Induzir miointimais Hiperplasia Versus aterosclerose em camundongos: uma introdução de dois modelos válidos

O objetivo geral do experimento a seguir é apresentar dois modelos animais válidos que levam ao estreitamento da aorta por meio de mecanismos diferentes. O primeiro modelo é a cateterização com balão da aorta para induzir o desenvolvimento de hiperplasia miointimal. Primeiro, a aorta abdominal infrarrenal é exposta e clampada.

Em seguida, a aorta é aberta com uma incisão transversal e o cateter com balão é introduzido. O endotélio da aorta é então desnudado com o cateter inflado e a cirurgia é concluída. O segundo modelo é uma manipulação dietética de camundongos transgênicos nulos para APOE para induzir placas ateroscleróticas.

Esses camundongos são mantidos em condições padrão e alimentados com uma dieta ocidental rica em lipídios por quatro a seis meses. Em última análise, a análise histológica da hiperplasia miointimal induzida cirurgicamente e do modelo de restrição dietética mostra que eles resultam em diferentes estreitamentos luminais. Hoje mostraremos a você dois modelos diferentes para induzir estreitamento luminal: o modelo em camundongo utilizando um cateter balão para induzir lesão vascular e o modelo de esclerose arterial.

Utilizando camundongos transgênicos na dieta ocidental, o modelo de cateter balão pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de estenose. O modelo de camundongo transgênico homozigoto com mutação no gene E superior é utilizado para estudar a fisiopatologia da aterosclerose. Para o modelo de hiperplasia intimal, obtenha camundongos C57BL/6J que pesem cerca de 25 gramas.

Mantenha-os em condições normais com uma dieta padrão. Após anestesiar o camundongo com 2% de isoflurano, remova os pelos abdominais, administre carprofeno por injeção subcutânea para analgesia. Em seguida, desinfete alternativamente a pele com iodo de provo e etanol 80% em dois ciclos.

Agora, verifique a ausência de reflexos utilizando uma pinça no dedo do pé. Inicie a cirurgia separando a pele e o músculo ao longo da linha alba. Em seguida, envolva os intestinos em uma luva umedecida com soro fisiológico e, com atenção, remova o tecido adiposo, expondo a aorta abdominal.

Agora exponha a aorta infrarrenal até sua bifurcação, tomando cuidado para não lesar nenhum vaso colateral. Em seguida, clamp a aorta.

Primeiro, coloque uma pinça microcirúrgica na aorta infrarrenal proximal para interromper o fluxo sanguíneo. Em seguida, aplique uma segunda pinça distal próxima à bifurcação aórtica. Quando o fluxo sanguíneo for interrompido, faça uma pequena incisão na aorta próxima à pinça proximal.

Insira o cateter em direção ao grampeamento distal da aorta para provocar uma lesão endotelial. Desnude a aorta insuflando cuidadosa e lentamente o balão do cateter e puxando-o em direção ao grampeamento proximal. Repita esta manobra duas vezes, perfazendo um total de três insuflações da aorta.

Agora remova o cateter e feche a incisão aórtica utilizando suturas contínuas de prolen 10-0. Com as suturas posicionadas, abra cuidadosamente o clamp distal se houver sangramento no local da autotomia da AOR. Feche novamente o clamp, localize o sangramento e interrompa-o com pontos separados adicionais.

Quando não houver sangramento, abra lentamente o clamp proximal. Deve ser visível um pulso aórtico distal à incisão. Agora, organize os intestinos em C dois.

Em seguida, feche a parede abdominal iniciando pela camada muscular, utilizando seis suturas contínuas de proline OTT. Depois, feche a pele com cinco suturas OTT e transfira o camundongo de volta para sua gaiola. Durante os três primeiros dias pós-operatórios, forneça metrazol na água de beber para controle da dor.

Monitore o animal durante toda a sua recuperação, que dura cerca de 28 dias. Para o modelo de aterosclerose, obtenha camundongos deficientes em A POE com quatro semanas de idade. Mantenha esses camundongos em condições padrão com uma dieta ocidental rica em lipídios por quatro a seis meses.

Mantenha esta dieta durante todo o experimento. Seis horas antes da coleta da aorta, retire o acesso à comida. Em seguida, prepare o camundongo para cirurgia conforme descrito na seção anterior.

Inicie a cirurgia abrindo o tórax. Em seguida, corte o ápice do coração e realize a perfusão sob pressão suave com três mililitros de paraformaldeído 4% pela raiz aórtica para fixar a aorta. Depois, libere a aorta desde a raiz até sua bifurcação.

Tente remover o máximo possível do tecido adiposo. Em seguida, corte o arco aórtico e armazene-o em paraformaldeído 4%. Agora, transfira o coração e a árvore aórtica para um recipiente revestido com silicone contendo PBS no recipiente.

Corte uma extremidade da árvore aórtica e fixe-a na camada de silicone com pinos finos. Abra a aorta longitudinalmente e deixe o tecido aórtico repousar em PBS à temperatura ambiente por alguns minutos. Em seguida, lave o tecido uma vez com etanol 50% e imerja-o em um banho de Sudan.

Três, solução de coloração por cerca de 15 minutos. Após a coloração, enxágue rapidamente o tecido com etanol a 50% por alguns segundos para remover apenas o excesso de Sudan. Um enxágue excessivo removerá muita coloração; imediatamente enxágue o tecido com água destilada e prossiga com a obtenção de imagens. Para o modelo de hiperplasia miointimal, aortas de camundongos desnudadas foram coletadas, incluídas em parafina e coradas com cromo. As razões Im foram calculadas a partir de cortes corados com tricrômio mediante a medição da espessura da íntima e da média.

Utilizando análise computadorizada seguida pelo cálculo da razão, a espessura máxima da placa foi medida como a espessura íntima máxima no lúmen por meio da morfometria computadorizada. A porcentagem de obliteração luminal foi calculada como a razão entre o novo lúmen interno e o lúmen anterior. A área da placa foi calculada subtraindo-se o novo lúmen interno do lúmen anterior.

As mesmas análises foram realizadas em cortes transversais corados com tricrômio do modelo de aterosclerose na valva aórtica, no arco aórtico e na aorta descendente, apenas para o modelo de aterosclerose. A aorta descendente foi aberta longitudinalmente e corada com vermelho de sudan. A área da placa e a área total da aorta foram medidas com auxílio de um computador para análise de ambos os modelos.

Outros métodos, como a histopatologia e a microscopia confocal por imunofluorescência, podem ser realizados para responder perguntas como ablação luminar, morfologia e celularidade. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.