De Voxels ao Conhecimento: Um Guia Prático para a segmentação do Complexo Microscopia Eletrônica 3D-Data

O objetivo geral do experimento a seguir é segmentar características de interesse de conjuntos complexos de dados de microscopia eletrônica 3D de células e tecidos para análise de sua nação organizadora 3D. Isso é obtido coletando um conjunto de dados que consiste em imagens individuais de microscopia eletrônica. Os dados 2D brutos são então reconstruídos em um volume 3D e filtrados para reduzir o ruído e os recursos aprimorados de interesse como uma segunda etapa, as características objetivas e subjetivas dos dados são avaliadas para informar a melhor escolha de método para segmentação.

Em seguida, abstraído manualmente, geração de modelo, rastreamento manual de recursos de interesse. A segmentação automatizada baseada em densidade ou a segmentação automatizada personalizada são realizadas para extrair os recursos de interesse. Os resultados mostram modelos finais segmentados em 3D de recursos de interesse com base nas características da imagem de triagem e objetivos pessoais para escolher a abordagem de segmentação ideal.

Uma comparação entre as diferentes abordagens para os diferentes conjuntos de dados ajudará a selecionar a estratégia de segmentação correta. Demonstramos diferentes métodos para a extração de características de interesse. Dada a complexidade dos volumes de eletromicroscopia subcelular, cada abordagem tem suas vantagens e limitações.

Geralmente, os indivíduos novos na segmentação podem ter dificuldades porque nem sempre é claro identificar a melhor abordagem para diferentes conjuntos de dados. Junto com o desabafo de estudantes de pós-graduação. Tai demonstrando o procedimento será BU como pós-doutorado em carros.

Em meu laboratório, Amit Hassan, um pesquisador associado em meu laboratório e Joaquin Korea, um engenheiro de sistemas de computação em meu laboratório A geração de modelos abstratos manuais é usada quando o único objetivo é criar um modelo geométrico para fazer medições geométricas. Para começar, importe o volume de dados para um programa adequado. Para geração de modelo abstrato manual, o software kymera é usado nesta demonstração.

Primeiro selecione o arquivo e abra para abrir a caixa de diálogo abrir arquivo, navegue até o local do arquivo do mapa desejado. Em seguida, abra o visualizador de volume e selecione o estilo de exibição de recursos para exibir dados com diferentes estilos de renderização. Ajuste o limite para a exibição arrastando a barra vertical no histograma na janela do visualizador de volume.

Navegue pelo volume 3D para selecionar uma área de interesse para segmentação e cortar um subvolume menor, se necessário. Na caixa de diálogo do visualizador de volume, selecione feições, seleção de sub-região, clique e arraste para criar uma caixa retangular ao redor da região de interesse. Em seguida, coloque marcadores ao longo do recurso de interesse e conecte-os com ligantes, quando apropriado, até que o modelo esteja completo.

Para conseguir isso na barra de menus do visualizador de volume, selecione ferramentas, caixa de diálogo do rastreador de volume. Para abrir a caixa de diálogo do rastreador de volume, selecione arquivo, novo marcador. Pôr. Na caixa de diálogo do rastreador de volume, verifique o mouse, coloque marcadores em alta densidade, coloque marcadores nos dados, os planos movam e izem os marcadores, vinculem o novo marcador ao marcador selecionado e vinculem os marcadores selecionados consecutivamente.

Em seguida, na janela do rastreador de volume, selecione colocar marcadores usando o botão direito do mouse e insira raios para marcadores e links. Em seguida, clique com o botão direito do mouse nos dados do volume para começar a colocar os marcadores. Os marcadores serão conectados automaticamente na caixa de diálogo do rastreador de volume.

Selecione o arquivo, salve o marcador atual. Defina o marcador de fechamento do arquivo. Pôr. Abra um novo conjunto de marcadores para começar a construir um modelo em um segundo recurso desejado de interesse.

Utilize cores contrastantes entre conjuntos de marcadores para enfatizar as diferenças nos recursos. O rastreamento manual de recursos de interesse é uma abordagem demorada usada quando a densidade populacional é relativamente pequena e quando a precisão da extração de recursos é fundamental. Para começar, importe dados de volume para um programa com opções de rastreamento manual. Software.

Com esse recurso, geralmente oferece uma ferramenta básica de pincel. Nesta demonstração, o software Amira é usado para grandes tomos. Selecione dados abertos e clique com o botão direito do mouse no nome do arquivo rec.

Em seguida, clique em formatar, selecione raw como dados de disco grandes. Ok, e carregue. Selecione os parâmetros de dados brutos apropriados nas informações do cabeçalho e clique em OK.

Alterne e salve como um novo nome de arquivo. am. Para sequência de imagens 3D, selecione dados abertos e selecione o nome do arquivo tiff ou o nome do arquivo dot mrmc.

Em seguida, alterne, clique com o botão direito e selecione salvar como nome de arquivo am. Na janela do visualizador 3D, selecione fatia ortogonal para abrir o arquivo de imagem. Em seguida, use um controle deslizante na parte inferior para navegar pelas fatias para cortar dados maiores abertos como dados de disco grandes.

Alterne o nome do arquivo na janela do pool, clique com o botão direito do mouse e selecione acesso à rede. Insira o tamanho da caixa desejada, mova a caixa para a área desejada e clique em aplicar. Salve o novo arquivo.

Em seguida, crie um arquivo de segmentação alternando o arquivo na janela do pool. Em seguida, clique com o botão direito do mouse e selecione o campo de rótulo de rotulagem. Um novo arquivo será criado e carregado automaticamente na guia do editor de segmentação, bem como no pool de objetos.

Use a ferramenta pincel para traçar a borda da primeira feição de interesse. Altere o tamanho do pincel conforme desejado e, em seguida, use o ponteiro do mouse para traçar a borda do recurso de interesse. Preencha a área traçada com o atalho F.Adicione a seleção clicando no botão com o símbolo de mais.

Siga o recurso de interesse por todas as fatias e repita a segmentação de rastreamento manual. Gere uma renderização de superfície para visualização e análise qualitativa ou quantitativa básica de acordo com as instruções do guia do usuário do software na guia do pool de objetos, alterne os rótulos de nome de arquivo na janela do pool. Em seguida, clique com o botão direito do mouse e selecione geração de superfície.

Selecione as propriedades de superfície desejadas e clique em aplicar. Um novo nome de arquivo de arquivo surf será criado no pool. Para visualizar o volume segmentado, alterne o nome do arquivo de navegação na janela do pool.

Em seguida, clique com o botão direito do mouse e selecione a visualização da superfície. Gere uma superfície para visualização e análise qualitativa, conforme descrito no protocolo de texto. A segmentação automatizada baseada em densidade é usada em conjuntos de dados com qualquer variedade de contraste, nitidez ou aglomeração para retirar as densidades de interesse para começar a importar dados de volume para um programa equipado com varinha mágica de limiar ou outras ferramentas baseadas em densidade para segmentação automática.

Como feito na técnica de rastreamento manual de recursos de interesse, o software Amira é usado nesta demonstração para recursos sem margens claramente distinguíveis. Use a ferramenta de limite selecionando o ícone de limite. Ajuste um controle deslizante para ajustar a densidade dentro do intervalo desejável, para que apenas os recursos de interesse sejam mascarados.

Clique no botão de seleção e, em seguida, adicione uma seleção clicando no botão com o símbolo de adição ou com o atalho. A gerar uma superfície para visualização e análise qualitativa conforme descrito no protocolo de texto. Tudo uma quarta abordagem.

A segmentação automatizada personalizada pode ser usada para segmentar com eficiência grandes conjuntos de dados, mas requer conhecimento em programas como o matlab. Consulte o vídeo suplementar sobre segmentação personalizada para obter instruções passo a passo sobre este método Seis conjuntos de dados de exemplo foram segmentados por quatro abordagens. Geração manual de modelos abstratos, rastreamento manual de recursos de interesse, segmentação automatizada baseada em densidade e segmentação automatizada personalizada A geração manual de modelos abstratos foi eficaz para a resina.

A tomografia corada embutida de estereocílios com o objetivo era criar um modelo para fins quantitativos, em vez de extrair densidades exatas para a tomografia corada embutida em resina da parede celular de uma planta. A segmentação automatizada baseada em densidade foi mais eficaz para extrair rapidamente a celulose através de muitas fatias. Os métodos manuais exigiam mais esforço em apenas algumas fatias de dados.

A geração manual de modelos abstraídos produziu o tripleto de microtúbulos na tomografia de estágio de cinocílio, enquanto as duas abordagens automatizadas extraíram as densidades mais rapidamente e, portanto, foram preferidas devido à forma das mitocôndrias a partir de feixes de íons focalizados, microscopia eletrônica de varredura de células epiteliais da mama. O rastreamento manual forneceu o resultado mais limpo e a baixa densidade populacional permitiu uma segmentação rápida. Dado o grande volume que precisava ser segmentado, a segmentação automatizada personalizada provou ser mais eficiente para segmentar os dados de bactérias de microscopia eletrônica de varredura facial de bloco serial.

Embora demorado, o único método para extrair a microscopia eletrônica de varredura por feixe de íons focalizado da membrana celular epitelial da mama foi o traçado manual. O desenvolvimento das abordagens de segmentação abre caminho para pesquisadores neste campo emergente da biologia celular estrutural explorarem e determinarem a arquitetura 3D celular no nível de complexos macromoleculares, organelas e células em uma grande variedade de cultura de células, cultura de organoides ou organismos modelo. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como escolher e aplicar a abordagem de segmentação ideal para seu conjunto de dados.