Indução direta de Neurais Human células-tronco de sangue periférico células progenitoras hematopoéticas

O objetivo geral deste procedimento é induzir diretamente células-tronco neurais a partir de células sanguíneas. Isso é feito primeiro enriquecendo as células progenitoras hematopoiéticas positivas para CD 34 do sangue. O segundo passo é transfectar células CD 34 com vírus sendi contendo fatores transcricionais.

Em seguida, as células-tronco neurais são derivadas usando meio seletivo. A etapa final é diferenciar as células-tronco neurais induzidas em neurônios, astroglia e oligodendrócitos. Em última análise, a microscopia de imunofluorescência é usada para caracterizar as células resultantes.

A principal vantagem desta técnica sobre o método existente, como a duração dos neurônios diretamente do fibroblasto, também a geração de IPS, é que este método ignora o tedioso processo de geração e cálculo de IPS, mas ainda fornece uma grande quantidade de células neuronais que podem se relacionar, diferenciar-se aos neurônios. Tive a ideia para este método pela primeira vez quando notei que as células CT 34 transfectadas anexadas na verdade são muito semelhantes às células neuroprogênicas cultivadas primárias, demonstrando que o procedimento será fuzileiros navais, um técnico da minha vida. Depois de isolar as células CD 34 das células mononucleares do sangue periférico de acordo com as instruções do protocolo de texto, inicie o processo de cultura das células CD 34 por Resus, suspendendo as células CD 34 em meio CD 34 e, em seguida, semeie as células em uma placa de 24 poços em três vezes 10 elevado à quinta célula por poço em um mililitro de meio.

Após incubação por 24 horas em uma incubadora de cultura de tecidos a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono, colete as células flutuantes e centrifugue a suspensão celular a 110 vezes G à temperatura ambiente. Em seguida, rejeitar o sobrenadante e ressuspender as células em novo meio de manutenção CD 34. Veja uma nova placa de 24 poços de uma vez 10 elevado ao quinto células por poço em um mililitro de meio, incube a 37 graus Celsius em uma incubadora de 5% de dióxido de carbono por mais cinco dias, substituindo metade do meio em dias alternados.

Aspirando cuidadosamente a metade superior do sobrenadante enquanto as células CD 34 estão no fundo dos poços, como mostrado aqui no quinto dia. Após o plaqueamento, colete as células CD 34 e centrifugue as células a 170 vezes G por 10 minutos à temperatura ambiente, descarte o sobrenadante, ressuspenda as células como antes e semeie uma nova placa de 24 poços de uma vez 10 elevado ao quinto das células por poço em um mililitro de meio. Em seguida, descongele um kit de reprogramação IPS Sendi de sintonia cyto.

Mergulhando primeiro o fundo dos tubos em banho-maria a 37 graus Celsius por 10 segundos e depois descongelando completamente à temperatura ambiente. Centrifugue brevemente os tubos e coloque-os no gelo. Prepare a mistura de vírus Sendai misturando o volume recomendado de cada vírus listado no certificado de análise para o lote correspondente.

Recomenda-se uma multiplicidade de infecção de 15. Adicione a mistura de vírus Sendai a cada poço de células CD 34. Em seguida, misture os poços agitando suavemente o prato.

Incube as células a 37 graus Celsius em uma incubadora de 5% de dióxido de carbono após 24 horas. Observe a eficiência da transdução. Observe que agregados e esferas de células, como os mostrados aqui, são indicadores de transdução bem-sucedida.

Em seguida, incube as células na incubadora de cultura de tecidos por cinco a sete dias até que as células anexadas apareçam e atinjam 30 a 50% de confluência, como mostrado aqui em dias alternados. Mude metade do meio transferindo cuidadosamente a metade superior do meio para outro poço. Se as esferas celulares forem transferidas para o novo, adicione uma quantidade igual de meio fresco.

Verifique a cofluência das células usando o microscópio invertido. Quando as células estiverem 30 a 50% confluentes, aspire o sobrenadante e reserve e, em seguida, adicione um mililitro de meio progenitor neural a cada poço para fazer uma placa de backup usando as esferas na centrífuga sobrenadante, o sobrenadante reserva a 170 vezes G por 10 minutos. Em seguida, aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet em placa média progenitora neural em uma placa de 24 poços revestida com matrigel.

Como antes, troque o meio em cada placa de células a cada dois dias até que as células atinjam 60 a 80% de confluência. Geralmente depois de uma semana. Assim que as células atingirem a confluência necessária, aspire o sobrenadante e adicione um mililitro de meio de células-tronco neurais a cada uma.

Bem, então dissocie as células usando um raspador de células, seguido de pipetagem muito suave. Em seguida, transfira as células de um poço da placa de 24 poços para um poço de seis. Placa de poço.

Adicione outro mililitro de meio ao poço e, após repetir o procedimento para todos os poços, coloque a placa de seis poços na incubadora de dióxido de carbono a 37 graus Celsius a 5%. Troque o volume total do meio a cada dois dias até que as células atinjam 60% de confluência, após o que o tempo se dissocia e reinfla as células na proporção de um para três, como mostrado para congelar uma parte das células-tronco neurais indiferenciadas. Primeiro, prepare o meio de congelamento de células-tronco adicionando 20% de óxido de dimetilsulf ou DMSO ao meio de células-tronco neurais e coloque no gelo.

Em seguida, dissocie as células na placa de seis poços. Usando um raspador de células e pipetagem suave. Reservar uma alíquota da suspensão para uma contagem de células e, em seguida, centrifugar as células a 170 vezes G durante 10 minutos à temperatura ambiente enquanto as células estão a girar, contar as células na alíquota da suspensão utilizando um hemo, citómetro ou contador de células automático e calcular o volume de meio necessário para obter uma concentração celular de uma vez 10 elevado a seis células por mililitro.

Após o término da centrifugação, descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em meio de células-tronco neurais de uma vez 10 elevado a seis células por mililitro. Em seguida, adicione um volume igual de pipeta de meio de congelamento cinco vezes 10 às quintas células em um volume de um mililitro em um frasco criogênico e congele as células em um recipiente de congelamento de acordo com as instruções do fabricante. Quando as células-tronco neurais na placa de seis poços atingirem 80% de confluência, separe-as usando um policial de borracha e depois dissocie por pipetagem suave.

Agrupe a suspensão celular em um tubo estéril. Conte as células usando um hemo, citômetro ou contador de células automatizado e ajuste a concentração da suspensão celular para uma vez 10 elevado a quinta células por mililitro com meio de células-tronco neurais. Em seguida, pipete um mililitro da suspensão celular em uma lisina poli D e lamínula revestida com laminado em um poço de uma placa de 24 poços após repetir o procedimento para o número desejado de poços.

Incube como antes por 24 horas. Decorrido o tempo de incubação, aspirar o meio e substituí-lo por diferenciação neural. Incubar o meio por duas semanas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, trocando o meio duas vezes por semana após duas semanas.

As células-tronco neuronais devem ser totalmente diferenciadas, conforme mostrado aqui, e prontas para aplicações posteriores, como coloração por imunofluorescência. As duas primeiras imagens mostram que as células-tronco neurais expressam aninhamento em e SOX dois. Enquanto a terceira imagem demonstra que a OCT quatro não é expressa, o DPI é usado como marcador nuclear e a barra de escala representa 200 mícrons.

Depois de seguir o protocolo de diferenciação descrito no vídeo, os neurônios diferenciados expressam o marcador neuronal beta três tubulina. As células-tronco neurais humanas também podem ser diferenciadas em células gliais. Quando diferenciadas em astrócitos, as células expressam o marcador astrocítico GFAP.

Finalmente, nesta imagem, as células foram diferenciadas em oligodendrócitos e expressam o marcador de oligodendrócitos. O quatro. Uma vez dominada, a geração de células-tronco neurais humanas induzidas a partir do sangue periférico pode ser feita em aproximadamente três semanas.

Se executado corretamente, as células-tronco neurológicas podem ser neurônios ainda mais diferenciados e não esclarecer o método pelos longos e complicados processos de geração de IPS e podem ser uma opção fácil para gerar culturas neuronais específicas do paciente após seu desenvolvimento. Essa técnica permite que pesquisadores no campo da neurociência explorem a modelagem de cultura de células individuais para vários distúrbios neurológicos, o que pode representar melhor as diferenças genéticas em distúrbios específicos, especialmente de amostras individuais de pacientes.