Name: Induzir miointimais Hiperplasia Versus aterosclerose em camundongos: uma introdução de dois modelos válidos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Aprenda a induzir miointimal hiperplasia e aterosclerose em camundongos usando cateterização com balão e dieta rica em lipídios. Estes modelos ajudam pesquisadores a estudar mecanismos de estenose arterial.

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Os autores agradecem Christiane Pahrmann para assistência técnica. SS recebeu financiamento da Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (SCHR992/3-2 e SCHR992/4-2).

Todo o trabalho animal deve ser realizada de acordo com as orientações de cuidados de animais relevantes. Obter a aprovação institucional para o trabalho de animais antes do início do protocolo. 1. Miointimais Hiperplasia Modelo (A) Para o modelo de hiperplasia da íntima, comprar C57BL/6J (da série 000.664, C57BL/6J) ratos com a idade de 8 semanas, pesando aproximadamente 25 g. Os ratos domésticos para estas experiências sob condições convencionais; alimentar de comida mouse padrão camundongos e fornecer água ad libitum. <ol><li> Rato preparação: Introduzir o mouse para um estado anestésico com isoflurano (2%), utilizando uma câmara de indução. <ol><li> Remova o cabelo abdominal usando um aparador de pêlos, coloque o rato em suas costas e cobrir o nariz ea boca com a máscara para garantir a anestesia. </li><li> Com Provo-iodo, desinfectar a zona abdominal universalmente, seguido de etanol a 80%, em dois ciclos. </li><li> Assegurar a ausênciade reflexos por beliscar o membro posterior para monitorizar a profundidade da anestesia suficiente. </li><li> Separe a pele e músculo ao longo da linha alba em duas etapas para expor os órgãos abdominais. </li><li> Coloque os intestinos em uma luva salina hidratada. Enrole a luva em torno dos intestinos para mantê-los úmidos. </li><li> Atentamente limpar o tecido adiposo sheeting da aorta abdominal. Expor a aorta infra-renal até a sua bifurcação, tomando cuidado para não ferir quaisquer embarcações filiais. </li><li> Primeiro, coloque uma braçadeira microcirúrgica no proximal, aorta infra-renal para desligar o fluxo de sangue. Agora, aplique uma segunda pinça distal próximo à bifurcação da aorta. </li><li> Quando o fluxo de sangue é interrompido, fazer uma pequena incisão na aorta perto da braçadeira proximal. </li><li> Inserção do cateter de balão, que foi hidratada com soro fisiológico 0,9%, e avançar para o grampo distal da aorta. </li><li> Por lesão endotelial, desnudar a aorta por inflar o balloon cuidadosamente e lentamente deixando o cateter na direcção da pinça proximal. </li><li> Repetir a manobra desnudação duas vezes. </li><li> Remover o cateter e fechar a incisão aórtica com prolene 10-0 suturas em execução. </li><li> Abra cuidadosamente o grampo distal. Em caso de sangramento no local da aortotomia, feche a braçadeira de novo, localizar o sangramento e colocar pontos interrompidos adicionais, conforme necessário. </li><li> Se nenhum sangramento pode ser observado, abrir lentamente a braçadeira proximal. </li><li> Um impulso da aorta deve ser visível distalmente a partir da incisão. Agora, os intestinos podem ser dispostas volta in situ. </li><li> Lavar a cavidade abdominal, utilizando solução salina estéril pré-aquecido. </li><li> Feche a parede abdominal começando com a camada muscular usando 6-0 prolene em execução. </li><li> Próxima adaptar a pele sob o uso de 5-0 prolene realizar suturas em execução. </li><li> Durante o tempo que o rato continua a ser anestesiado, aplicam-se 4-5 mg / kg através de uma inje Carprofeno subcutâneacção. </li><li> Adicionar Metamizol à água potável (50 mg por 100 ml Metamizol) para o controle da dor e continuar para a cirurgia de 3 dias após. Monitorar animal ao longo da recuperação. Nota: O período de observação para este modelo é de 28 dias. </li></ol></li></ol> 2. Modelo de Aterosclerose (B) Para o modelo de aterosclerose, comprar (ApoE - / -) E-deficiente apolipoproteína camundongos (Bolsa de número 002052, B6.129P2-Apoetm1Unc / J) em uma idade de 4 semanas, e depois alimentados por 4-6 meses. Os ratos domésticos para estas experiências sob condições convencionais; alimentar ratos dieta ocidental elevado teor de lípidos na chegada (Harlan Laboratories TD.88137) e fornecer água ad libitum durante um período de 4 a 6 meses. <ol><li> Rato preparação: <ol><li> Alimente o ApoE - / - ratos com dieta ocidental a partir das 4 semanas de idade. Manipulação dietética deve começar diretamente à chegada. </li><li> Manter dieta ocidental ao longo tempo de experiência. &lt;/ Li&gt; </ol></li></ol> 3. Análise <ol><li> Modelo de hiperplasia miointimal (A) A região de interesse neste modelo é a &quot;área da lesão.&quot; Opções para análise incluem a obliteração luminal, rácio E / M (razão íntima / média), espessura myointima máxima, área miointimal, coloração Trichrome para fibrose, e H &amp; E para a coloração de células mononucleares (tal como ilustrado nas Figuras 1A-1C). De acordo com a questão científica inúmeras outras colorações, como Picrosirius vermelho para colágeno, imunohistoquímica e métodos confocal pode ser aplicada. </li><li> Modelo de Aterosclerose (B) As regiões de interesse no modelo são a válvula aórtica, do arco aórtico, bem como a aorta descendente. Opções para análise: coloração vermelho Sudão para lipídios e tricrômico de coloração da valva aórtica, arco aórtico e aorta descendente (como ilustrado na Figura 1E). Este modelo também produz uma variedade de outras opções, como coloraçãopor exemplo Oil Red O para lipídios neutros, Picrosirius red, imunohistoquímica e métodos confocal. <ol><li> Coloração vermelho Sudão: Realizar a coloração vermelha Sudão em tecido aórtico recém-colhida. <ol><li> Retire a dieta 6h antes da colheita. </li><li> Introduzir o rato a um estado anestésico com isoflurano (2%) utilizando uma câmara de indução. Assegurar a ausência de reflexos por aperto do membro posterior para monitorizar a profundidade da anestesia suficiente. </li><li> Abra o peito; cortar o vértice do coração e perfundir através do ventrículo esquerdo, primeiro com solução salina (3 mL), seguido por 4% de PFA (3 ml) através da raiz da aorta, para fixar a aorta. </li><li> Livre a aorta da raiz até a sua bifurcação. Tentar remover o tecido adiposo, tanto quanto possível. </li><li> Corte o coração e da raiz da aorta, e armazená-los em PFA 4% para histologia. </li><li> Para a histologia da raiz da aorta tem de ser cuidadosamente colocado no bloco de parafina numa posição vertical para permitir que o corte da aortic lâminas geradoras de raiz que exibem todos os 3 folhetos valvares. </li><li> Cortar uma extremidade da árvore da aorta e corrigi-lo para a camada de silicone com pinos finos. Abra a aorta longitudinalmente e fixar o tecido aórtico. </li><li> Lavar o tecido com 50% de etanol. Mergulhe o tecido com solução corante Sudan III por cerca de 15 min. </li><li> Lavar cuidadosamente com etanol a 50% para remover o excesso de Sudan III. (Nota: 50% de etanol pode lavar o corante de distância.) Lavar com dH 2 O, e tirar fotos para análise posterior. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Manuel, D. G., Leung, M., Nguyen, K., Tanuseputro, P., Johansen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burden+of+cardiovascular+disease+in+Canada%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Burden of cardiovascular disease in Canada.</a> Can J Cardiol. 19, 997-1004 (2003).</li>
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<li>Nitschke, Y., Weissen-Plenz, G., Terkeltaub, R., Rutsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Npp1+promotes+atherosclerosis+in+ApoE+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cellular+and+molecular%22%5BJournal%5D)">Npp1 promotes atherosclerosis in ApoE knockout mice.</a> Journal of cellular and molecular. 15, 2273-2283 (2011).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Embora ambas as doenças resultam em sintomas semelhantes no paciente, os mecanismos subjacentes ao desenvolvimento da placa e, portanto, as abordagens de tratamento são muito diferentes 2. Em diferentes formas de estenose arterial os achados clínicos nos pacientes, bem como o cronograma de desenvolvimento da placa depende do mecanismo subjacente. Dependendo do quadro clínico do paciente, diferentes métodos de análise da amostra devem ser realizadas 5,15. É necessária a ...

Em nações industrializadas doença isquêmica do coração continua a ser uma das principais causas de mortalidade 1. As causas para a estenose da artéria coronária são múltiplas e incluem hiperplasia miointimal bem como aterosclerose, com revascularização restante da estratégia de tratamento mais comum 2. Modelos de pesquisa que distinguem claramente entre os caminhos mecanicistas da hiperplasia da íntima e aterosclerose são essenciais para investigar o patobiológico e processos fisiopatológicos no desenvolvimento da placa arterial. Neste vídeo de dois diferentes modelos de ratinho utilizada para estudar o desenvolvimento quer de hiperplasia miointimal ou aterosclerose são introduzidos. Hiperplasia miointimais é postulada para formar através do paradigma &quot;resposta-a-lesão&quot;, originalmente descrito para a aterosclerose 3. A ruptura mecânica da camada endotelial leva a uma remodelação intensa reforçada por efeitos parácrinos. Existem vários dimodelos animais fferent comummente usados ​​para estudar a hiperplasia miointimal. Alguns grupos de utilizar dispositivos de metal na aorta ascendente de 4 ratos. O modelo desnudamento aórtica realizada com um cateter de balão também é comumente usado em ratos de laboratório 5,6. O modelo de hiperplasia da íntima realizada em ratos de laboratório 7 implementa ligadura da artéria carótida e induz lesões miointimais 8. No nosso laboratório, o modelo de desnudação da aorta abdominal - para estudar o desenvolvimento de hiperplasia miointimal -, bem como um modelo humanizado stent 9 são vulgarmente utilizados. Este vídeo enfatiza que a escolha do modelo animal experimental adequado é crucial para estudos sobre os mecanismos fisiopatológicos ou de estenose arterial. Modelos hiperplasia miointimais deve ser diferenciado de modelos aterosclerose. Para este último, a apolipoproteína E-deficiente (ApoE - / -) ratos em combinação com uma dieta ocidental são comumente usados ​​para induzir atheroscllesões eróticos 10,11,12,13. Exemplos para a indução de ambos os tipos de doença miointimal em ratinhos são mostradas aqui, juntamente com diferentes opções de adaptação ao modelo para analisar estenose do vaso 14.

<table><tbody><tr><td>Caldo de tioglicolato 3%</td> <td>Fluka</td><td>70157</td><td>pó</td></tr><tr><td>PFA 4%</td> <td>Microscopia Eletrônica Ciências</td><td>#157135S</td><td>20%</td></tr> <tr><td>Sudan III solução de coloração</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S4131</td><td>camundongo em pó</td></tr><tr><td>C57BL / 6J</td><td>Jackson Laboratories</td><td>Estoque # 0006664</td><td></td></tr><tr><td>mouse ApoE -/-</td> <td>Jackson Laboratories</td><td>Estoque # 002052</td><td></td></tr> Máquina de cortar cabelo <tr><td>Western Diet</td><td>Harlan Laboratories</td><td>TD.88137</td><td></td></tr><tr><td></td><td>WAHL</td><td>8786-451A ARCO SE</td><td></td></tr><tr><td>Forene</td><td>Abbott</td><td></td><td>Isoflurano</td></tr><tr><td>grampo microcirúrgico</td><td>Fine Science Tools</td><td>18055-04</td><td>Micro-Serrefine -</td></tr><tr><td>aplicador de grampo</td> de 4 mm <td>Fine Science Tools</td><td>18056-14</td><td></td></tr><tr><td>cateter</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sutura de prolene 10-0 Sutura de prolene</td><td>Ethicon</td><td>788G</td><td></td></tr><tr><td>6-0 Sutura de prolene</td><td>Ethicon</td><td>8709H</td><td></td></tr><tr><td>5-0</td><td>Ethicon</td><td>EH7229H</td><td></td></tr><tr><td>Rimadyl</td><td>Pfizer</td><td></td><td>Carprofeno</td></tr><tr><td>Metacam 1,5 mg/ml</td><td>Boehringer Ingelheim</td><td></td><td>Metamizol</td></tr></tbody></table>

induzir miointimais hiperplasia versus aterosclerose em camundongos: uma introdução de dois modelos válidos

Inducing Myointimal Hyperplasia Versus Atherosclerosis in Mice: An Introduction of Two Valid Models

Vários modelos in vivo de roedores de laboratório para a indução de estenose da artéria foram estabelecidas para imitar as doenças que incluem a formação de placa arterial e estenose, como se observa, por exemplo, na doença cardíaca isquémica. Dois modelos do rato altamente reprodutíveis - ambos, resultando em estenose da artéria mas cada subjacentes um caminho diferente de desenvolvimento - são introduzidos aqui. Os modelos representam as duas causas mais comuns de estenose da artéria; ou seja, um modelo de mouse para cada hiperplasia miointimal e aterosclerose são mostrados. Para induzir hiperplasia miointimal, uma lesão por cateter balão da aorta abdominal é realizada. Para o desenvolvimento da placa aterosclerótica, a ApoE - / - modelo do rato, em combinação com dieta gordurosa ocidental é usado. Diferentes opções de adaptação do modelo para a medição e avaliação dos resultados são nomeados e descritos neste manuscrito. A introdução ea comparação destes dois modelos fornece informatíon para os cientistas a escolher o modelo de estenose da artéria apropriada de acordo com a questão científica perguntou.

A Figura 1 mostra diferentes opções de análise e o estado da doença induzida por ambos os modelos. Para o modelo de hiperplasia da íntima, a análise de secções representativas em tricromo é mostrado. A partir destas secções transversais, como resultado índices I / M, a espessura máxima da placa, da espessura máxima da íntima no lúmen, obliteração luminal em por cento, bem como a área da placa pode ser medido e calculado. Para avaliar os resultados do modelo de aterosclerose,...

Este vídeo mostra dois modelos de desenvolvimento íntima placas nas artérias murino e enfatiza as diferenças de hiperplasia miointimal e aterosclerose.

Induzir miointimais Hiperplasia Versus aterosclerose em camundongos: uma introdução de dois modelos válidos

Various in vivo laboratory rodent models for the induction of artery stenosis have been established to mimic diseases that include arterial plaque ...

O objetivo geral do experimento a seguir é apresentar dois modelos animais válidos que levam ao estreitamento da aorta por meio de mecanismos diferentes. O primeiro modelo é a cateterização com balão da aorta para induzir o desenvolvimento de hiperplasia miointimal. Primeiro, a aorta abdominal infrarrenal é exposta e clampada.Em seguida, a aorta é aberta com uma incisão transversal e o cateter com balão é introduzido. O endotélio da aorta é então desnudado com o cateter inflado e a cirurgia é concluída. O segundo modelo é uma manipulação dietética de camundongos transgênicos nulos para APOE para induzir placas ateroscleróticas.Esses camundongos são mantidos em condições padrão e alimentados com uma dieta ocidental rica em lipídios por quatro a seis meses. Em última análise, a análise histológica da hiperplasia miointimal induzida cirurgicamente e do modelo de restrição dietética mostra que eles resultam em diferentes estreitamentos luminais. Hoje mostraremos a você dois modelos diferentes para induzir estreitamento luminal: o modelo em camundongo utilizando um cateter balão para induzir lesão vascular e o modelo de esclerose arterial.Utilizando camundongos transgênicos na dieta ocidental, o modelo de cateter balão pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de estenose. O modelo de camundongo transgênico homozigoto com mutação no gene E superior é utilizado para estudar a fisiopatologia da aterosclerose. Para o modelo de hiperplasia intimal, obtenha camundongos C57BL/6J que pesem cerca de 25 gramas.Mantenha-os em condições normais com uma dieta padrão. Após anestesiar o camundongo com 2% de isoflurano, remova os pelos abdominais, administre carprofeno por injeção subcutânea para analgesia. Em seguida, desinfete alternativamente a pele com iodo de provo e etanol 80% em dois ciclos.Agora, verifique a ausência de reflexos utilizando uma pinça no dedo do pé. Inicie a cirurgia separando a pele e o músculo ao longo da linha alba. Em seguida, envolva os intestinos em uma luva umedecida com soro fisiológico e, com atenção, remova o tecido adiposo, expondo a aorta abdominal.Agora exponha a aorta infrarrenal até sua bifurcação, tomando cuidado para não lesar nenhum vaso colateral. Em seguida, clamp a aorta.Primeiro, coloque uma pinça microcirúrgica na aorta infrarrenal proximal para interromper o fluxo sanguíneo. Em seguida, aplique uma segunda pinça distal próxima à bifurcação aórtica. Quando o fluxo sanguíneo for interrompido, faça uma pequena incisão na aorta próxima à pinça proximal.Insira o cateter em direção ao grampeamento distal da aorta para provocar uma lesão endotelial. Desnude a aorta insuflando cuidadosa e lentamente o balão do cateter e puxando-o em direção ao grampeamento proximal. Repita esta manobra duas vezes, perfazendo um total de três insuflações da aorta.Agora remova o cateter e feche a incisão aórtica utilizando suturas contínuas de prolen 10-0. Com as suturas posicionadas, abra cuidadosamente o clamp distal se houver sangramento no local da autotomia da AOR. Feche novamente o clamp, localize o sangramento e interrompa-o com pontos separados adicionais.Quando não houver sangramento, abra lentamente o clamp proximal. Deve ser visível um pulso aórtico distal à incisão. Agora, organize os intestinos em C dois.Em seguida, feche a parede abdominal iniciando pela camada muscular, utilizando seis suturas contínuas de proline OTT. Depois, feche a pele com cinco suturas OTT e transfira o camundongo de volta para sua gaiola. Durante os três primeiros dias pós-operatórios, forneça metrazol na água de beber para controle da dor.Monitore o animal durante toda a sua recuperação, que dura cerca de 28 dias. Para o modelo de aterosclerose, obtenha camundongos deficientes em A POE com quatro semanas de idade. Mantenha esses camundongos em condições padrão com uma dieta ocidental rica em lipídios por quatro a seis meses.Mantenha esta dieta durante todo o experimento. Seis horas antes da coleta da aorta, retire o acesso à comida. Em seguida, prepare o camundongo para cirurgia conforme descrito na seção anterior.Inicie a cirurgia abrindo o tórax. Em seguida, corte o ápice do coração e realize a perfusão sob pressão suave com três mililitros de paraformaldeído 4% pela raiz aórtica para fixar a aorta. Depois, libere a aorta desde a raiz até sua bifurcação.Tente remover o máximo possível do tecido adiposo. Em seguida, corte o arco aórtico e armazene-o em paraformaldeído 4%. Agora, transfira o coração e a árvore aórtica para um recipiente revestido com silicone contendo PBS no recipiente.Corte uma extremidade da árvore aórtica e fixe-a na camada de silicone com pinos finos. Abra a aorta longitudinalmente e deixe o tecido aórtico repousar em PBS à temperatura ambiente por alguns minutos. Em seguida, lave o tecido uma vez com etanol 50% e imerja-o em um banho de Sudan.Três, solução de coloração por cerca de 15 minutos. Após a coloração, enxágue rapidamente o tecido com etanol a 50% por alguns segundos para remover apenas o excesso de Sudan. Um enxágue excessivo removerá muita coloração; imediatamente enxágue o tecido com água destilada e prossiga com a obtenção de imagens. Para o modelo de hiperplasia miointimal, aortas de camundongos desnudadas foram coletadas, incluídas em parafina e coradas com cromo. As razões Im foram calculadas a partir de cortes corados com tricrômio mediante a medição da espessura da íntima e da média.Utilizando análise computadorizada seguida pelo cálculo da razão, a espessura máxima da placa foi medida como a espessura íntima máxima no lúmen por meio da morfometria computadorizada. A porcentagem de obliteração luminal foi calculada como a razão entre o novo lúmen interno e o lúmen anterior. A área da placa foi calculada subtraindo-se o novo lúmen interno do lúmen anterior.As mesmas análises foram realizadas em cortes transversais corados com tricrômio do modelo de aterosclerose na valva aórtica, no arco aórtico e na aorta descendente, apenas para o modelo de aterosclerose. A aorta descendente foi aberta longitudinalmente e corada com vermelho de sudan. A área da placa e a área total da aorta foram medidas com auxílio de um computador para análise de ambos os modelos.Outros métodos, como a histopatologia e a microscopia confocal por imunofluorescência, podem ser realizados para responder perguntas como ablação luminar, morfologia e celularidade. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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O mouse modelo de lesão fio artéria femoral de reestenose é tecnicamente desafiador. Neste protocolo, mostrar os principais detalhes técnicos essencial para a realização com êxito lesão fio para induzir neoï¿½tima consistente para estudos de reestenose.

Um modelo murino de Arterial Restenosis: Aspectos Técnicos do Femoral Injury Fio

Este estudo descreve um procedimento invasivo para a indução de aterosclerose acelerada em camundongos. Em comparação com outros métodos que utilizam lesões elétricas ou induzidas por criodes, a lesão induzida por mecânica imita a condição humana da restenose após terapias de revascularização e é ideal para o estudo dos mecanismos moleculares envolvidos.

Indução de Aterosclerose Acelerada em Camundongos: O Modelo de "Lesão por Fio"

Este artigo demonstra um modelo murino para estudar o desenvolvimento de hiperplasia myointimal (MH) após lesão aórtica balão.

Lesão baseada no balão para induzir a hiperplasia Myointimal da Aorta Abdominal de Mouse

Os modelos murinos de aterosclerose são ferramentas úteis para investigar vias patogênicas em nível molecular, mas necessitam de quantificação padronizada do desenvolvimento da lesão. Este protocolo descreve um método aperfeiçoado para determinar o tamanho da lesão nos vasos arteriais principais que incluem a raiz aórtica, o arco aórtico, e a artéria braquiocefálico.

Quantificação da aterosclerose em camundongos

Este artigo demonstra uma abordagem cirúrgica eficiente para estabelecer isquemia aguda em camundongos com uma pequena incisão. Essa abordagem pode ser aplicada pela maioria dos grupos de pesquisa sem quaisquer atualizações laboratoriais.

Um modelo cirúrgico modificado de isquemia de membros traseiros em ApoE-/- Ratos usando uma incisão em miniatura

Aqui apresentamos um modelo murino para anastomose da artéria femoral, oferecendo aos pesquisadores um modelo animal valioso para estudar e simular a estenose da anastomose vascular. Esse desenvolvimento é crucial para avançar nossa compreensão da fisiopatologia subjacente a essa condição e facilitar pesquisas mais precisas e eficazes sobre doenças vasculares.

Desenvolvimento de um modelo murino para estenose anastomótica da artéria femoral

O manguito constricting apresentado neste artigo é projetado para induzir a aterosclerose na artéria carótida comum murino. Devido à forma cônica de sua luz interior do manguito implantado gera regiões bem definidas de baixa, alta tensão e de cisalhamento oscilatório desencadear o desenvolvimento de lesões ateroscleróticas de diferentes fenótipos inflamatórios.

Implantação de um Cuff Carotid para Triggering Shear-estresse aterosclerose induzida em camundongos

Aprenda a induzir miointimal hiperplasia e aterosclerose em camundongos usando cateterização com balão e dieta rica em lipídios. Estes modelos ajudam pesquisadores a estudar mecanismos de estenose arterial.

Induzir miointimais Hiperplasia Versus aterosclerose em camundongos: uma introdução de dois modelos válidos

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