De Voxels ao Conhecimento: Um Guia Prático para a segmentação do Complexo Microscopia Eletrônica 3D-Data

O objetivo geral do experimento a seguir é segmentar características de interesse a partir de conjuntos de dados complexos de microscopia eletrônica 3D de células e tecidos, para análise de sua organização tridimensional. Isso é alcançado coletando um conjunto de dados composto por imagens individuais de microscopia eletrônica. Os dados brutos em 2D são então reconstruídos em um volume 3D e filtrados para reduzir o ruído e realçar as características de interesse; em um segundo passo, as características objetivas e subjetivas dos dados são avaliadas para orientar a melhor escolha do método de segmentação.

Em seguida, realiza-se a abstração manual, a geração de modelos ou o rastreamento manual de características de interesse. Realizam-se segmentações automatizadas baseadas em densidade ou segmentações automatizadas personalizadas para extrair as características de interesse. Os resultados mostram modelos segmentados tridimensionais finais das características de interesse, com base nas características da imagem triada e nos objetivos pessoais para escolher a abordagem de segmentação ideal.

Uma comparação entre as diferentes abordagens para os diversos conjuntos de dados ajudará a selecionar a estratégia correta de segmentação. Demonstramos diferentes métodos para a extração de características de interesse. Dada a complexidade dos volumes de microscopia eletrônica subcelular, cada abordagem possui suas vantagens e limitações.

Em geral, indivíduos novos na segmentação podem ter dificuldades porque identificar a melhor abordagem para diferentes conjuntos de dados nem sempre é claro. Juntamente com desabafos de estudantes de pós-graduação. Tai demonstrando o procedimento será BU como pós-doutorando de carro.

No meu laboratório, Amit Hassan, pesquisador associado no meu laboratório, e Joaquin Korea, engenheiro de sistemas de computação no meu laboratório, o modelo abstrato manual é utilizado quando o único objetivo é criar um modelo geométrico com o propósito de realizar medições geométricas. Para começar, importe o volume de dados para um programa apropriado. Para a geração de modelo abstrato manual, o software Kymera é utilizado nesta demonstração.

Primeiro, selecione o arquivo e abra para exibir a caixa de diálogo de abertura de arquivo; navegue até o local do arquivo do mapa desejado. Em seguida, abra o visualizador de volume e selecione o estilo de exibição de características para mostrar os dados com diferentes estilos de renderização. Ajuste o limite de exibição arrastando a barra vertical no histograma na janela do visualizador de volume.

Navegue pelo volume 3D para selecionar uma área de interesse para segmentação e recorte um subvolume menor, se necessário. No diálogo do visualizador de volume, selecione as características, seleção de sub-região, clique e arraste para criar uma caixa retangular ao redor da região de interesse. Em seguida, posicione marcadores ao longo da característica de interesse e conecte-os com ligantes quando apropriado até que o modelo esteja completo.

Para conseguir isso a partir da barra de menus do visualizador de volume, selecione ferramentas, diálogo do rastreador de volume. Para abrir o diálogo do rastreador de volume, selecione arquivo, novo conjunto de marcadores. No diálogo do rastreador de volume, marque o mouse, posicione marcadores em alta densidade, posicione marcadores nos dados, mova planos e dimensione marcadores, vincule novo marcador ao marcador selecionado e vincule marcadores consecutivamente.

Em seguida, na janela do rastreador de volume, selecione os marcadores usando o botão direito do mouse e insira os raios para os marcadores e ligações. Depois, clique com o botão direito nos dados de volume para começar a posicionar os marcadores. Os marcadores serão conectados automaticamente na caixa de diálogo do rastreador de volume.

Selecione o arquivo, salve o marcador atual. Defina e feche o marcador do arquivo. Abra um novo conjunto de marcadores para começar a construir um modelo em uma segunda característica de interesse.

Utilize cores contrastantes entre conjuntos de marcadores para enfatizar as diferenças nas características. O rastreamento manual de características de interesse é uma abordagem demorada, utilizada quando a densidade populacional é relativamente baixa e quando a precisão na extração das características é fundamental. Para começar, importe os dados de volume para um programa com opções de rastreamento manual.Software.

Com esta funcionalidade, geralmente oferece-se uma ferramenta básica de pincel. Nesta demonstração, o software Amira é utilizado para tomografias grandes. Selecione abrir dados e clique com o botão direito sobre o nome do arquivo rec.

Em seguida, clique em formatar, selecione "raw" como dados do disco grande. Ok, e carregue. Selecione os parâmetros de dados brutos apropriados nas informações do cabeçalho e clique em ok.

Alterne e salve com um novo nome de arquivo. arquivo am. Para sequência de imagem 3D, selecione abrir dados e selecione o nome do arquivo tiff ou o nome do arquivo dot mrmc.

Em seguida, alterne, clique com o botão direito e selecione salvar como nome de arquivo am. Na janela do visualizador 3D, selecione corte ortogonal para abrir o arquivo de imagem. Depois, use um controle deslizante na parte inferior para navegar pelos cortes e recortar os dados maiores abertos como dados de disco grande.

Alterne o nome do arquivo na janela de grupo, clique com o botão direito e selecione acesso à rede. Insira o tamanho desejado da caixa, mova a caixa para a área desejada e clique em aplicar. Salve o novo arquivo.

Em seguida, crie um arquivo de segmentação alternando o arquivo na janela de grupo. Depois, clique com o botão direito e selecione o campo de rótulo de rotulagem. Um novo arquivo será criado e carregado automaticamente na aba do editor de segmentação, bem como no grupo de objetos.

Use a ferramenta pincel para traçar a borda da primeira característica de interesse. Altere o tamanho do pincel conforme desejado e, em seguida, use o ponteiro do mouse para delinear a borda da característica de interesse. Preencha a área delimitada com o atalho F. Adicione a seleção clicando no botão com o símbolo de adição.

Siga a característica de interesse em todos os cortes e repita o segmento por rastreamento manual. Gere uma renderização de superfície para visualização e análise qualitativa ou quantitativa básica conforme as instruções do guia do usuário do software na guia pool de objetos; ative as etiquetas de nome de arquivo am na janela do pool. Em seguida, clique com o botão direito e selecione geração de superfície.

Selecione as propriedades de superfície desejadas e clique em aplicar. Um novo arquivo com o nome surf será criado no pool. Para visualizar o volume segmentado, alterne o arquivo com o nome surf na janela do pool.

Em seguida, clique com o botão direito e selecione a visualização em superfície. Gere uma superfície para visualização e análise qualitativa conforme descrito no protocolo textual. A segmentação automatizada baseada em densidade é utilizada em conjuntos de dados com qualquer variedade de contraste, nitidez ou grau de sobreposição, a fim de isolar as densidades de interesse para iniciar a importação dos dados de volume em um programa equipado com varinha mágica de limiarização ou outras ferramentas baseadas em densidade para segmentação automática.

Como feito na técnica de rastreamento manual de características de interesse, o software Amira é utilizado nesta demonstração para características sem margens claramente distinguíveis. Utilize a ferramenta de limiar selecionando o ícone de limiar. Ajuste um controle deslizante para ajustar a densidade dentro da faixa desejável, de modo que apenas as características de interesse sejam mascaradas.

Clique no botão selecionar, depois adicione uma seleção clicando no botão com o símbolo de adição ou com o atalho. Gere uma superfície para visualização e análise qualitativa conforme descrito no protocolo do texto. Todos uma quarta abordagem.

A segmentação automatizada personalizada pode ser usada para segmentar de forma eficiente grandes conjuntos de dados, mas exige conhecimento em programas como o matlab. Consulte o vídeo suplementar sobre segmentação personalizada para obter instruções passo a passo sobre este método. Seis conjuntos de dados de exemplo foram segmentados por quatro abordagens: geração manual de modelo abstrato, rastreamento manual de características de interesse, segmentação automatizada baseada em densidade e segmentação automatizada personalizada. A geração manual de modelo abstrato mostrou-se eficaz para a resina.

A tomografia incorporada e corada de estereocílios com um objetivo tinha como finalidade criar um modelo para fins quantitativos, ao invés de extrair densidades exatas para a tomografia de parede celular de planta incorporada em resina e corada. A segmentação automatizada baseada em densidade foi a mais eficaz para extrair rapidamente a celulose por meio de diversas fatias. Os métodos manuais exigiram maior esforço, abrangendo apenas algumas poucas fatias de dados.

A geração manual do modelo abstrato produziu o triplo de microtúbulos na tomografia de estágio do cinocílio, enquanto as duas abordagens automatizadas extraíram as densidades mais rapidamente e foram, portanto, preferidas devido à forma das mitocôndrias obtidas por feixe de íons focalizados e microscopia eletrônica de varredura de células epiteliais da mama. O rastreamento manual forneceu o resultado mais limpo, e a baixa densidade populacional permitiu uma segmentação rápida. Considerando o grande volume que precisava ser segmentado, a segmentação automatizada personalizada mostrou-se a mais eficiente para segmentar os dados de microscopia eletrônica de varredura de face serial de bactérias.

Embora demorado, o único método para extrair o feixe de íons focalizado da microscopia eletrônica de varredura da membrana de células epiteliais da mama foi o rastreamento manual. O desenvolvimento de abordagens de segmentação abre caminho para pesquisadores neste campo emergente da biologia celular estrutural explorarem e determinarem a arquitetura tridimensional celular ao nível de complexos macromoleculares, organelas e células em uma grande variedade de culturas celulares, culturas de organoides ou organismos modelo. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como escolher e aplicar a abordagem de segmentação ideal para o seu conjunto de dados.