, lave com dH 2 O até lâminas são claras, enquanto o tecido ficar roxo. Dip desliza para 0,01% de amônia em dH 2 O para 5x e seguiu com 5 mergulhos em dH 2 O. Deslize de montagem Desidratar as secções de tecido em 70%, 100%, e 100% de EtOH, durante 2 min cada, xileno, durante 5 minutos, montagem com meios de montagem baseada em xileno.

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<li>Lewis, J. S. Jr., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptionally-active+high-risk+human+papillomavirus+is+rare+in+oral+cavity+and+laryngeal%2Fhypopharyngeal+squamous+cell+carcinomas--a+tissue+microarray+study+utilizing+E6%2FE7+mRNA+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Transcriptionally-active high-risk human papillomavirus is rare in oral cavity and laryngeal/hypopharyngeal squamous cell carcinomas--a tissue microarray study utilizing E6/E7 mRNA in situ hybridization.</a> Histopathology. 60 (6), 982-991 (2012).</li>
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</ol>

Todos os autores são empregados pelo próprio estoque e em diagnósticos avançados celulares, Inc.

O ensaio RNAscope HPV permitiu a visualização direta de E6/E7 mRNA in situ na cabeça associada ao HPV e carcinoma de células escamosas pescoço. O ensaio RNAscope é totalmente compatível com o tecido do tumor rotineiramente fixo e preserva a morfologia do tecido para as correlações histopatológicas (Figura 2). Uma vantagem chave do ensaio em relação aos métodos RNAscope CISH convencionais é que especificamente amplifica os sinais de hibridação (Figuras 2B e 2E) sem amplificação do ruído de fundo (Figuras 2C e 2F). Na prática, o procedimento de ensaio RNAscope HPV pode ser concluída dentro de 8 horas ou convenientemente dividido em dois dias. O ensaio RNAscope HPV tem sido usado para determinar a infecção por HPV na cabeça e pescoço, carcinoma de células escamosas 12-16, que demonstra a sensibilidade 97% e especificidade de 93% utilizando qRT-PCR, como o método de referência 16. Chr convencionalISH omogenic para HR-HPV DNA é altamente específico, mas tem uma sensibilidade de 80% ~ 12. Imuno-histoquímica (IHQ) coloração para o celular substituto marcador p16 demonstra excelente sensibilidade, mas podem gerar resultados falsos positivos 15,18, especialmente na cabeça e pescoço nonoropharyngeal 15. O atual método &quot;padrão ouro&quot; de qRT-PCR para HPV E6/E7 detecção do RNAm requer tecido fresco congelado para melhores resultados e é tecnicamente complexo, o que limita seu uso apenas para o laboratório de pesquisa. Além disso, requer a extração de RNA que torna impossível correlacionar expressão HR-HPV E6/E7 mRNA com a histopatologia. Há vários fatores críticos para o sucesso do ensaio RNAscope. Primeiro, para obter melhores resultados, os tecidos devem ser fixados em formalina a 10% fresco neutro tamponado à temperatura ambiente durante 16-32 horas de acordo com as diretrizes da ASCO / CAP 19. Em segundo lugar, o forno HybEZ é altamente recomendado, uma vez que permitemé um óptimo controlo de temperatura e umidade para a hibridização da sonda e as etapas de amplificação de sinal. Em terceiro lugar, é importante para remover o excesso de buffers residuais antes de cada passo, mas ainda manter a secção de tecido de secagem durante qualquer uma dessas etapas. O procedimento RNAscope manual descrita aqui tem sido completamente automatizada em um sistema de corrediça-coloração automóvel comercial 10. Isso deve facilitar muito a normalização das condições de ensaio e salvar o trabalho manual precioso em laboratórios de patologia clínica. Além disso, o software de análise de imagem dedicado foi desenvolvido 10 para identificar automaticamente as células e sinais de coloração em um slide digitalizado, o que deve ajudar a eliminar a subjetividade e melhorar a reprodutibilidade na pontuação. Em resumo, o ensaio RNAscope HPV detecta a presença de transcritos de E6/E7 de HPV-RH in situ de mRNA em tecidos FFPE. Tem um fluxo de trabalho que é familiar para labora patologia clínicatories por permitir a visualização direta destes em cortes de tecido. Ele oferece uma plataforma ideal para o exame (FFPE) amostras de tecido, e pode ser facilmente adotado por laboratórios de patologia de diagnóstico.

Contas de infecção pelo papilomavírus humano de alto risco (HR-HPV) para cerca de 5% de todos os cânceres em todo o mundo 1. A incidência de câncer de orofaringe associadas ao HPV tem aumentado nas últimas décadas, especialmente entre os homens. Carcinoma HPV-positivos orofaríngeo de células escamosas (OPSCC) provavelmente constituem a maioria de todos os cânceres de cabeça e pescoço, nos Estados Unidos nos próximos 20 anos 2. Carcinomas de células escamosas da orofaringe causados ​​pelo HPV estão associados com a sobrevivência favorável e status HPV tumor é um fator prognóstico forte e independente para a sobrevivência 3. Evidência para a ativação da transcrição dos oncogenes virais E6 e E7 é considerada o padrão ouro para a presença de HPV clinicamente relevante 4. No entanto, a detecção de ARNm de E6/E7 de tecido de tumor fresco pela técnica de RT-PCR não é prático na prática clínica de rotina e tem sido limitada aos laboratórios de investigação. Recentemente, nós have desenvolveu uma tecnologia de RNA ISH romance chamado RNAscope, que permite a detecção multiplex em células individuais com uma única molécula de RNA sensibilidade em formalina parafina fixo amostras de tecido incorporados (FFPE) 5-10. Nós fornecemos três linhas de evidência para uma única molécula de detecção 5. Primeiro, o design e sistema de amplificação de sinal de sonda RNAscope permitiu a detecção de uma única cópia HER2 alvos de DNA genômico em HeLa e SK-BR-3 linhas celulares. Em segundo lugar, quando comparado com os sinais de ADN genómico de HER2, a distribuição das intensidades de fluorescência do sinal HER2 mRNA pontos em células HeLa era consistente com uma molécula por ponto. Em terceiro lugar, o número de sinais de HER2 de mRNA por célula pontos combinados intimamente o número de cópias de mRNA HER2 estimado por um ensaio de quantificação baseado em solução, apoiando ainda mais a detecção de uma única molécula. Além disso, a coloração de contraste de núcleos com DAPI em microscopia fluorescente ou com hematoxilina em microscopia de campo claro permite a visualização de núcleos individuais, which por sua vez, permite a detecção e quantificação de alvos de ARN sobre uma base de uma única célula 10. A capacidade de analisar a expressão do gene in situ em amostras clínicas de rotina faz RNAscope uma plataforma promissora para o diagnóstico da patologia, especialmente os ensaios baseados em secção de tecido FFPE 10,11. Nós desenvolvemos um ensaio de HPV baseada em RNAscope para detectar ARNm de E6/E7 de genótipos de HPV de alto risco (HPV16, 18, 31, 33, 35, 52, e 58), utilizando um conjunto de sondas específicas de genótipo. Nossos estudos recentes em OPSCC têm mostrado que o ensaio RNAscope HPV é altamente sensível e específico para determinar o status do HPV em tecidos FFPE 12-17, e também informa o prognóstico em OPSCC 12,16. O princípio da tecnologia RNAscope foi anteriormente descrito 5. Aqui, nós descrevemos o protocolo de ensaio RNAscope completa e demonstrar a sua utilização na detecção de HR-HPV em secções de tecidos tumorais FFPE.

<table><tbody><tr><td>Slides SuperFrost Plus</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>HybEZ Forno, Bandeja e Rack</td><td></td><td>310011, 310012, 310014</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Reagentes FFPE RNAscope 2.0 - Brown</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>310035</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope HPV-HR7 Probe para HPV 16, 18, 31, 33, 35, 52 e 58, E6/E7 mRNA</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>312351</td><td></td></tr><tr><td>Caneta de Barreira Hidrofóbica ImmEdge</td><td>Vector Laboratório</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>100% EtOH</td><td>American Master Tech Scientific</td><td>ALREAGAL</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Fisher Scientific</td><td>X3P-1GAL</td><td></td></tr><tr><td>Gill's Hematoxilina I</td><td>American Master Tech Scientific</td><td>HXGHE1LT</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de amônia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320145-500mL</td><td></td></tr><tr><td>Tampa de Vidro 24 mm x 50 mm</td><td>Placa Quente Fisher Scientific</td><td>12-545-F</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Forno</td><td></td> de Secagem Fisher Scientific 11-300-49SHP <td></td></tr><tr><td></td> Capaz de manter a temperatura em 60&plusmn;<td></td><td></td><td> 1 &deg; C</td></tr><tr><td>Banho-maria</td><td></td><td></td><td>Capaz de manter a temperatura em 40&plusmn; 1 &deg; O</td></tr></tbody></table>

rnascope para<em&gt; em situ</em&gt; detecção de papilomavírus humano transcricionalmente ativo em cabeça e pescoço carcinoma de células escamosas

RNAscope for In situ Detection of Transcriptionally Active Human Papillomavirus in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

O &quot;padrão ouro&quot; para detecção de HPV oncogênico é a demonstração de HPV de alto risco transcricionalmente ativo no tecido tumoral. No entanto, a detecção de E6/E7 mRNA por transcrição Polymerase Chain Reaction reversa quantitativa (qRT-PCR) requer a extração de RNA que destrói o tecido tumoral contexto crítico para a correlação morfológica e tem sido difícil de ser adotada na prática clínica rotineira. Nosso RNA recentemente desenvolvido em tecnologia de hibridização in situ, RNAscope, permite a visualização direta de RNA em, (FFPE) tecido embebido em parafina fixado em formalina com sensibilidade única molécula e resolução de uma única célula, o que permite altamente sensível e específico na análise in situ de qualquer biomarcador RNA em amostras clínicas de rotina. O ensaio RNAscope HPV foi concebido para detectar o ARNm de E6/E7 de genótipos de HPV de alto risco (HPV 16, 18, 31, 33, 35, 52, e 58), utilizando um conjunto de sondas específicas de genótipo. Ela demonstrou excelente sensibilidadee especificidade em relação ao método atual &quot;padrão ouro&quot; de detectar E6/E7 mRNA por qRT-PCR. Estado HPV determinado pela RNAscope é fortemente prognóstico do resultado clínico em pacientes com câncer de orofaringe.

Fluxo de trabalho de ensaio RNAscope HPV O ensaio RNAscope tem um fluxo de trabalho altamente simplificada, que é semelhante à de IHC (Figura 1). Ele consiste em quatro etapas principais: pré-tratamentos, hibridação, amplificações de sinal e de detecção. Ele emprega uma estratégia de design da sonda única que garante sinal de alta fidelidade amplificação 5. No ensaio RNAscope HPV, os sete conjuntos de sonda HR-HPV são reunidas, todos reconhecidos pelo mesmo sistema de amplificação de sinal ligado a peroxidase de rábano (HRP). Sinais de hibridação específicos são detectados como precipitados castanhos formados por reacção catalisada por HRP cromogénico utilizando DAB como substrato, o qual pode ser facilmente visualizadas por microscopia de campo brilhante standard. Coloração Representante para detecção do HPV A Figura 2 mostra exemplos de imagens de cortes corados FFPE de cabeça e carcinoma de células escamosas pescoço. No caso de HPV-positivos (Fig.ure 2A), as sondas de HR-HPV detectado sinais puntiformes fortes especificamente nas células tumorais. A sonda detectada UBC numerosos sinais citoplasmáticos puntiformes em ambas as células tumorais e as células do estroma (figura 2B). A sonda dapB gene bacteriano demonstrou um fundo limpo (Figura 2C). No caso de HPV-negativo, tanto a sonda HR-HPV e a sonda dapB detectado nenhum sinal (Figuras 2D e 2F), enquanto que os sinais fortes foram detectados utilizando a sonda de UBC (Figura 2E). Neste ensaio, UBC serve como controlo positivo para avaliar a qualidade do RNA de tecido e dapB como controlo negativo para os sinais espontâneos. A pontuação para determinação do estatuto de HPV envolve examinar todas as três lâminas para cada caso. O nível de coloração no controlo deslizante negativo (dapB) corrediça é utilizada como ponto de corte: positividade HPV é definida pela presença de citoplasmática punctata e / ou coloração nuclear que era anteriormente o sinal no slide dabpB. <pclass = &quot;jove_content&quot; fo: manter-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51426/51426fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51426/51426fig1.jpg" /> Figura 1. Fluxograma de ensaio RNAscope. Ilustração de fluxo de trabalho de ensaio RNAscope. O ensaio RNAscope contém quatro etapas principais, pré-tratamentos, a hibridação sonda alvo, amplificação de sinal e detecção do sinal. O procedimento de ensaio completo pode ser concluído em 8 horas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51426/51426fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem ampliada.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51426/51426fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51426/51426fig2.jpg" /> Figura 2. Imagens exemplo de lâminas RNAscope coradas seções FFPE corados com sondas para HR-HPV, UBC (controle positivo) e dapB (controle negativo).a partir de dois casos HNSCC. AC. Caso de HPV positivo. A, expressão de E6/E7 do HPV HR-mRNA nas células tumorais. Inset, aumento de 40 vezes para mostrar sinais puntiformes. B e C) cortes de tecidos adjacentes que apresentam coloração positiva UBC (B) e negativo para dapB (C), respectivamente DF) HPV-negativos caso. D). Nenhuma coloração para HPV E6/E7 mRNA , similar ao controle negativo dapB (F). E) UBC coloração positiva. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51426/51426fig2highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem ampliada.</a>

A presença de HPV de alto risco no tecido do tumor de cabeça e pescoço está associada a resultados favoráveis. O RNA recentemente desenvolvido na técnica de hibridização in situ chamado RNAscope permite a visualização direta de HPV E6/E7 mRNA em cortes de tecido FFPE.

RNAscope para<em&gt; Em situ</em&gt; Detecção de Papilomavírus Humano transcricionalmente ativo em Cabeça e Pescoço Carcinoma de células escamosas

The &#39;gold standard&#39; for oncogenic HPV detection is the demonstration of transcriptionally active high-risk HPV in tumor tissue. However, detection ...

O objetivo geral do experimento a seguir é demonstrar a detecção sensível e específica do mRNA dos genes E6 e E7 do HPV de alto risco em células tumorais de cânceres de cabeça e pescoço, utilizando uma técnica inovadora de hibridização in situ de RNA chamada RNA scope. Isso é alcançado primeiramente pré-tratando as amostras de tecido nos lâminas com calor e protease para permeabilizar as células e permitir o acesso das sondas. Como segundo passo, incuba-se os lâminas com um coquetel de sondas para o HPV que direciona sete tipos de HPV de alto risco, o qual hibridiza com o mRNA dos genes E6 e E7.Em seguida, amplifique os sinais de hibridização hibridizando sequencialmente com o amplificador pré-amplificador e a sonda marcadora conjugada à HRP. O sinal é então detectado com um cromógeno e visualizado por microscopia de campo claro padrão, obtendo-se resultados que mostram sinais de mRNA do HPVE6 E7 como precipitados marrons pontuados em tumores positivos para HPV, mas não em tumores negativos para HPV. O ensaio RRA scope utiliza uma estratégia inovadora e proprietária de design de sonda para hibridização em insetos.Permite a visualização de moléculas individuais e a quantificação de alvos. Esta tecnologia abre caminho para pesquisadores na área de pesquisa de biomarcadores e desenvolvimento de diagnósticos para identificar e validar quaisquer biomarcadores de RNA descobertos por meio de estudos de macro race ou sequenciamento de nova geração. A maioria dos cientistas com experiência prévia em IHQ ou em cada um desses métodos pode adotar esta técnica rapidamente.Agora vou demonstrar todo o fluxo de trabalho, destacando os passos principais para ajudá-lo a dominar a técnica. As amostras de tecido a serem analisadas por esta técnica de hibridização in situ de RNA são fixadas em formalina. Cortes emblocados em parafina com espessura de cinco mais ou menos um mícron, montados em lâminas uma hora antes do ensaio.Leve as lâminas ao forno seco a 60 graus Celsius enquanto as lâminas estão sendo assadas. Prepare o forno de hibridização. Ajuste a temperatura para 40 graus Celsius e coloque um papel umidificador na bandeja de controle de umidade.Adicione 50 mililitros de água destilada ao papel umidificador para umedecê-lo completamente. Insira a bandeja tampada no forno para pré-aquecimento por pelo menos 30 minutos antes do uso. Prepare 700 mililitros de solução de pré-tratamento 1x diluindo a solução de pré-tratamento 10x em água destilada.Aqueça a solução de pré-tratamento 1x até a fervura e mantenha a temperatura entre 100 e 104 graus Celsius, evitando a fervura excessiva. Prepare três litros do tampão de lavagem 1x diluindo o tampão de lavagem 50x pré-aquecido em água destilada sob capela.Prepare os xilenos, etanol 70% e etanol 100% para desparafinização e desidratação final. Prepare uma solução corante de hematina a 50% e água amoniacal 0,01% ou reagente azulador para pós-coloração. Pré-aqueça as sondas-alvo a 40 graus Celsius por 10 minutos.Leve todos os reagentes do kit de detecção RTU, exceto o cromógeno DAB marrom A e marrom B, à temperatura ambiente. Para iniciar este ensaio, desparafine as seções de tecido aquecidas em xilol duas vezes, durante cinco minutos cada vez, com agitação frequente. Desidrate em Etanol 100% duas vezes, durante três minutos cada, com agitação frequente.Seque ao ar por cinco minutos e, em seguida, desenhe uma barreira hidrofóbica ao redor da seção tecidual com a caneta de barreira hidrofóbica. Inicie o pré-tratamento das seções teciduais incubando-as com a solução de pré-tratamento um por 10 minutos à temperatura ambiente. Isso inibirá a atividade de peroxidase endógena.Lave com água destilada. Em seguida, recupere o RNA incubando as seções de tecido por 15 minutos com a solução pré-tratamento dois mantida em temperatura de ebulição após 15 minutos, lave duas vezes com água destilada para digestão proteica. Trate as seções de tecido com a solução pré-tratamento três e incube no forno de hibridização a 40 graus Celsius por 30 minutos.Após a incubação de 30 minutos, lave as seções de tecido duas vezes com água destilada. O próximo passo é a hibridização com a sonda alvo, utilizando um conjunto de sondas que detectam o mRNA E6 E7 de sete genótipos de HPV de alto risco: HPV 16, 18, 31, 33, 35, 52 e 58. Adicione as sondas para HPV, a sonda para ubiquitina C e a sonda para o gene bacteriano DAPB separadamente em três seções de tecido adjacentes.Hibridize a 40 graus Celsius no forno durante duas horas ao final da incubação de duas horas. Enxágue as seções de tecido no tampão de lavagem duas vezes, por dois minutos cada vez, em temperatura ambiente para amplificação do sinal. Inicie incubando as seções de tecido com o amplificador pré-amplificador um por 30 minutos a 40 graus Celsius no forno de hibridização.Lave duas vezes com o tampão de lavagem, durante dois minutos cada vez, à temperatura ambiente. Os passos subsequentes para amplificação do sinal envolvem a incubação das seções de tecido com os seguintes reagentes a 40 graus Celsius pelo tempo indicado, com duas lavagens em tampão de lavagem à temperatura ambiente. Após cada incubação, adicione AMP two redutor de fundo por 15 minutos.AMP três amplificadores por 30 minutos e AMP quatro sonda marcada por 15 minutos. Em seguida, incubar as seções de tecido com amp cinco por 30 minutos à temperatura ambiente após duas lavagens no tampão de lavagem, incubar com amp seis por 15 minutos à temperatura ambiente, seguido por mais duas lavagens no tampão de lavagem. Para detecção do sinal, prepare uma mistura um para um de DAB misturando volumes iguais de marrom A e marrom B. Adicione a solução às lâminas e incube por 10 minutos à temperatura ambiente.Lave duas vezes com água destilada. Contracolora as seções de tecido com uma solução de hematoxilina a 50% por dois minutos à temperatura ambiente e, em seguida, lave com água destilada até que as lâminas fiquem transparentes, mantendo os tecidos. Mergulhe as lâminas em água de amônia a 0,01% por cinco vezes, seguido por cinco mergulhos em água destilada. Desidrate as seções de tecido incubando por dois minutos cada em etanol a 70%, etanol a 100% e etanol a 100%, seguido por xilol por cinco minutos.Por fim, monte as lâminas com meio de montagem à base de xilol mostrado. Abaixo estão imagens de exemplo de cortes corados, fixados em formalina e emblocados em parafina, de carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço da Sonoma. No caso positivo para HPV, as sondas para HPV de alto risco detectaram sinais fortes e pontuais especificamente nas células tumorais. Isso é claramente visualizado no detalhe com ampliação de 40 x.O sonda controle positivo UBC detectou diversos sinais citoplasmáticos pontiformes em ambas as células tumorais e células estromais. Embora a sonda controle negativo DAP B tenha demonstrado um fundo limpo no caso negativo para HPV, tanto a sonda para HPV de alto risco quanto a sonda DAP B não detectaram sinais, enquanto sinais fortes foram detectados pela sonda UBC. A pontuação para determinação do status de HPV envolve a análise das três lâminas para cada caso.O nível de coloração no lâmina de controle negativo DAP B é utilizado como ponto de corte; a positividade para HPV é definida pela presença de coloração pontuada, citoplasmática e/ou nuclear acima do sinal observado na lâmina DAP B. O ensaio RNA scope pode ser concluído em até oito horas, se realizado corretamente durante a execução do ensaio. É fundamental adicionar quantidade suficiente de solução para cobrir completamente a área tecidual em cada etapa.Também é importante remover qualquer tampão residual agitando levemente as lâminas entre os passos, mantendo-as brancas. A tecnologia rescope pode ser aplicada para a detecção de praticamente qualquer biomarcador de RNA em qualquer célula ou tecido de qualquer espécie.

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O uso de interferão-γ Enzyme-linked Assay immunospot Caracterizar Novel epitopos de células T de papilomavírus humano

Este vídeo descreve uma estratégia de hibridização sequencial que envolve a hibridização de sondas de mRNA para mRNA alvo específico. Após a hibridização da sonda, a amplificação do sinal é realizada para melhorar a resolução por meio da redução da relação sinal-ruído durante o RNA-CISH de amostras histológicas.

Hibridização de sonda e amplificação de sinal em hibridização in situ de RNA: uma técnica para detectar sequências específicas de RNA em seções de tecido

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Aprenda a técnica RNAscope para detecção de HPV E6/E7 mRNA em carcinomas de células escamosas de cabeça e pescoço. Este método permite visualização sensível de biomarcadores em tecidos fixados em formol.

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