Name: Analisando o movimento da Nauplius Artemia salina Por Optical Rastreamento de plasmônicos Nanopartículas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: Aprenda a analisar frequências de movimento de microorganismos aquáticos usando nanopartículas plasmônicas e pinças ópticas. Este método permite medir vibrações fluídicas sem restrições de resolução óptica.

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O apoio financeiro pela ERC através da avançada Investigator Grant HYMEM, pelo DFG através da Iniciativa Nanosystems Munich (NIM) e através do Sonderforschungsbereich (SFB1032), projeto A8 é reconhecido agradecimento. Somos gratos ao Dr. Alexander Ohlinger, Dr. Sol Carretero-Palacios e Spas Nedev de apoio e discussões frutíferas.

1. Setup Experimental <ol><li> Use um microscópio de up-direito e um óleo de condensador de campo escuro com uma abertura numérica (NA) = 1,2 para a iluminação de campo escuro. Utilize uma objectiva de imersão em água com aumento de 100X e uma NA = 1.0 para observações de partículas e trapping. Use um objetivo ar com aumento de 10x e uma NA = 0,2 para seguir o movimento do Nauplius. </li><li> Use uma configuração de pinça óptica com 1.064 nm laser de onda contínua acoplado ao microscópio vertical. Defina a potência do laser da armadilha óptica a 100 mW (medido com um medidor de energia após a objetiva). </li><li> Use uma câmera de alta velocidade CMOS ou uma reflex digital de lente única (DSLR) para detectar e imagem do movimento de partículas de ouro na armadilha óptica e o movimento do Nauplius. </li><li> Usar um filtro de entalhe para evitar que o laser de entrar na câmara. </li><li> Use um medidor de potência para medir a potência do laser após a objetiva. </li></ol> 2. Preparação de Amostras </p&gt; <ol><li> Pipetar uma gota de água (180 mL) em uma lâmina de vidro de microscópio e posicionar a amostra no microscópio de campo escuro. </li><li> Pipetar um Nauplius de um pequeno tanque de água à gota de água. </li><li> Usar um objectivo ar 10X para observar o movimento da Nauplius na solução e gravar um fluxo de vídeo. </li><li> Use uma nanopartícula de ouro com um diâmetro de 60 nm, como um detector para observar o movimento de fluido gerado pelo Nauplius. Por conseguinte, adicionam-se 5 mL de uma solução de partículas altamente diluído na gotícula de água, de modo que aproximadamente uma partícula pode ser visto no campo de visão com uma objectiva de imersão em água 100X. </li></ol> 3. Particle Experiment Rastreamento <ol><li> Armadilha uma nanopartícula de ouro com a pinça óptica. Portanto, trazer a 1.064 nm armadilhas a laser perto de uma nanopartícula de ouro que está difundindo em solução movendo o estágio do microscópio. As forças ópticas atraentes puxar a nanopartícula de ouro para o ponto focal do the feixe de laser. A partícula aprisionada não está a difundir mais e em vez mantém a sua posição. Faça um fluxo de vídeo da nanopartícula preso com a câmera DSLR em uma taxa de quadros de 50 Hz por 30 segundos. </li><li> Desligue o laser da pinça óptica e solte a nanopartículas de ouro da armadilha. </li><li> Use um programa de rastreamento de partículas para a leitura da posição da partícula de ouro opticamente preso em cada quadro do fluxo de vídeo. Uma transformação rápida de Fourier (FFT) de xy-posição da partícula ao longo do tempo revela um espectro de freqüência. NOTA: Aqui, um &quot;IGOR PRO &#39;código de programa de computador auto-escrito foi utilizado para analisar a posição central da partícula no plano xy com o tempo e para a análise FFT. </li><li> Como uma alternativa a um código IGOR auto-escrita usar o programa livremente disponível &#39;Spots Rastreio&#39; para controlar a partícula no vídeo. Use o software comercial &quot;Origin&quot; para executar a transformação de Fourier dos dados de rastreamento: <ol&gt; <li> Arraste o arquivo de vídeo para o programa aberto &#39;Video Ponto Rastreador&#39;. </li><li> Clique do mouse sobre a partícula visto na primeira foto do fluxo de vídeo e uma região circular de aparecer juros. </li><li> Escolha &quot;simétrica&quot; ​​e &quot;otimizar&quot; na janela do prompt de comando top para otimizar o acompanhamento da partícula. </li><li> Clique do mouse &quot;logging&quot; na janela do prompt de comando superior e escolha uma pasta para guardar os dados. Os dados de monitoramento serão guardados como uma planilha de dados. </li><li> Clique do mouse &quot;video jogo&quot; no prompt de comando janela esquerda do programa de rastreamento e espere até que são analisados ​​todos os quadros do vídeo. </li><li> Feche o programa e abra a planilha de dados salvos com &#39;Origem&#39;. Defina os valores de coluna como &quot;y 1&quot; e &quot;y 2&quot;. </li><li> Definir intervalos de tempo para cada quadro do vídeo como &quot;x&quot; da planilha de dados &#39;Origem&#39;. </li><li> Marque a x-Posição da coluna e realizar uma FFT, escolhendo &quot;Análise de Dados&quot; e &quot;FFT&quot; na janela do prompt de comando top. Repita o passo para a coluna posição y. </li><li> Traçar as amplitudes do sinal FFT calculado em x-e y-direção em relação a freqüência. </li></ol></li></ol> 4. Simulação Numérica <ol><li> Calcular as α polarizabilidade da partícula de ouro de 60 nm, utilizando o programa de computador &#39;Mathematica&#39;. <ol><li> Utilizar a equação (1) para calcular a polarizabilidade de acordo com Kuwata et al 16.: <img alt="Equação 1" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51502/51502eq1.jpg" width="300" /> (1) </li><li> Definir os seguintes três parâmetros no código do programa: a função dielétrica complexa dependente do comprimento de onda da partícula de ouro, o raio de nanopartículas, eo índice de refração do meio circundante. </li></ol></li><li> Use a descrição dos elecdistribuição de campo tric de um feixe focalizado de acordo com Gaussian Agayan et al 17 para calcular as forças ópticas que agem em uma partícula de ouro de 60 nm.: <img alt="Equação 2" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51502/51502eq2.jpg" width="500" /> (2) <ol><li> . Utilização das equações (3) - (6) a partir de Agayan et al 17 para calcular tanto, o gradiente e dispersar as forças que actuam sobre a partícula: <img alt="Equação 3" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/51502/51502eq3.jpg" width="350" /> (3) <img alt="Equação 4" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51502/51502eq4.jpg" width="300" /> (4) <img alt="Equação 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51502/51502eq5.jpg" width="500" /> (5) <img alt="Equação 6" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51502/51502eq6.jpg" width="300" /> (6) </li><li> No código de programa, definir os parâmetros para a potência do laser, a abertura numérica da oobjective, ea polarizabilidade complexo das nanopartículas. </li><li> Soma-se a força do gradiente ea força de dispersão para calcular a força óptica total atuando sobre a partícula de ouro em uma armadilha óptica. </li></ol></li><li> Execute a simulação pressionando simultaneamente &quot;Control&quot; e &quot;Enter&quot;. </li></ol>

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<li>Agayan, R. R., Gittes, F., Kopelman, R., Schmidt, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+trapping+near+resonance+absorption%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Optics%22%5BJournal%5D)">Optical trapping near resonance absorption.</a> Applied Optics. 41 (12), 2318-2327 (2002).</li>
<li>Klar, T., Perner, M., Grosse, S., von Plessen, G., Spirkl, W., Feldmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface-Plasmon+Resonances+in+Single+Metallic+Nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Surface-Plasmon Resonances in Single Metallic Nanoparticles.</a> Physical Review Letters. 80, 4249-4252 (1998).</li>
<li>Ohlinger, A., Nedev, S., Lutich, A. A., Feldmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optothermal+Escape+of+Plasmonically+Coupled+Silver+Nanoparticles+from+a+Three-Dimensional+Optical+Trap%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Optothermal Escape of Plasmonically Coupled Silver Nanoparticles from a Three-Dimensional Optical Trap.</a> Nano Letters. 11 (4), 1770-1774 (2011).</li>
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<li>Urban, A. S., Fedoru, K. M., Nedev, S., Lutich, A., Lohmueller, T., Feldmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shrink-to-fit+Plasmonic+Nanostructures%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Optical+Materials%22%5BJournal%5D)">Shrink-to-fit Plasmonic Nanostructures.</a> Advanced Optical Materials. 1 (2), 123-127 (2013).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Microscopia de campo escuro é uma poderosa ferramenta para a visualização de nanopartículas de ouro com dimensões inferiores ao limite de difração óptica, uma vez que a seção de espalhamento transversal das nanopartículas metálicas superior à sua seção transversal geométrica (cf. Figura 2A) 18. Em uma configuração de pinça, esta abordagem ainda permite distinguir se apenas um único ou vários nanopartículas de ouro são presos pelo feixe de laser porque acoplamento plasmônica entre as partícula...

Avaliação da qualidade da água com base em indicadores químicos e biológicos é de fundamental importância para obter insights sobre as condições de estado e ambientais de um ecossistema aquático 1-3. Os métodos clássicos de análise química de água baseiam-se em propriedades organolépticas ou a determinação dos parâmetros físico-químicos. Os indicadores biológicos, por outro lado, são as espécies animais cuja presença e viabilidade fornecer informações sobre as condições ambientais e os efeitos de poluentes para um ecossistema que elas ocorrem dentro Exemplos típicos de bioindicadores são copépodes, um grupo de pequenos crustáceos de água, que pode ser encontrados em praticamente qualquer habitat de água 4,5. Observando-se a actividade e a viabilidade destas espécies a partir de uma amostra de água pode assim ser utilizada para obter informação sobre as condições gerais de um ecossistema 5. As larvas de copépodes, que são chamados Nauplii, use traços rítmicos de suas antenas (cada larva tem três pares de appendages em sua região da cabeça) para nadar em água 6. A freqüência ea intensidade desses cursos é, assim, um indicador direto de idade, fitness, e as condições ambientais do animal 7-10. Quaisquer investigações sobre estes espécimes são geralmente feito com um microscópio, observando e contando os cursos de antena do Nauplii diretamente. Devido ao seu tamanho (~ 100-500 mm) 11, isso muitas vezes requer a fazer medições de um por um, ou para corrigir um único Nauplius a um substrato. Aqui, nós demonstramos uma nova abordagem para observar a atividade de Copépode larvas em amostras de água usando uma nanopartícula de ouro opticamente preso como um detector ultra-sensível. As pinças ópticas são geralmente usados ​​por muitos grupos como uma ferramenta experimental multa a aplicar ou medir forças entre as moléculas até a faixa piconewton 12-14. Mais recentemente, a gama de aplicações para pinça óptica foi expandida para observar vibrações acústicas e resolverflutuações nt em meios líquidos, monitorando o movimento de nano e micropartículas que estão confinados em uma armadilha óptica 15. As partículas que são imersos num líquido são submetidos a movimento Browniano. Dentro de uma armadilha óptica, no entanto, este movimento é parcialmente amortecido por um laser induzida, força forte, gradiente. Por conseguinte, a rigidez da armadilha óptica e a localização da partícula no interior do foco do feixe de laser pode ser afinado pela potência de laser. Ao mesmo tempo, é possível revelar características sobre o potencial de captura e a análise da interacção de moléculas com o de partículas através da monitorização do movimento das partículas em função do tempo na armadilha. Esta abordagem torna possível para pegar a freqüência, intensidade e direção do movimento fluídico que é gerado por um objeto em movimento em seu ambiente líquido. Demonstramos como esta ideia geral pode ser aplicada para obter um espectro de o movimento de um indivíduo Nauplius frequência sem o requisitode interferir diretamente com o modelo. Esta abordagem experimental apresenta um novo conceito geral para a observação do comportamento de motilidade das amostras aquáticas de uma forma muito sensível. Para observações sobre as espécies bioindicadoras, isso poderia expandir a atual metodologia para análise de água e pode ser aplicado para obter informações sobre a saúde ea integridade dos ecossistemas aquáticos.

<table><tbody><tr><td>Microscópio Zeiss Axio Scope.A1</td><td>Carl Zeiss</td><td>490035-0012-000</td><td>iluminação de campo escuro</td></tr><tr><td>Objetivo de água Achroplan</td><td>Carl Zeiss</td><td>440087 ampliação de</td><td>100X, NA = 1,0</td></tr><tr><td>Objetivo de ar Epiplan</td><td>Carl Zeiss</td><td>442934</td><td>ampliação de 10X, NA = 0,2</td></tr><tr><td>Condensador de óleo de campo escuro</td><td>Carl Zeiss</td><td>445323</td><td>NA = 1,2</td></tr><tr><td>Cobolt Rumba CW 1.064 nm DPSSL</td><td>Cobolt</td><td>1064-05-01-2000-500</td><td>1.064 nm, CW, &lambda; = 1.064 nm, 2 Watt, TEM00</td></tr><tr><td>Expansor de feixe</td><td>Edmund Optics</td><td></td><td>Parte nº 1064 2-8X 64414</td></tr><tr><td>Câmera de Alta Velocidade Dimax HD</td><td>PCO. Câmera Colorida da Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Canon EOS 500 D&nbsp;</td><td>Canon</td><td></td><td>FAQ-ID: 8201395700</td></tr><tr><td>Filtro de entalhe StopLine 532/1064</td><td>Semrock</td><td>A11149-711265 Nº do</td><td>artigo. NF01-532U</td></tr><tr><td>Água&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Náuplio Artemia salina</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Colóide de ouro</td><td>BBInternational</td><td>Batch 13741&nbsp;</td><td>Diâmetro 60 nm</td></tr><tr><td>MQMie Versão 3.2&nbsp;</td><td>Dr. Michael Quinten</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mathematica 8.0</td><td>Wolfram</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Comsol Multiphysics 4.0&nbsp;</td><td>COMSOL, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

analisando o movimento da nauplius &#39;<em&gt; artemia salina</em&gt; &#39;por optical rastreamento de plasmônicos nanopartículas

Analyzing the Movement of the Nauplius 'Artemia salina' by Optical Tracking of Plasmonic Nanoparticles

Demonstramos como pinças ópticas podem proporcionar um instrumento sensível para analisar as vibrações geradas fluídicos pelo movimento de pequenos organismos aquáticos. Uma única nanopartícula de ouro mantida por uma pinça óptica é usado como um sensor para quantificar o movimento rítmico de uma larva Nauplius (Artemia salina) em uma amostra de água. Isto é conseguido através da monitorização do tempo de deslocamento dependente da nanopartícula preso, como consequência da actividade Nauplius. Uma análise de Fourier da posição da nanopartícula proporciona então um espectro de frequência, que é característica para o movimento das espécies observadas. Esta experiência demonstra a capacidade deste método para medir e caracterizar a actividade de pequena larvas aquático sem a necessidade de observar directamente e para obter informações sobre a posição das larvas no que diz respeito à partícula aprisionada. No geral, esta abordagem poderia dar uma visão sobre a vitalidade de certas espécies encontradas em um e aquáticocosystem e poderia ampliar o leque de métodos convencionais para análise de amostras de água.

Uma ilustração esquemática da configuração experimental é mostrado na Figura 1A. A configuração de campo escuro é necessário para detectar opticamente a deslocação de uma partícula de ouro de 60 nm de uma armadilha óptica 15. O comprimento de onda de 1.064 nm para o laser trapping é escolhido para garantir um confinamento estável do detector de partículas de ouro 12,14. Um divisor de feixe no microscópio é utilizado para focar o feixe através de aprisionamento do objectivo e um fil...

Usamos rastreamento óptico de nanopartículas plasmonic para investigar e caracterizar os movimentos de organismos aquáticos de freqüência.

Analisando o movimento da Nauplius &#39;<em&gt; Artemia salina</em&gt; &#39;Por Optical Rastreamento de plasmônicos Nanopartículas

We demonstrate how optical tweezers may provide a sensitive tool to analyze the fluidic vibrations generated by the movement of small aquatic organisms. A ...

O objetivo geral deste procedimento é analisar as frequências do movimento de um micro-organismo aquático utilizando uma nanopartícula plasmônica aprisionada opticalmente. Isso é realizado primeiramente observando larvas OPIS na água sob um microscópio, equipado com uma pinça óptica e uma câmera. O segundo passo é adicionar nanopartículas de ouro com diâmetro de 16 nanômetros ao ambiente das larvas OPIS.Em seguida, a pinça óptica é utilizada para aprisionar uma única nanopartícula de ouro próxima às NOIs. O passo final consiste em observar a difusão da nanopartícula aprisionada enquanto é influenciada pelo movimento das Nous. Dados em vídeo são capturados e analisados por meio de um software de rastreamento de partículas.Por fim, a posição temporalmente dependente da nanopartícula é transformada para o espaço de Fourier para extrair as frequências de movimento das nanopartículas. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como a microscopia comum, é que as vibrações fluidas são analisadas e, portanto, este método não é limitado por qualquer resolução óptica. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de ambientalismo, como a análise da água em ecossistemas socráticos.Inicie preparando um microscópio ereto equipado para iluminação em campo escuro. Forneça ao microscópio uma objetiva de imersão em água e uma objetiva de ar. Além disso, acople um pinça óptica de onda contínua de 1064 nanômetros ao microscópio.Em seguida, acople uma câmera com um filtro de rejeição em 1064 nanômetros para detectar e imaginar o movimento das partículas de ouro e do opus. Use um medidor de potência após a objetiva para ajustar a potência do laser a 1000 miliwatts. Desligue o laser até que seja necessário.O preparo da amostra começa com a pipetagem de uma gota de água de 180 microlitros sobre uma lâmina de microscópio. Neste momento, posicione a amostra no microscópio de campo escuro, pipete OPIS de um tanque de água e transfira-o para a gota de água.Selecione a objetiva aérea de 10 x. Observe o movimento do OPIS na solução e grave um fluxo de vídeo de dez segundos a 25 quadros por segundo. Quando isso for concluído, prepare-se para a próxima etapa.Dilua uma parte da solução estoque de nanopartículas de ouro com diâmetro de 60 nanômetros em 100 partes de água. Retorne ao microscópio e meça cinco microlitros da solução. Adicione isso à gota d'água com opus.Quando pronto, mude para uma objetiva de imersão em água de 100 x. Para visualizar a gota de água, prossiga quando aproximadamente uma nanopartícula de ouro puder ser vista no campo de visão. Para aprisionar uma partícula, ligue o laser do armadilhamento óptico e observe a gota.Mova a platina do microscópio para aproximar o feixe laser de uma nanopartícula de ouro. A partícula será atraída em direção ao ponto focal do feixe laser e deixará de difundir. Grave um vídeo da nanopartícula aprisionada a 50 quadros por segundo durante 30 segundos, depois desligue o laser da pinça óptica para liberar a partícula do aprisionamento.O próximo passo é analisar o vídeo em um computador. Utilize um software de rastreamento de partículas para determinar a posição XY da partícula como uma função do tempo e encontre o espectro de frequência por meio de uma transformada rápida de Fourier desses dados. Este gráfico mostra o deslocamento XY de uma nanopartícula de ouro aprisionada, que está apenas em movimento browniano.A distribuição é gaussiana. Após adicionar um OIS à água, o deslocamento XY da partícula muda devido a vibrações fluidicas. O fluxo microfluídico gerado pelo animal causa uma distorção dependente da frequência na direção Y.Esses gráficos mostram os espectros de frequência nas direções x e y em preto, um espectro de referência para uma partícula aprisionada opticalmente que não está na presença de opis. As curvas vermelhas mostram os espectros de uma partícula aprisionada com um opis nadador. O espectro na direção X não apresenta um sinal forte devido à posição do OPIS em relação à partícula aprisionada.O fluxo é principalmente na direção Y, conforme indicado na inserção. O espectro na direção Y, obtido com os controles de natação, mostra uma resposta. A resposta ampla em frequência na medição é consistente com a motilidade do organismo, por exemplo, o movimento da antena principal ou outras partes do corpo.Máximos de frequência. Em todas as medições, foram encontrados entre 3,0 e 7,2 hertz, em bom acordo com as frequências observadas diretamente. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em menos de 30 minutos, se for executada corretamente.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de manter um aprisionamento tridimensional estável da nanopartícula de ouro utilizando forças ópticas.

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