Name: Volume de segmentação e análise de materiais biológicos, usando a bancada de trabalho de SuRVoS (região super Volume segmentação) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: Aprenda a segmentar volumes complexos em biologia estrutural usando o SuRVoS Workbench. Este método semiautomático permite análise qualitativa e quantitativa de dados volumétricos, com aplicações também em ciência de materiais.

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Nós gostaríamos de reconhecer e agradecer o Rui Wang e Wah Chiu da Baylor College of Medicine, para fornecer o conjunto de dados cryoET e Andrew Bodey da fonte de luz de diamante para auxiliar com o beamtime I13. Partes desta pesquisa foram apoiadas pela concessão do National Institutes of Health (NIH) n. º (P41GM103832), reconhecemos o Diamond Light Source para financiamento em conjunto Imanol Luengo sob STU0079 PhD.

Nota: geralmente útil escalas de parâmetros para cada etapa de processamento e os parâmetros específicos para cada tipo de dados mostrados aqui são fornecidas na tabela 1.
 1. preparar um espaço de trabalho e carregando dados <ol><li>lançar SuRVoS Workbench, clique no botão abrir dataset e no popup resultante, selecione o arquivo de dados a ser segmentados. Escolha uma orientação adequada do conjunto de dados. Em seguida, escolher ou criar uma pasta onde serão armazenados o espaço de trabalho e arquivos associados. Recomenda-se que esta pasta está vazia, quando se inicia uma nova segmentação. Depois que os dados foi carregados, a bancada será aberto com o painel de Plugins no lado esquerdo, o painel de visualização à direita e um conjunto de atalhos da ferramenta entre os dois painéis ( Figura 1).</li>
</ol> 2. Pré-processamento e representação de dados <ol><li>em the ROI Selecione guia, o início de x, y e z de entrada e final coordenadas para a região de interesse e clique em Adicionar. Para escolher o apropriado y e x coordenadas passe o mouse sobre um ponto na imagem. Escolha as coordenadas de z usando o controle deslizante na parte superior do painel de visualização. Depois que tiver sido adicionada a uma região, certifique-se que ele é selecionado, marcando a caixa à direita. Todos os cálculos a jusante serão realizados na região selecionada. Em geral, começando com um pequeno, representante região de interesse (ROI), otimização de parâmetros e então re-aplicação desses parâmetros para toda a área a ser segmentado, aconselha-se.</li>
	<li>Guia em the recurso canais, usar o menu drop-down no topo para escolher um recurso/filtro e adicioná-lo para a fila (veja a discussão para mais informação sobre canais de recurso). Uma vez que um recurso/filtro foi adicionado e selecionado clicando no seu nome, modificar opções específicas para o recurso filtro e escolha o conjunto de dados de entrada no qual executar o recurso/filtro. Uma vez que todas as opções foram escolhidas, clique a caixa de seleção à direita do nome do recurso/filtro para calcular.
	<ol><li>a fim de otimizar os parâmetros para um novo conjunto de dados, adicionar vários filtros/recursos e escolher os parâmetros para eles, antes de ser calculado em ordem, um após o outro. Para fazer isso, adicionar a cada novo recurso/filtro e selecionar parâmetros apropriados, marque a caixa à esquerda de cada recurso/filtro para ser executado e clique na caixa de recursos de computação na parte superior do painel. Consulte a discussão para obter informações adicionais.</li>
	</ol></li></ol> 3. Gerando regiões super apropriado <ol><li>em regiões Super guia, na seção Supervoxels, use o menu drop-down de fonte para selecionar o conjunto de dados filtrado da qual supervoxels será criado. Em seguida, especifique a forma, o espaçamento e a compacidade da supervoxels (veja a discussão e a Figura 2 para mais detalhes). Finalmente, clique no botão Aplicar para gerar o supervoxels. Uma vez que os supervoxels foram criados eles podem ser visualizados no painel de visualização, ligado ou desligado e sua transparência controlada na guia Visualização e atalho janela Visualizador.</li>
	<li>Guia em regiões Super, na seção Megavoxels, use o menu drop-down de fonte para selecionar o conjunto de dados filtrado da qual megavoxels será criado. Em seguida, especifica o lambda, numBins e parâmetros da gama da megavoxels (veja a discussão para mais detalhes). Uma vez que os megavoxels foram criados eles podem ser visualizados no painel de visualização, ligado ou desligado e sua transparência controlada na guia Visualização e atalho janela Visualizador.</li>
</ol> 4. Introdução à anotação <ol><li>em the anotações guia use o botão Adicionar nível para adicionar um nível de anotação. Depois de ter sido adicionado a um nível, use o botão de Adicionar rótulo nesse nível para adicionar um rótulo para a anotação. Uma vez adicionado, o nome e a cor do rótulo podem ser modificados para facilidade de anotação.</li>
	<li>Em seguida, a fim de começar a anotar, selecione o ícone de caneta, da seção de atalho ferramenta. Quando esta opção estiver seleccionada, um conjunto de opções aparecem na parte superior do painel de visualização. Estas opções controlam a largura da caneta e se voxels, supervoxels ou megavoxels será usado para fazer anotações.
	<ol><li>Para efeitos de formação de modelo, em geral, selecione supervoxels na caixa suspensa nível de anotação e um mediano para a largura da caneta grande deve ser usado. Na aba ' anotações ', selecione o rótulo deve ser anotada, marcando a caixa para a extrema-direita da informação constante do rótulo. Em seguida, clique no painel de visualização para anotar um único supervoxel, ou clique e arraste para anotar muitos. 
		Nota: Voxels e megavoxels pode ser selecionada na caixa suspensa nível de anotação e usado para anotar da mesma forma, que, no caso de megavoxels, pode permitir que muitos milhares de voxels semelhante para ser segmentado, com um único clique do mouse.</li>
	</ol></li></ol> 5. Treinamento de modelo de segmentação usando demonstrado com um dataset microCT.
 Nota: A primeira segmentação para muitos conjuntos de dados é para diferenciar várias grandes regiões do outro. Por exemplo, separando o núcleo do citoplasma, ou a célula de estrutura de gelo e apoio externa. Para este tipo de segmentação, com limites claros delineados e grandes regiões, formação de modelo é útil. Para demonstrar isso, raio-x fase contraste tomográficos dados de Goosegrass serão usados.
<ol><li>Carregar os dados, pré-processar usando a suite de filtro e o recurso e determinar o apropriado supervoxels e/ou megavoxels, conforme descrito nas seções acima usando os parâmetros na tabela 1 como um guia. Continuar a utilizar os parâmetros da tabela 1 e as instruções na seção 4, aproximadamente anotar algumas grandes áreas do conjunto de dados, conforme mostrado na Figura 3. 
	Nota: O conjunto de dados não precisa ser completamente segmentado neste ponto.</li>
	<li>No modelo de formação guia, defina o nível de prever ao nível que contém as anotações manual de treinamento e no descritor de seção definir a região de Supervoxels. Em seguida, selecione os descritores que devem ser usados para diferenciar as regiões de dados clicando no menu suspenso selecione fontes e verificando as caixas dos recursos e filtros de escolha (ver tabela 1 e discussão).</li>
	<li>, Em seguida, clique no botão prever. Após cálculo completo, o painel de visualização será atualizado com as previsões para todos os não-rotulados voxels mostrando que as classes de anotação que eles são previstos de pertencer. Geralmente, os parâmetros padrão para cada metodologia classificador fornecem um bom ponto de partida e o usuário deve apenas precisa alternar entre classificadores para encontrar um bom ajuste. No entanto, para usuários experientes ou especialistas as opções para cada classificador estão disponíveis e podem ser modificadas.</li>
	<li>Após a avaliação dos efeitos das metodologias de formação e escolher um, aplicar refinamento adicional clicando sobre a refinar suspenso na seção refinamento. Pelo fundo da formação modelo tab, a &#34; atualização anotações &#34; seção, certifique-se de que o menu drop-down de visualização está definido para PredictioNS. Use o controle deslizante de confiança para atribuir mais ou menos do supervoxels anotadas para os rótulos de anotação selecionada.</li>
	<li>Depois um nível adequado de confiança foi selecionado com base em inspeção visual, use os botões de salvar junto as etiquetas na parte inferior da ferramenta confiança para salvar as previsões em rótulos específicos. O painel de visualização será atualizada para mostrar as alterações. Cada etiqueta pode ser salva separadamente, e na verdade, rótulos podem ser salvos de sub-regiões menores por introduzir valores a de e para caixas de x, y e z e clicando no botão Salvar para cada rótulo.</li>
	<li>Endereço menor tachar fornecendo mais dados de treinamento, conforme descrito na seção 4. Depois de previsões adequadas são adicionadas às etiquetas, repita o processo do modelo de formação com requinte e adicionando as previsões de alta confiança, até lá não existem mais unlabeled supervoxels. Isto é eficaz porque cada vez que o processo de formação de modelo é executado lá recebem mais supervoxels para treinar com, e, portanto, o processo se torna mais robusto como aumentam as iterações.</li>
</ol> 6. Segmentação usando supraregiões, demonstrado com um CryoET Dataset.
 Nota: segmentação supraregião desde que é útil para áreas menores, discretamente ligadas, o foco aqui será na segmentação das organelas e microtúbulos dentro deste conjunto de dados. Modelo de formação foi usada para segmentar rapidamente a plaqueta do gelo do fundo e do carbono; Estes parâmetros não são discutidos, mas são apresentados na tabela 1.
<ol><li>Carregar os dados, pré-processar usando a suite de filtro e o recurso e determinar o apropriado supervoxels e/ou megavoxels, conforme descrito nas seções acima usando os parâmetros na tabela 1 como um guia.</li>
	<li>Adicionar níveis adequados e rótulos para a guia de anotação, selecione um rótulo e começar a anotar usando um mediano largura de caneta com supervoxels selecionado. Seja consciente da necessidade de escolher rótulos diferentes para objetos em estreita proximidade com os outros para evitar rotulá-los como um único objeto.</li>
	<li>Para limpar as anotações mais, utilizar métodos de refinamento morfológico (dilatação, erosão, abertura, fechamento e preenchimento de buracos). Estas opções podem ser encontradas na parte inferior da guia anotações. Para usá-los, selecione o método de segmentação etiqueta e refinamento. Insira um valor de raio e escolher como aplicar o refinamento. Clique em refinar.</li>
</ol> 7. Classificação e análise de dados objetos com base em características intrínsecas, demonstrado com um CryoSXT Dataset Nota: geralmente, o próximo passo após a segmentação é a análise dos dados. A ferramenta de divisor de rótulo em SuRVoS permite a classificação de objetos segmentadas usando regras baseadas em características intrínsecas dos objetos tais como a intensidade do objeto média, variância, volume ou posição. A ferramenta de estatísticas de rótulo permite a visualização das relações entre estas medidas para cada nova classe de objeto. Estas são as novas ferramentas poderosas para a análise de conjuntos de dados complexos e 3D após a segmentação.
<ol><li>Carregar os dados, pré-processar usando a suite de filtro e recurso, determinar o segmento conforme descrito nas seções acima usando os parâmetros na tabela 1 como um guia e/ou megavoxels e apropriado supervoxels.</li>
	<li>Depois de segmentação, clique na segunda guia do painel de visualização, chamado divisor de rótulo. Isso adicionará uma nova área para o lado direito da janela - painel de criação de regra.</li>
	<li>Na parte superior desta área, selecione um nível adequado e rótulos para rótulo dividindo. Em seguida, selecione o dataset para consultar e clique em rótulo. Todos os objetos nos rótulos selecionados agora vão ser delineados em azul como objetos separados no painel de visualização e um enredo mostrando a intensidade média dos objetos serão exibidos no painel de criação de regra. Para alterar a medida que está sendo mostrada na trama, clique na caixa drop-down no topo do lado direito.</li>
	<li>Para começar a dividir os objetos em classes relevantes, clique em Adicionar nova etiqueta na parte inferior do painel de criação de regra. O nome e a cor associada a este novo rótulo podem ser alterados conforme descrito anteriormente.
	<ol><li>, Clique em Adicionar nova regra e usando as caixas de entrada suspensa e forma livre definem a regra a ser aplicada. Clique em aplicar para ver os efeitos da nova regra no painel de visualização e o enredo no painel de criação de regra. Várias regras podem ser aplicadas a um único rótulo e vários rótulos podem ser criados no mesmo dataset. 
		Observação: Para coletar todos os objetos sem rótulo, criar um novo rótulo e em vez de adicionar uma regra para isso, clique em selecionar outros.</li>
	</ol></li> <li>Quando os objetos de interesse foram separados em novos rótulos, criar um nível novo e vazio na guia anotações. Em seguida escolha neste nível na guia de criação de regra e clique em salvar rótulos. Isso salvará os novos rótulos para este nível vazio.</li>
	<li>Na borda do painel de visualização, clique na guia Estatísticas de rótulo. Isto irá abrir um novo painel de visualização que pode ser usado para começar a entender as relações entre as classes de objeto de dados. Na parte superior, selecione um nível adequado e rótulos e o conjunto de dados para consulta.
	<ol><li>Selecionar algumas das medidas de interesse, verificando as caixas ao lado deles. Em seguida, clique em rótulo. Isto irá produzir comparação emparelhada parcelas para cada uma das medidas selecionadas. Para atualizar as parcelas, selecione ou desmarque as medidas adequadas e clique em Update trama.</li>
	</ol></li></ol> 8. Exportação de dados e segmentações <ol><li>exportar as parcelas e os dados de medição cru clicando na trama de exportação e exportação de dados, respectivamente, na guia Estatísticas da etiqueta do painel de visualização.</li>
	<li>Exportar os dados de imagem e segmentações clicando na guia de exportação no painel de Plugins. Primeiro, clique para selecionar uma pasta onde os dados serão salvos. Em seguida, selecione a saída (dados brutos Raw anotações, máscaras de segmentação de dados ou mascarado) e o formato (HDF5, MRC ou TIFF). Por último, selecione o nível (is) anotação a ser exportado usando as caixas de seleção e clique em exportar. Os dados podem ser dimensionados e invertidos antes de exportar, se necessário. Ao exportar os dados mascarados, o dataset que será aplicado para o mask(s) pode ser selecionado usando um menu drop-down.</li>
</ol>

<ol><li>DiamondLightSource/SuRVoS: Version 1.0. Zenodo. , Available from:
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</ol>

Os autores declaram que têm sem interesses financeiros concorrentes.

SuRVoS bancada difere de outros programas de segmentação que otimização dos parâmetros é um passo necessário e importante antes de começar a segmentação real. Em alguns programas de segmentação manual ou semi manual, o usuário começa a segmentação dentro de momentos de abertura de um novo projeto. Com SuRVoS, porque grandes quantidades de volume vão ser segmentadas, com entrada do usuário muito pouco e os limites são delineados pelo programa, otimizar os parâmetros é fundamental para uma segmentação bem sucedida. Especificamente, têm canais e edifício da supraregião são duas áreas onde a atenção deve ser dada.
Dispõem de canais e modelo de formação
Além dos dados brutos, SuRVoS permite ao usuário criar conjuntos de dados adicionais ou canais derivados de uma existente dataset. Estes canais podem ser criados usando uma seleção de metodologias computacionais ou extratores de recurso. Cada uma das representações de dados estão disponível em paralelo e podem ser visualizadas individualmente para avaliar os resultados da aplicação de recurso ou filtro. Por causa destas características, eles são referidos como canais de recurso em SuRVoS. Há muitas opções de canal de recurso fornecidas dentro de SuRVoS. Para obter informações sobre as opções e parâmetros utilizados aqui, consulte a tabela 1, para obter uma lista completa e descrição de canais disponíveis recurso visite https://diamondlightsource.github.io/SuRVoS/ 2. Primeiro, barulhento datasets beneficiará denoising com o Gaussian ou total filtro de variação. Recomenda-se ainda mais cálculos de canal e supervoxel/megavoxel de recurso ser executada usando um esses conjuntos de dados denoised como o fonte de dados. Geralmente, a variação total denoised dataset é usado como a fonte de dados para cálculos de canal e supervoxel/megavoxel de recurso. Sugere-se executar com valores padrão, primeiro, avaliar o resultado em 3D e finalmente, iterativamente otimizar os parâmetros para o dataset. Além disso, o recurso de canais podem ser construídas em "conjuntos de filtro" para especificamente isolar aspectos do dataset e estes podem então ser usados como fontes de dados para criar supervoxels e megavoxels. Enquanto esta estratégia é altamente dependente de dataset, pode ser benéfico.
Têm canais também são usados como fontes para treinar o classificador no treinamento de modelo. Ao decidir em quais canais de recurso para usar, recomenda-se que alguns canais robusto recurso (por exemplo, da detecção de blob, textura e estrutura ou categorias de recursos robustos) são usados quando se trabalha com uma pequena quantidade de anotações para treinar o classificador. Quando se trabalha com uma grande quantidade de dados de treinamento, recomenda-se usar canais de característica mais gerais, de qualquer das categorias, enquanto fornecem informações variadas para o classificador (por exemplo, adicionar os canais de recurso acima lista de local características e categorias de funcionalidades Gaussian).
Há três partes principais para o modelo de formação: fornecendo fontes de entrada de dados que descrevem os dados, usando estas entradas para treinar um classificador e finalmente as previsões de saída de refinação. Geralmente, regiões menores dos dados exigirá mais anotações do usuário para treinar com precisão o classificador, enquanto regiões maiores dos dados exigirá menos anotações do usuário. Modelo de treinamento primeiro sem selecionar um refinamento pode ser usado para encontrar as melhores previsões. Em seguida, incluem o refinamento e otimizar o parâmetro lambda conforme necessário para corrigir problemas com as previsões, como buracos ou bordas irregulares.
Supervoxels e megavoxels
Supervoxels são aglomerados de vários nas proximidades, semelhante voxels38,39. Supervoxels começam como uma grade padrão 3D sobreposta os dados que então é deformada iterativamente a fim de respeitar os limites subjacentes e, assim, melhor representar os dados. Criação de Supervoxel e deformação é controlada por quatro entradas de usuário: fonte de dados, superpixel forma, espaçamento e compacidade. A fonte de dados fornece as entradas de dados que são consultadas durante a criação do supervoxel. Qualquer fonte pode ser usada, incluindo fontes de dados filtrados. Os parâmetros de forma superpixel determinam a grelha de partida 3D e a forma desejada aproximada do supervoxels resultante. Alterando estes parâmetros pode aumentar ou diminuir o tamanho da supervoxels antes da deformação. Os parâmetros de espaçamento Definirm a importância dos limites em cada direção. Alterando estes parâmetros pode enfatizar os limites em uma ou duas direções em detrimento de outro (s), ou seja, o supervoxels resultante se deformará para acompanhar melhor os limites dados na direção de determinado (s). O último parâmetro, compacidade, controla quanto a supervoxels pode deformar-se. Um número de baixa compacidade permite que o supervoxels a deformar-se mais. Esses parâmetros devem ser otimizados para fornecer supervoxels que representam os limites dos dados de interesse. Nota: Atualmente, parâmetros de forma de supervoxel devem ser igual a 1024 ou menos quando multiplicados juntos.
Em alguns aspectos, supervoxel parâmetros podem compensar um ao outro, ou seja, não há ninguém "resposta certa" ao decidir sobre parâmetros. Por exemplo, uma grande grelha de partida (por exemplo, forma de superpixel: 10 x 10 x 10) e um número de baixa compacidade (ex. 20) pode dar supervoxels com aderência de limite similar em comparação com uma grelha de partida pequena (por exemplo, superpixel forma 5 x 5 x 5) e uma maior número de compacidade (por exemplo, 50). Porque existem mais, supervoxels menor no segundo cenário, não têm a deformar-se tanto a representam limites. Ambos os conjuntos de parâmetros podem ser apropriados para segmentação do dataset.
A maior consideração quando escolher parâmetros de supervoxel é o quanto os supervoxels representam os dados. Exibir o supervoxels sozinho, sem dados por debaixo deles, como na Figura 2D, é uma boa maneira de avaliar parâmetros de supervoxel. Quando exibido desta forma, as bordas e os contornos das formas encontradas nos dados ainda devem estar visíveis no supervoxels.
Megavoxels são conglomerados de vários vizinhos, semelhante supervoxels38,39. Novamente são controlados por quatro entradas de usuário: fonte de dados, lambda, numbins e gama. Como com supervoxels, a fonte de dados fornece as entradas de dados que são consultadas durante a criação do megavoxel. Lambda e numbins tanto impacto a aderência de tamanho e limite do megavoxels. Como os megavoxels crescer maior (lambda elevado, baixo numbins), sua aderência limite diminui. O inverso também é verdadeiro, aderência limite aumentará com menor megavoxels (lambda baixa, alta numbins), no entanto como diminui o tamanho de megavoxel, assim como sua utilidade em segmentação de grandes quantidades de voxels rapidamente. O parâmetro opcional gama controla o fator de suavidade versus o custo de mesclar dois supervoxels juntos. Pequenos valores de gama podem realçar a similaridade entre dois supervoxels, à custa de ter menos megavoxels globais.
Como com supervoxels, a maior consideração quando escolhendo e otimização de parâmetros de megavoxel é bem como os megavoxels representam os dados. Exibir o megavoxels sozinho, como descrito por supervoxels novo pode ser usado para avaliar parâmetros. No entanto, porque megavoxels geralmente será muito maior e são tridimensionais, usando o t de ferramentas de anotaçãoo único megavoxels para garantir a fronteira entre as regiões de interesse é apertada de escolher também é recomendado.
Estratégia de anotação
Duas estratégias de anotação geral têm sido descritas: uma abordagem de treinamento do modelo é útil para a separação de grandes regiões de um dataset, enquanto uma abordagem de segmentação supraregião é útil para menores, mais diversos recursos como organelas individuais. As anotações podem ser organizadas de forma hierárquica, para que seja possível anotar grandes regiões primeiro e, em seguida, subdividir os em regiões mais específicas usando uma relação pai-filho. O rótulo do pai para um rótulo pode ser atribuído, clicando na área à direita da seleção de cor do rótulo e escolhendo um rótulo pai adequado um nível anterior. Na prática, a maioria dos conjuntos de dados usam o modelo formação e estratégias de segmentação supraregião de regiões/características específicas de interesse do segmento.
No modelo formação exemplo aqui, algumas entradas de treinamento (sob a forma de anotações de manual de usuário baseado em supervoxel) foram utilizadas em três fatias equidistantes dos dados. Desta forma, o aspecto de treinamento de modelo de SuRVoS aumenta enormemente a velocidade com que a segmentação é possível especialmente quando trabalhando com grandes, diferenciadas regiões tais como a divisão entre as regiões do corpo de frutificação goosegrass como destaque no Figura 3.
Quando o modelo de formação, se as previsões não podem ser vistas, pode ser necessário ir para a guia de visualização e certifique-se que a camada de previsões é ativada e definido como uma quantidade adequada de transparência. Também, uma confiança de 0 irá atribuir todas as supervoxel sem rótulo para um rótulo, com base em qualquer que seja a correspondência mais próxima é. Confiança de 100 apenas irá atribuir um rótulo, se apenas uma categoria de rótulo tem qualquer correspondência proporcional. Todo o resto é uma troca destes dois extremos. Ao selecionar um nível de confiança, sugere-se para verificar algumas fatias para inspecionar visualmente que não existem nenhum voxels incorretamente previsto antes para salvar a previsão de um rótulo.
Uma boa estratégia para anotar usando supraregiões é usar a ferramenta de ampliação para ampliar os dados, anotar algumas organelas, uma vez por uma fatia, usando uma abordagem "rápido e sujo" primeiro (Figura 4). Em seguida, mover para cima ou para baixo umas fatias em Z e repita este processo. Porque supervoxels são tridimensionais, muitas das falhas da abordagem "sujo" são fixadas por anotações feitas em acima ou abaixo de fatias. Desta forma, a segmentação é acelerada e os limites são fornecidos pelo supervoxels, em vez de manualmente.
Para limpar um rótulo, opções de refinamento de segmentação padrão foram fornecidas. Dilatação faz com que o rótulo de segmentação selecionado crescer pelo determinado raio, erosão provoca a encolher. Abertura e fechamento são a aplicação de erosão primeira e depois a dilatação ou vice-versa, respectivamente. E preenchimento de buracos faz exatamente isso. A ordem destas operações importa. Em geral, realizando preenchimento de buracos, em seguida, abertura e, em seguida, dilatação funciona bem. Cada método de refinamento pode ser aplicado em uma única fatia ("esta fatia"), em todas as fatias em 2D ("todas as fatias (2D)") ou em 3D ("todo volume (3D)"). Recomenda-se a todas as fatias (2D).
Significado e sentidos futuros
Segmentação eficiente e precisa é o próximo gargalo no processamento de conjuntos de dados 3D, especialmente com a coleção de rotina automatizada de terabytes de dados de imagem durante as sessões de longo prazo. SuRVoS bancada pode acelerar o processo de segmentação por um fator de 5 em comparação com segmentação manual. Também, porque os limites são delineados pela supervoxels, a variabilidade das Segmentações resultantes deve melhorar. No futuro, esperamos explorar maneiras de usar a segmentação de uma região 3D representativa de interesse como dados de treinamento para aplicar para o resto do volume, ou mesmo um volume separado, com alta confiança. Este avanço iria diminuir ainda mais a quantidade de tempo do usuário e de entrada necessária para segmento mesmo complexo biológico os volumes, ajudando a aliviar o gargalo de processamento e segmentação de imagem. Este, por sua vez, permitirá a comparação quantitativa de dados biológicos em vários Estados (por exemplo, não-doença, doença, tratada) com números experimentais robustos.

A bancada de SuRVoS é um pedaço de software projetado para permitir que os pesquisadores extrair informações cientificamente relevantes de dados volumétricos de várias amostras, independentemente da estrutura de interesse, a resolução ou a modalidade de imagem1, 2. Dados volumétricos como estas muitas vezes são coletadas usando sistemas de tomografia computadorizada de raios-x ou elétrons, rotineiramente com base em grandes laboratórios ou instalações centralizadas, devido à sua complexidade. Ambos esses métodos e outras técnicas, produzir grande, informações ricas datasets que constituir um desafio para o segmento com qualquer um dos métodos semiautomático ou manualmente. Particularmente, estado quase nativo cryo-imobilizado datasets requerem condições de imagem de baixa dose, resultando em uma baixa relação sinal-ruído e contraste pobre, especialmente em criogenia elétron tomography (cryoET)3,4,5 . Um fator adicional em alguns conjuntos de dados 3D é a presença de artefatos introduzido pelas condições desafiadoras experimentais envolvidas, por exemplo artefatos de cunha desaparecido devido a coleta de dados sobre um limitado inclinação gama, resultando em falta de informação e alongamento na direção do feixe,4,3,5. Mesmo quando baixo sinal-ruído ou faltando cunha de artefatos não é problemáticas (por exemplo, focado SEM6 de feixes de iões ou bloco serial enfrentar SEM7), a complexidade e a natureza tridimensional da amostra e a grande quantidade de dados significam análise seria ainda beneficie de um processo automatizado de segmentação de dados.
Atualmente, quando se considera volumes biológicos das células, existem muitas opções para automaticamente ou semi-automaticamente identificando características celulares muito específicas, tais como a actina, microtúbulos ou complexos de proteínas específicas, usando uma pesquisa baseada em modelo, ou identificando recursos em determinados tipos de conjuntos de dados (por exemplo, alto contraste, manchado, amostras de resina-incorporado)8,9,10,11,12. No entanto, nestes casos apriorísticas informações ou protocolos de preparação de amostra específico são necessários, limitando a ampla aplicabilidade destas estratégias de segmentação. Também existem ferramentas disponíveis que executam o modelo de formação a nível de voxel para aprender o aparecimento de várias estruturas de interesse quando dado de entrada de usuário13. No entanto, a este nível a complexidade da formação e os modelos de teste pode ser computacionalmente caro e sujeito a erros. Dadas as difíceis condições de imagem e a falta de estratégias de segmentação amplamente aplicável, semi automática, manual segmentação é comum, mesmo quando trabalhando com materiais biológicos complexos14,15, 16 , 17. no entanto, é geralmente aceite que o processo de segmentação manual não é apenas demorado, mas também propenso, subjetiva e variável4,5,18,19 ,20. Alguns programas de segmentação oferecem ferramentas para facilitar o processo de segmentação manual (ou seja, interpolação, laço ou ferramentas de golpe)21,22, no entanto, em casos de datasets barulhento, eles são difíceis de aplicar com sucesso, e mesmo quando eles são usados com sucesso, o processo ainda é subjetiva e variável.
Tradicionalmente, as segmentações têm sido utilizadas de duas maneiras distintas: qualitativa ou quantitativamente. Como melhoram a imagem de tecnologias e estratégias de segmentação, tornou-se mais comum para usar a segmentação como uma ferramenta quantitativa para responder a questões biológicas e como uma "verdade de chão" para algoritmo desenvolvimento8,12, 15,23,24,25. Para isso, saldos e verificações detalhadas são necessários para diminuir a variabilidade e subjetividade em todo o processo de26. No entanto, estas precauções ainda mais aumentam a natureza demorada de segmentação. Por isso, é fundamental para fornecer uma estratégia de segmentação mais rápida e menos variável.
A bancada de trabalho de SuRVoS começa a abordar estas questões, fornecendo o usuário com uma seleção de aprendizado de máquina e ferramentas que auxiliam o usuário no processo de segmentação, enquanto também orientando o usuário pelas etapas necessárias de processamento de imagem. Para conseguir isso, duas inovações principais são implementadas juntos no SuRVoS. Primeiro, ele usa uma hierarquia de supraregião de grupo similar, regiões próximas dos dados com base em suas propriedades inerentes. Cada uma das regiões na hierarquia representa o mesmo volume usando menos elementos, enquanto continua a fornecer a aderência forte limite. Assim, supraregiões reduzem a complexidade de segmentar um volume por várias ordens de magnitude, ainda continuam a representar os dados sem perda significativa de informação27. Em segundo lugar, o SuRVoS fornece uma estratégia de segmentação semi-automático que utiliza o mínimo de segmentação manual entradas para treinar os classificadores, que são então utilizados para segmentar o restante volume28,29. Esta estratégia reduz a segmentação manual, grandemente, diminuindo a quantidade de usuário tempo gasto na segmentação e, quando usando supraregiões, remove manual delimitação de fronteiras, potencialmente reduzindo a variabilidade e subjetividade.
Uma outra característica fundamental do SuRVoS é a ferramenta de divisor de rótulo, segundo o qual um usuário pode classificar uma série de objetos já segmentados com base em suas propriedades inerentes. Após a segmentação de vários objetos de interesse, esta ferramenta pode ser usada para dividir o conjunto em subclasses, com base em medidas como objeto de média intensidade, variância, tamanho, localização, etc. isto é útil quando a classificação dos grandes grupos de objetos com alta complexidade. Por exemplo, um grupo de organelas celulares pode ser dividido em mitocôndrias, vesículas vazias, gotículas lipídicas, etc.; ou um conjunto de material inclusões podem ser separados com base no tamanho ou forma. Uma vez segmentado os rótulos individuais pode ser dividida em grupos usando qualquer número de classificadores, reduzir o viés de identificação.
A bancada de trabalho de SuRVoS com sucesso serviu para dados do segmento de várias técnicas de imagem. Aqui, o síncrotron raio x fase contraste tomografia computadorizada (microCT) do corpo frutífero de uma planta é usada para demonstrar segmentatiusando o modelo formação, tomografia computadorizada de elétron de cryo (cryoET) de plaquetas humanas é usada para demonstrar a segmentação usando supere megavoxels, e crio suave raio x tomografia computadorizada (cryoSXT) de uma linhagem de células de mamíferos é usada para demonstrar o rótulo divisão ferramentas

<table><tbody><tr><td>computador</td><td>n/a</td><td>n/a Deve</td><td>estar executando o sistema operacional Linux e ter uma GPU NVidia com pelo menos 4 GB de memória</td></tr></tbody></table>

volume de segmentação e análise de materiais biológicos, usando a bancada de trabalho de survos (região super volume segmentação)

Volume Segmentation and Analysis of Biological Materials Using SuRVoS (Super-region Volume Segmentation) Workbench

Segmentação é o processo de isolar regiões específicas ou objetos dentro de um volume de imagem, para que um estudo mais aprofundado pode ser realizado nestas áreas de interesse. Ao considerar a análise de sistemas biológicos complexos, a segmentação de dados de imagem tridimensional é uma etapa intensiva demorada e trabalhista. Com o aumento da disponibilidade de diversas modalidades de imagem e com sistemas de recolha de dados automatizada, isto coloca um desafio crescente para o biólogo experimental moderno mover dados para o conhecimento. Esta publicação descreve o uso da bancada de SuRVoS, um programa desenhado para resolver esses problemas, fornecendo métodos para semi-automaticamente segmento complexo volumétrico dados biológicos. Três conjuntos de dados de diferentes ampliação e as modalidades de imagem são apresentados aqui, cada um destacando diferentes estratégias de segmentação com SuRVoS. Tomografia de raio-x de contraste fase (microCT) do corpo frutífero de uma planta é usada para demonstrar utilizando treinamento de modelo de segmentação, tomografia computadorizada de elétron de cryo (cryoET) de plaquetas humanas é usada para demonstrar a segmentação usando supere megavoxels e crio macio Tomografia computadorizada de raios-x (cryoSXT) de uma linhagem de células de mamíferos é usada para demonstrar o rótulo dividindo ferramentas. Estratégias e parâmetros para cada tipo de dados também são apresentados. Misturando uma seleção de processos semiautomáticas em uma única ferramenta interativa, o SuRVoS oferece vários benefícios. Geral, hora de dados volumétricos de segmento é reduzida por um fator de cinco quando comparado a segmentação manual, dos pilares em muitos campos de processamento de imagem. Esta é uma economia significativa quando segmentação manual completo pode demorar semanas de esforço. Além disso, subjetividade é abordada através da utilização de limites computacionalmente identificados e divisão complexas coleções de objetos por suas propriedades calculadas em vez de em uma base caso-a-caso.

Segmentação de dados tridimensionais de muitas técnicas de imagem é um grande gargalo em análise de sistemas biológicos complexos. Aqui, descrevemos o uso de SuRVoS Workbench para semi automaticamente dados de volumétrica do segmento em diversas escalas de comprimento usando conjuntos de dados de exemplo de técnicas de tomografia computadorizada de raios-x de contraste fase, cryo macio tomography do raio x e tomografia computadorizada do cryo-elétron.

Volume de segmentação e análise de materiais biológicos, usando a bancada de trabalho de SuRVoS (região super Volume segmentação)

Segmentation is the process of isolating specific regions or objects within an imaged volume, so that further study can be undertaken on these areas of ...

O objetivo geral deste procedimento é segmentar de forma semi-automática conjuntos de dados volumétricos complexos de natureza biológica. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da biologia estrutural, permitindo a análise qualitativa e quantitativa de dados volumétricos. A principal vantagem desta técnica é que, embora possa fornecer insights sobre conjuntos de dados biológicos, também pode ser aplicada a outras áreas, como a ciência dos materiais.Este software utiliza um fluxo de trabalho diferente dos programas de segmentação, o que pode causar dificuldades iniciais ao usar o SuRVoS pela primeira vez. Portanto, uma demonstração visual é essencial para compreender esse novo fluxo de trabalho. A segmentação de grandes regiões bem definidas utilizando treinamento de modelo é demonstrada em um conjunto de dados de tomografia de contraste de fase com raios X.Para iniciar este procedimento, abra o SuRVoS workbench. Clique no botão Abrir Conjunto de Dados e selecione o arquivo de dados a ser segmentado na janela pop-up resultante. Escolha uma orientação apropriada para o conjunto de dados.Em seguida, escolha uma pasta na qual armazenar o espaço de trabalho e os arquivos associados. Clique no botão Carregar. Na guia Selecionar ROI, insira as coordenadas iniciais e finais de X, Y e Z para a nossa região de interesse e clique em Adicionar.Após adicionar uma seção, certifique-se de selecioná-la marcando a caixa à direita. Em seguida, na guia Canais de Funcionalidades, use o menu suspenso para escolher uma funcionalidade e adicioná-la à fila. Modifique as opções específicas da funcionalidade e escolha o conjunto de dados de entrada no qual executar a funcionalidade.Clique na caixa de seleção à direita do nome da característica para calcular. Várias características podem ser executadas no mesmo conjunto de dados, e as características calculadas podem ser usadas como conjuntos de dados de entrada para processamento adicional. Em seguida, escolha a aba Regiões Superiores.Na seção Super Vóxeis, use o menu suspenso para selecionar o conjunto de dados filtrado a partir do qual os super vóxeis serão criados. Especifique a forma, o espaçamento e a compactação. Clique no botão Aplicar para gerar os super vóxeis.Para avaliar a qualidade dos super vóxeis, exiba-os isoladamente, sem os dados sobrepostos. Se as características de interesse presentes nos dados ainda forem visíveis nos super vóxeis isoladamente, eles representam bem os dados. Na guia Anotação, clique no botão Adicionar Nível para adicionar um nível de anotação.Clique no botão Adicionar Rótulo no nível recém-criado para adicionar um rótulo à anotação. Em seguida, na seção de atalhos de ferramentas, selecione o ícone da caneta. Um conjunto de opções aparecerá na parte superior do painel de visualização.Selecione a opção super voxels e uma caneta de largura média para começar a criar dados de treinamento para o treinamento do modelo. Clique na caixa mais à direita das informações do rótulo para selecionar o rótulo a ser anotado. Em seguida, clique e arraste no painel de visualização para anotar múltiplos super voxels.No separador Treinamento do Modelo, defina o nível de previsão para o nível que contém as anotações de treinamento manual. Em seguida, na seção descritor, defina a região como superpixels. Clique na lista suspensa Selecionar Fontes e marque as caixas correspondentes aos recursos ou filtros de sua escolha para selecionar os descritores que serão usados para diferenciar regiões de dados.Clique no botão Prever. Quando o cálculo for concluído, o painel de visualização será atualizado com as previsões sobre qual rótulo de anotação pertence a cada vóxel não rotulado. Após avaliar o efeito das metodologias de treinamento e escolher uma delas, clique na lista suspensa Refinar na seção de refinamento para aplicar um refinamento adicional.Na parte inferior da guia de treinamento do modelo, na seção Atualizar Anotações, certifique-se de que o menu suspenso de visualização esteja definido como previsões. Em seguida, utilize o controle deslizante de confiança para atribuir mais ou menos super voxels não anotados às etiquetas de anotação selecionadas. Após selecionar um nível apropriado de confiança, clique nos botões Salvar ao lado das etiquetas na parte inferior da ferramenta de confiança para salvar as previsões em etiquetas específicas.O painel de visualização será atualizado para refletir as alterações realizadas. Se necessário, repita o treinamento do modelo com refinamento adicional e previsões de alta confiança até que haja poucos ou nenhum super-voxel não rotulado. A segmentação de regiões menores e mais complexas utilizando super-regiões é demonstrada em um conjunto de dados de tomografia crioeletrônica.Após adicionar níveis e rótulos apropriados na guia de anotação, selecione o rótulo. Usando uma caneta de largura média, comece a anotar com os super vóxeis selecionados. Uma estratégia para segmentação de regiões superiores é segmentar rapidamente em uma fatia, mover-se algumas fatias acima ou abaixo e preencher as lacunas na nova fatia.Desta forma, as fatias intermediárias também serão anotadas com menos esforço por parte do usuário. Em seguida, para limpar ainda mais as anotações, selecione o rótulo de segmentação e um dos métodos de refinamento morfológico. Insira um valor de raio e escolha como aplicar o método de refinamento.Em seguida, clique em Refinar. A classificação e análise de objetos de dados são demonstradas em um conjunto de dados de tomografia de raios X suaves criogênicos. Após segmentar completamente os dados, clique na segunda guia no painel de visualização chamada Divisão de Rótulos.Uma nova área, o painel de criação de regras, será adicionada ao lado direito da janela. Na parte superior do painel de criação de regras, selecione o nível e as etiquetas para a divisão de etiquetas. Em seguida, selecione o conjunto de dados a ser consultado e clique em Etiqueta.Cada objeto nas etiquetas selecionadas será agora destacado em azul como objetos separados no painel de visualização. O painel de criação de regras conterá agora um gráfico que mostra a intensidade média dos objetos. Clique na caixa suspensa no canto superior direito para alterar a medida que está sendo exibida.Em seguida, clique em Adicionar Nova Etiqueta na parte inferior do painel de criação de regras para começar a dividir os objetos em classes relevantes. Clique em Adicionar Nova Regra e use as caixas de seleção suspensa e de entrada livre para definir a regra a ser aplicada. Clique em Aplicar para visualizar os efeitos da nova regra no painel de visualização e no gráfico no painel de criação de regras.Depois de classificar todos os objetos de interesse, vá até a guia Anotações. Crie um novo nível vazio. Em seguida, selecione este novo nível na guia de criação de regras e clique em Salvar Rótulos.Clique na guia Estatísticas de Rótulos na borda do painel de visualização para abrir um novo painel de visualização que pode ser usado para compreender as relações entre as classes de objetos. Na parte superior, selecione um nível e rótulos apropriados e o conjunto de dados a consultar. Em seguida, selecione algumas medidas de interesse marcando as caixas ao lado delas.Clique em Rótulo para gerar gráficos de comparação par a par para cada uma das medidas selecionadas. Se for necessário adicionar ou remover uma medida, clique na caixa de seleção apropriada e depois clique em Atualizar Gráfico. Neste estudo, são demonstradas duas estratégias de segmentação e uma ferramenta de classificação na bancada SuRVoS.Para o treinamento do modelo, é carregado um conjunto de dados com alto contraste relativamente alto e com limites que definem regiões. Os dados são filtrados e limitados para tornar o fundo, o primeiro plano e as estruturas internas mais distinguíveis. Em seguida, são criados super vóxeis sobre o conjunto de dados filtrado.Após a avaliação da qualidade dos superpixels, são realizadas anotações manuais para treinar o classificador a prever as áreas correspondentes ao fundo, ao cerda do fruto, ao material da semente e à polpa circundante. Refinamentos morfológicos são utilizados para limpar a segmentação preenchendo os buracos. Para a segmentação por super-regiões, um conjunto de dados ruidoso e complexo é carregado.Em seguida, um conjunto de filtros apropriado é aplicado à região de interesse selecionada. Após o treinamento do modelo e a segmentação, anotações manuais rápidas são utilizadas a cada cinco a 10 cortes para selecionar os super vóxeis que descrevem a característica de interesse. Em seguida, a divisão de rótulos é demonstrada usando um conjunto de dados com muitas organelas variadas.Primeiro, um filtro de variação total apropriado é utilizado para realçar os contornos das organelas. As organelas são segmentadas de forma semi-automática utilizando mega vóxeis e super vóxeis, e é aplicado um refinamento para preencher lacunas e suavizar bordas. O separador de rótulos é usado para visualizar cada organela como um objeto no conjunto de dados e, em seguida, para visualizar várias características de cada objeto no gráfico de dados.Aqui, foram criadas regras para separar as organelas em cinco classes distintas com base em suas propriedades inerentes, por exemplo, seu tamanho ou intensidade média. O separador de rótulos pode ser usado para gerar informações quantitativas sobre os dados e começar a compreender o contexto celular. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como utilizar o ambiente de trabalho SuRVoS para segmentação semi-automática.Utilizando este procedimento, é possível comparar múltiplos estados biológicos com o objetivo de responder perguntas, por exemplo, sobre condições selvagens, doenças e condições tratadas. Uma vez dominada, esta técnica pode acelerar o processo de segmentação em aproximadamente cinco vezes, se realizada corretamente. Após este procedimento, programas de visualização podem ser utilizados para renderizar os resultados para publicação e criação de vídeos.

volume-segmentation-analysis-biological-materials-using-survos-super

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Análise de conteúdo de gordura é rotineiramente realizada em estudos utilizando modelos murinos obesidade. Métodos emergentes de pequenos animais a tomografia computadorizada ea análise estão fornecendo para longitudinal de análise de conteúdo de gordura riqueza de detalhes. Aqui passo detalhamos por procedimentos passo para a realização de pequenos animais tomografia computadorizada, análise e visualização.

Segmentação e medição de volumes de gordura em modelos de obesidade em roedores usando raios-X Tomografia Computadorizada

Lesão Explorer (LE) é, de um gasoduto semi-automáticas de processamento de imagem desenvolvido para obter o tecido cerebral regional e volumetria das lesões hiperintensas subcorticais de ressonância magnética estrutural da doença de Alzheimer e idosos normal. Para garantir um alto nível de precisão e confiabilidade, o que se segue é, um protocolo padronizado guiada por vídeo para procedimentos manuais de LE.

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O gargalo para microscopia eletrônica 3D celular é a extração de características (segmentação) em alta complexidade mapas de densidade 3D. Temos desenvolvido um conjunto de critérios, que fornece orientação sobre qual abordagem de segmentação (manual, semi-automática ou automática) é o mais adequado para os diferentes tipos de dados, proporcionando, assim, um ponto de partida para a segmentação eficaz.

De Voxels ao Conhecimento: Um Guia Prático para a segmentação do Complexo Microscopia Eletrônica 3D-Data

Usando exames de ressonância magnética (humana), software de imagem 3D e análise imuno-histológica, documentamos alterações nos ventrículos laterais do cérebro. O mapeamento longitudinal 3D das alterações do volume do ventrículo lateral e a caracterização das alterações celulares periventriculares que ocorrem no cérebro humano devido ao envelhecimento ou doença são então modelados em camundongos.

Modelagem 3D do lateral ventrículos e histológica Caracterização do Tecido Periventricular em humanos e mouse

Este protocolo descreve o processo de aplicação de sete ferramentas diferentes segmentação automatizada de varreduras de T1-weighted MRI estruturais para delinear as regiões de substância cinzenta que podem ser usadas para a quantificação do volume de matéria cinzenta.

Segmentação automática de matéria cinzenta Cortical de imagens de T1-Weighted MRI

O pipeline descrito é projetado para a segmentação de conjuntos de dados de microscopia eletrônica maiores que gigabytes, para extrair morfologias de células inteiras. Uma vez que as células são reconstruídas em 3D, software personalizado projetado em torno de necessidades individuais pode ser usado para executar uma análise qualitativa e quantitativa diretamente em 3D, também usando a realidade virtual para superar a oclusão de visão.

Um método para reconstrução 3D e análise de realidade virtual de células gliais e neuronais

Este protocolo descreve um método de rotina para o uso de microscopia eletrônica de varredura em bloco serial (SBF-SEM), uma poderosa técnica de imagem 3D. A aplicação bem sucedida do SBF-SEM depende de técnicas adequadas de fixação e coloração de tecidos, bem como cuidadosa consideração das configurações de imagem. Este protocolo contém considerações práticas para a totalidade deste processo.

Microscopia eletrônica de varredura de blocos de bloco serial (SBF-SEM) de amostras de tecido biológico

Aqui, descrevemos ferramentas e métodos computacionais que permitem a visualização e análise de dados de imagem tridimensionais e quadridimensionais de embriões de camundongos no contexto de alongamento axial e segmentação, obtidos pela tomografia de projeção óptica toto, e por imagens vivas e coloração de imunofluorescência de montagem total usando microscopia multifoton.

Abordagens de visualização e análise tridimensional para estudar alongamento axial de vertebrados e segmentação

O método de imagem intravital descrito aqui utiliza colágeno segunda geração harmônica e fluorescência endógena do cofator metabólico NAD(P)H para segmentar não invasivamente um microambiente tumoral não rotulado em compartimentos tumorais, estromaéreos e vasculares para análise aprofundada de imagens intravital 4D.

Uma abordagem de segmentação sem rótulos para imagens intravitais do microambiente tumoral mamário

A análise precisa de dados de microscopia multidimensional requer fluxos de trabalho complexos. Este artigo demonstra como usar o software Cell-ACDC. Ele aproveita modelos orientados por IA de última geração para segmentação, rastreamento, análise de linhagem celular e quantificação de dados de microscopia. Crucialmente, complementa esses modelos com uma estrutura inovadora para correção semiautomatizada da saída dos modelos.

Análise de dados de microscopia multidimensional usando Cell-ACDC

Este protocolo apresenta um fluxo de trabalho reprodutível para análise de dados de transcriptômica espacial, orientando os usuários desde a aquisição de dados públicos e controle de qualidade baseado no Seurat até a integração, detecção de características espaciais, desconvolução de tipos celulares, anotação de regiões de interesse e análise de comunicação célula-célula, com pontos de verificação práticos que apoiam a execução transparente.

Um Fluxo de Trabalho Prático para a Análise de Dados de Transcriptômica Espacial: da Aquisição de Dados às Análises Avançadas

Aprenda a segmentar volumes complexos em biologia estrutural usando o SuRVoS Workbench. Este método semiautomático permite análise qualitativa e quantitativa de dados volumétricos, com aplicações também em ciência de materiais.

Volume de segmentação e análise de materiais biológicos, usando a bancada de trabalho de SuRVoS (região super Volume segmentação) (Vídeo) | JoVE Journal

Volume de segmentação e análise de materiais biológicos, usando a bancada de trabalho de SuRVoS (região super Volume segmentação)

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