Name: Indução direta de Neurais Human células-tronco de sangue periférico células progenitoras hematopoéticas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: Aprenda a induzir células-tronco neurais humanas diretamente de células progenitoras hematopoéticas CD34+ do sangue periférico usando vetores virais. Este método oferece uma fonte promissora para pesquisa em neurociência e medicina regenerativa.

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Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

1. O enriquecimento de células progenitoras hematopoiéticas a partir de Sangue Total Adulto NOTA: progenitoras hematopoéticas ou células CD34 + podem ser purificados a partir de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) derivadas a partir de uma variedade de fontes, incluindo o sangue do cordão umbilical, material de leucoferese e sangue total usando métodos baseados em gradiente de densidade de centrifugação. O método está aqui usa sangue total como um exemplo. <ol><li> Isolamento de PBMC a partir de Sangue Total: <ol><li> Adicionar 4,5 ml de meio de separação de linfócitos para o tubo SepMate pipetando-o através do orifício central do inserto. </li><li> Dilui-se a amostra de sangue com um volume igual de DPBS estéril contendo 2% de soro humano (v / v). Por exemplo, dilui-se 5 ml da amostra com 5 ml de DPBS + 2% de soro humano. </li><li> Adicionar a amostra diluída pipetando-o para o lado do tubo. Tome cuidado para não derramar a amostra diretamente através do orifício central. </li><li> Centrifugar a 1.200 xg durante 10 min à temperatura ambiente. </li><li> Remova cuidadosamente o sobrenadante acima da camada de PMBC. </li><li> Recolher a camada de PBMC (turva) para um novo tubo. </li><li> Adicionar 15 ml de fosfato de Dulbecco tamponado com solução salina (DPBS) contendo 2% de soro humano no tubo e centrifugar a 150 xg durante 10 min à temperatura ambiente com o freio. </li><li> Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 15 ml de DPBS contendo 2% de soro humano. Contar o número de células. </li><li> Centrifugar a 690 xg durante 10 min à temperatura ambiente. Remover todo o sobrenadante do tubo. </li><li> Ressuspender as células em 1 x 10 7 células por 15 ml de Dulbecco modificado por Iscove, meio (IMDM) contendo 1% antibióticos (v / v) e 10% de soro humano (v / v). </li><li> Incubar as células S / N a 37 ° C em 5% de CO2, antes do isolamento de células CD34 +. </li></ol></li><li> Selecção positiva de células CD34 + a partir de PBMC utilizando CD34 Multisort Kit: NOTA: Trabalhe rápido e usar soluções pré-arrefecido a tornar as células frio e evitar tamparde anticorpos na superfície da célula e rotulagem de células não-específica por o de instruções do kit. <ol><li> Recolhe todos os PMBC em um tubo de 50 ml e contar o número de células totais no meio. </li><li> Centrifuga-se as células a 300 xg durante 10 min. Remova todo o sobrenadante completamente. </li><li> Ressuspender 8 até 10 células por 300 uL de tampão de talão (DPBS contendo 0,5% de soro humano (v / v) e EDTA 2 mM). </li><li> Adicionar 100 ul de reagente de bloqueio FcR e adicionar 100 ul de MultiSortMicroBeads CD34. </li><li> Misturar bem e incubar durante 30 min no frigorífico (2 - 8 ° C). </li><li> Lavar as células por adição de 2 ml de tampão de talão 10 por 8 células e centrifugar a 300 xg durante 10 min à temperatura ambiente. Remover o sobrenadante completamente. </li><li> Ressuspender 8 até 10 células em 500 ul de tampão. </li><li> Coloque coluna MACS LS no campo magnético de um separador MACS e preparar a coluna por lavagem com 3 ml de tampão de grânulo. </li><li> Aplicar a suspensão de células para center da coluna. Células não marcadas fluirá através do qual podem ser recolhidos, se preferir. </li><li> Lavar a coluna três vezes com 3 ml de tampão de grânulo. </li><li> Remova a coluna do separador e colocá-lo em um tubo de 15 ml. </li><li> Adicionar 5 ml de tampão de talão para a coluna e lave imediatamente as células magneticamente marcadas, empurrando o êmbolo para dentro da coluna. </li><li> Adicionar 20 ul de Reagente de lançamento Multisort por 1 ml de suspensão de células. Misturar bem e incubar durante 10 min no frigorífico (2 - 8 ° C). </li><li> Adicionar 1 - 2 ml de tampão de talão por 10 7 células e centrifugar as células a 300 xg durante 10 min à temperatura ambiente. Remover o sobrenadante completamente. </li><li> Ressuspender as células em 50 ul de tampão de talão por 10 7 células. </li><li> Adicionar 30 ul de reagente de parada Multisort por 10 7 células e incubar durante 15 min no microondas. </li><li> Adicionar 5 ml de tampão de grânulo e centrifugar as células a 300 xg durante 10 min à temperatura ambiente. Descartar o sobrenadante. </li></ol></li></ol> 2. Determinação dos Induced Neurais células-tronco de células CD34 + <ol><li> As células CD34 + cultura: NOTA: medium recentemente preparado deve ser utilizado no prazo de 7 dias, quando armazenados na geladeira. Perda significativa de células CD34 pode ser observada após 24 h, mas a proliferação significativa de células deve ser perceptível, especialmente após o dia 5. Se o número de células diminui continuamente ou não existe proliferação, implica qualquer má qualidade de células médias ou CD34 e as células não deve ser utilizado no passo seguinte. <ol><li> Ressuspender as células e cultura de CD34 + em células CD34 mantendo médio (meio StemSpan SFEM contendo trombopoietina humana (TPO, 100 ng / ml), semelhante a fms tirosina quinase 3 (Flt-3) ligando (100 ng / mL) e factor de células estaminais (SCF, 100 ng / ml), interleucina-6 (IL-6, 20 ng / ml) e interleucina-7 (IL-7, 20 ng / ml)) em uma placa de 24 poços (de até 3 x 10 5 / po em 1 ml de meio por poço), a 37 ° C em 5% de CO2. </li><li> After 24 horas, recolher as células flutuantes e centrifugar as células a 110 xg à temperatura ambiente para se livrar de todas as células unidas e os resíduos celulares. Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em 1 ml de meio fresco mantendo CD34 e sementes de uma nova placa de 24 poços (1 x 10 5 / po) a 37 ° C em 5% de CO2 durante 5 dias adicionais. </li><li> Substituir metade do meio todos os outros dias por aspiração cuidadosamente a metade superior de sobrenadante enquanto as células CD34 + são flutuante sobre o fundo das cavidades (Figura 1A). </li></ol></li><li> Transfecção Sendai virus: <ol><li> No dia 5, as células CD34 recolher e centrifugar as células a 170 xg durante 10 min à temperatura ambiente. Descartar o sobrenadante. </li><li> Ressuspender as células em meio fresco a 1 x 10 5 / poço numa placa de 24 poços em 1 ml de meio. </li><li> Descongelar um kit de reprogramação cytotune-iPS Sendai por primeira imersão das partes inferiores dos tubos num banho de água a 37 ° C durante 10 segundos e, em seguida, descongelar completamente umt RT. Resumidamente centrifugar os tubos e colocá-los no gelo. Prepare a mistura de vírus Sendai, misturando o volume recomendado de cada vírus listados no Certificado de Análise (COA) para o lote correspondente. MOI 15 é recomendado. </li><li> Adicionar mistura de vírus Sendai a cada poço de células CD34. Misture os poços agitando suavemente. Incubar as células a 37 ° C em 5% de CO2. </li><li> Observe a eficiência de transfecção após 24 horas. Note-se que a formação de agregados de células e esferas são indicadores para a transfecção bem sucedida (Figura 1B). </li><li> Mudar metade do meio por transferência cuidadosamente a metade superior do meio de outro poço. Se existem esferas de células da nova cavidade, adicionar a mesma quantidade de meio fresco. </li><li> Alterar meio cada outro dia repetindo o passo 2.2.6. </li></ol></li><li> Indução de células-tronco neurais: NOTA: Dependendo das condições de celulares, cerca de 5 ou 7 dias após a transfecção, as células aderentes monocamada chegará a 30 -50% de confluência (Figura 1C). <ol><li> Remove-se os sobrenadantes contendo células flutuantes e esferas e, em seguida, adicionar 1 ml de meio de células progenitoras neurais (Dulbecco Modified Eagle Médium: Mistura Nutriente F-12 (DMEM / F12), contendo suplemento 1x N2, 0,1% (w / v) de albumina de soro bovino ( BSA), 1% (v / v) antibióticos, 20 ng / ml de factor de crescimento de fibroblastos básico (bFGF), e 20 ng / ml de factor de crescimento epidérmico (EGF)) para as células aderentes. </li><li> Opcionalmente, dissociar as esferas de células por pipetagem suave e centrifugar as células a 170 xg durante 10 min. Remover o sobrenadante e ressuspender as células em 1 ml de meio de células progenitoras neurais numa nova placa de 24 poços revestida com matrigel por instrução como back-up. </li><li> Mudar a forma todos os outros dias, até as células chegar a 60 - 80% confluentes, geralmente após 1 semana. </li><li> Desprezar o sobrenadante e adicionar em 1 ml de meio-tronco neurais de células (meio sem soro, NSC SFM). Dissociar as células usando um raspador de células seguidopor pipetagem muito gentil. </li><li> Remover as células e semear todos eles para um poço de uma placa de 6 poços. Adicionar mais 1 ml de meio de células estaminais neurais para fazer 2 ml de meio para cada poço. Incubar as células a 37 ° C em 5% de CO2. </li><li> Alterar meio cada outro dia. </li><li> Quando as células atingiram 60% de confluência, dissociar e replate as células na proporção de 1: 3 seguindo os passos em 2.3.4 e 2.3.6. </li></ol></li><li> Congelamento de células-tronco neurais: <ol><li> Prepare célula estaminal neural meio de congelação pela adição de 20% de dimetilsulfóxido (DMSO) para o meio de células estaminais neurais. Mantenha o meio de congelamento no gelo. </li><li> Dissociar as células em uma placa de 6 poços, usando o raspador de células, seguido por pipetagem suave. Contar as células. Centrifuga-se as células a 170 xg durante 10 min à temperatura ambiente. Descartar o sobrenadante. </li><li> Ressuspender as células em meio de células estaminais neurais a 1 x 10 6 / ml. Adicionar o mesmo volume de meio de congelação de células. </li><li> Adicionar 1 ml (5 x 15 0 número total de células) de células num frasco de congelação. Congelar as células utilizando um recipiente de congelamento Sr. Froster seguindo as instruções. </li></ol></li></ol> 3. Neural Diferenciação Celular <ol><li> Células neuronais diferenciação: <ol><li> Quando as células-tronco neurais chegar a 80% de confluência, retire as células-tronco neurais usando um policial de borracha e depois dissociar pipetando suavemente. </li><li> Contar as células e ajustar a concentração de 1 x 10 5 / ml em meio de células estaminais neurais. </li><li> Para a diferenciação neuronal, as células na placa com poli-D-lisina / laminina lamelas revestidas em placas de 24 poços a 1 x 10 5 / poço. Incubar as células a 37 ° C em 5% de CO2. </li><li> Substituir o meio com meio de diferenciação neuronal (DMEM / F12 contendo 1x suplemento N2, 1x suplemento de B27, 300 ng / ml de cAMP, 0,2 mM de vitamina C, 10 ng ml cérebro / factor neurotrófico derivado (BDNF) e 10 ng / ml de derivado de células gliais factor neurotrófico (GDNF)) after 24 h. Incubar as células a 37 ° C em 5% de CO2. </li><li> Mudar meio de diferenciação neuronal, duas vezes por semana durante 2 semanas. </li></ol></li><li> Diferenciação astrogliais: <ol><li> Dissociar as células-tronco neurais por pipetagem. </li><li> Contar as células e ajustar a concentração de células a 5 x 10 4 células / ml. Semente as células em placas de 24 poços. Incubar as células a 37 ° C em 5% de CO2. </li><li> Substituir o meio com DMEM / F12 com 10% de soro fetal bovino (FBS) e incuba-se as células a 37 ° C em 5% de CO 2 incubadora. </li><li> Mudar meio duas vezes por semana durante 2 semanas. Se as células atingem confluência antes de 2 semanas, replate as células seguintes passos 3.2.1 e 3.2.2. </li></ol></li><li> Oligodendrocyte diferenciação: <ol><li> Dissociar as células-tronco neurais por pipetagem. </li><li> Contar as células e sementes de 1 x 10 5 células em revestidas placas de 24 poços poli-L-Ornitina em 1 ml de oligodendrócitos diferenciaramção que consiste de meio DMEM / F12 contendo suplemento N2, 10 ng / ml de factor de crescimento derivado das plaquetas-AA (FCDP-AA), 2 ng / ml de neurotrofina-3 (NT-3), 2 ng / ml de sonic hedgehog ( Shh), e 3 nM de tri-iodotironina (T3). Incubar as células a 37 ° C em 5% de CO2. </li><li> Mudar meio duas vezes por semana durante 2 semanas. </li><li> Substituir o meio com DMEM / F12 com suplemento 1xN2 e 3 nM de T3 e da cultura das células durante uma semana adicional para a produção de proteína básica de mielina (MBP). </li></ol></li></ol> 4. Imunofluorescência Coloração <ol><li> Substituir mídia com paraformaldeído 4% (PFA). Incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Descartar PFA e lavar com PBS contendo 0,1% de Triton X-100 (PBS-T), 3 vezes, 5 min cada vez. </li><li> Permeabilizar as células com PBS contendo 0,5% de Triton X-100 durante 10 min à TA. </li><li> Bloquear as células com PBS-T contendo 4% de soro de cabra durante 20 min à TA. </li><li> Incubar as células com Antibo primária correspondentemorre diluído em PBS-T contendo 0,1% de BSA durante 2 horas à temperatura ambiente ou O / N na sala fria. </li><li> Lavam-se as células por três vezes com PBS-T, a 5 minutos de cada vez. Incubar as células com os correspondentes anticorpos secundários acoplados com um fluorocromo utilizando 1: 400 em PBS-T contendo 0,1% de BSA durante 1 hora num agitador no escuro. </li><li> Lavam-se as células com PBS-T contendo 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) durante 10 min à TA. </li><li> Lavam-se as células mais duas vezes com PBS-T, durante 5 minutos cada à temperatura ambiente. </li><li> Observar as células marcadas utilizando um microscópio e tirar fotos (Figura 3). </li></ol>

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</ol>

O estudo é financiado por fundos internos do NIH.

Um protocolo detalhado para gerar directamente células estaminais neurais a partir de células progenitoras hematopoiéticas periféricas é fornecido. Em comparação com células de fibroblasto, de sangue periférico humano é mais acessível. Usando o protocolo apresentado, mais do que 1 x 10 5 células progenitoras hematopoiéticas ou células positivas CD34, podem ser enriquecidos a partir de 10 ml de sangue total. Embora a contaminação com plaquetas normalmente não é prevenida, pode ser ...

In vitro, as culturas neuronais têm sido utilizados como uma ferramenta fundamental para o estudo de doenças neurológicas. Animais primária (principalmente roedor) culturas neurais 1, 2 e linhas celulares neurais humanas derivadas de tumores ou outros gliomas são os mais vulgarmente utilizados em tais estudos. No entanto, tem sido reconhecido que existem diferenças significativas entre os roedores e células humanas. Muitos resultados baseados em roedores não pode ser traduzido para os seres humanos. Além disso, com a rápida evolução da análise de informação de massa genômica ea edição gene relativamente fácil e seqüenciamento do genoma inteiro, a tendência é cada vez mais orientada para a descoberta de genes de doenças propensas e delinear suas funções e papéis em doenças específicas, o que torna os poucos neuronal humana linhas celulares só têm limitado o uso. Teoricamente, as culturas neuronais primárias humanas derivadas a partir de amostras do sistema nervoso do paciente são a melhor escolha, mas eles são impossíveis de se obter; meth, portanto, alternativaods são necessárias. Nos últimos anos, algumas abordagens têm sido perseguidos, com dois sendo o mais distinguíveis. Seguindo o desenvolvimento da técnica de geração de células pluripotentes estaminais induzidas (IPSC) usando o rato e células somáticas humanas 3, 4, células neurais pode ser diferenciado a partir deles 5-7. No entanto, a geração e caracterização iPSC exige mão de obra intensiva, técnicas e tempo de entrada, às vezes até exageradamente. Pouco depois, foi desenvolvido outro método para transformar directamente as células neuronais a partir de células somáticas 8, 9. Como os neurónios resultantes são não-proliferativa, que limita a sua aplicação em estudos intensivos e rastreio de drogas, que requer uma grande quantidade de células. Para tirar vantagens de ambas as técnicas, derivação direta do tronco neurais / células progenitoras de células somáticas foi explorado por vários grupos de 10-12, que ignora o tedioso processo de geração iPSC e caracterização, mas ainda provides um número razoável de células-tronco neurais para diferenciação neural mais tarde. Mostrámos previamente que, após a introdução dos factores de transcrição Yamanaka em células progenitoras hematopoiéticas, células estaminais neurais podem ser gerados directamente utilizando uma célula progenitora neuronal seleccionando meio 13. Aqui, nós relatamos o método em detalhes.

<table><tbody><tr><td>Meio de separação de linfócitos</td><td>Lonza</td><td>17-829E</td><td>1x</td></tr><tr><td>SepMate</td><td>Stemcell Technologies</td><td>15415</td><td>15 ml</td></tr><tr><td>Soro humano</td><td>Invitrogen</td><td>34005-100</td><td></td></tr><tr><td>Antibióticos</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td>1%</td></tr><tr><td>CD34 MultiSort Kit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-056-701</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Cellgro</td><td>46-034-Cl</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>MACS LS coluna</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>StemSpan SFEM medium</td><td>Stemcell Technologies</td><td>9650</td><td>1x</td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Quality Biologicals</td><td>112-035-101</td><td>1x</td></tr><tr><td>TPO</td><td>Peprotech</td><td>300-18</td><td>100 ng/ml</td></tr><tr><td>Flt-3</td><td>Peprotech</td><td>300-19</td><td>100 ng/ml</td></tr><tr><td>SCF</td><td>Peprotech</td><td>300-07</td><td>100 ng/ml</td></tr><tr><td>IL-6</td><td>Peprotech</td><td>200-06</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>IL-7</td><td>Peprotech</td><td>200-07</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>IPS Sendai Kit de Reprogramação</td><td>Life Technologies</td><td>A1378001</td><td></td></tr><tr><td>Raspador de células</td><td>Sarstedt</td><td>83.183</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Frascos CryoTube</td><td>Thermo</td><td>368632</td><td></td></tr><tr><td>recipiente Mr. Frosty</td><td>Thermo</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>12400-024</td><td>1x</td></tr><tr><td>suplemento N2</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td>1x</td></tr><tr><td>albumina de soro bovino</td><td>Sigma</td><td>A2934</td><td>0,1% (p/v)</td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Suplemento Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td>1x</td></tr><tr><td>meio sem soro NSC Life</td><td>Technologies</td><td>A1050901</td><td>1x</td></tr><tr><td>lamínulas revestidas com poli-D-lisina/laminina</td><td>BD Bioscences</td><td>354087</td><td></td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma</td><td>A9501</td><td>300 ng/ml</td></tr><tr><td>Vitamina C</td><td>Sigma</td><td>A0278</td><td>0,2 mM</td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Peprotech</td><td>450-02</td><td>10 ng/ml</td></tr><tr><td>GDNF</td><td>Peprotech</td><td>450-10</td><td>10 ng/ml</td></tr><tr><td>Poli-L-ornitina</td><td>Sigma</td><td>P4957</td><td>1x</td></tr><tr><td>PDGF-AA</td><td>Peprotech</td><td>100-13A</td><td>10 ng/ml</td></tr><tr><td>NT-3</td><td>Peprotech</td><td>450-03</td><td>2 ng/ml</td></tr><tr><td>Shh</td><td>Peprotech</td><td>1314-SH/CF</td><td>2 ng/ml</td></tr><tr><td>T3</td><td>Sigma</td><td>T6397</td><td>3 nM</td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>4%</td></tr> <tr><td>PBS</td><td>Qualidade Biológica</td><td>119-069-101</td><td>1x</td></tr><tr><td>Soro de cabra</td><td>Sigma</td><td>G9023</td><td>4%</td></tr> <tr><td>TritonX-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Camundongo monoclonal anti-Nestin</td><td>Millipore</td><td>AB5922</td><td>diluição 1:1.000</td></tr><tr><td>Anti-SOX2 anticorpo</td><td>Applied Stemcell</td><td>ASA0120</td><td>Pronto para usar</td></tr><tr><td>Mouse anti-&beta; Anticorpo III-tubulina</td><td>Promega</td><td>G712A</td><td>diluição 1:1.000</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-GFAP de coelho</td><td>Sigma</td><td>G4546</td><td>Diluição 1:100</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-O4</td><td>R& D Systems</td><td>MAB1326</td><td>IgM; 1 ng/ml</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 anticorpo anti-coelho de cabra</td><td>Tecnologias de vida</td><td>A11012</td><td>Diluição 1:400</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anticorpo anti-rato de cabra</td><td>Tecnologias de vida</td><td>A11001</td><td>Diluição 1:400</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anticorpo anti-rato de cabra IgM</td><td>Tecnologias de vida</td><td>A21042</td><td>Diluição 1:250</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>1 &mu; g/ml</td></tr></tbody></table>

indução direta de neurais human células-tronco de sangue periférico células progenitoras hematopoéticas

Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

Culturas neuronais específicos doenças humanas são essenciais para a geração de modelos in vitro para doenças neurológicas humanos. No entanto, a falta de acesso para culturas neuronais adultas humanas primárias coloca desafios. Desenvolvimentos recentes em células-tronco pluripotentes induzidas (IPSC) fornece uma abordagem alternativa para derivar culturas neurais a partir de fibroblastos da pele através de paciente iPSC específico, mas este processo é trabalhoso, exige conhecimentos especiais e grandes quantidades de recursos, e pode levar vários meses. Isso impede que a ampla aplicação desta tecnologia para o estudo de doenças neurológicas. Para superar algumas destas questões, temos desenvolvido um método para obter células-tronco neurais diretamente do sangue periférico humano adulto, ignorando o processo de derivação da IPSC. As células progenitoras hematopoiéticas enriquecidos a partir do sangue periférico humano adulto foram cultivadas in vitro e transfectadas com vectores de vírus Sendai contendo factores de transcrição Sox2, Out3/4, KLF4, e c-Myc. Os resultados de transfecção em alterações morfológicas nas células, que são ainda seleccionadas usando meio progenitora neuronal humana contendo factor de crescimento de fibroblastos básico (bFGF) e factor de crescimento endotelial vascular (VEGF). As células resultantes são caracterizadas pela expressão de marcadores de células estaminais neuronais, tal como a nestina e SOX2. Essas células-tronco neurais pode ser ainda mais diferenciado para os neurônios, astroglia e oligodendrócitos em media diferenciação especificado. Utilizando amostras de sangue periférico humano facilmente acessíveis, este método pode ser utilizado para derivar células estaminais neurais para uma maior diferenciação para células neuronais in vitro de modelagem de desordens neurológicas e pode avançar estudos relacionados com a patogénese e tratamento dessas doenças.

<html> A qualidade das células CD34 é crítica para o sucesso da transdução de células estaminais neurais. As células CD34 alta qualidade proliferam durante o primeiro par de dias de cultura e aparecem como não aderentes, as células homogeneamente redondas, flutuando pouco acima do fundo de recipientes de cultura (Figura 1A). Os resultados de sucesso de infecção em agregados de células, que se expande ao longo do tempo (Figura 1B), enquanto os agregados de células não específicas podem oc...

Foi desenvolvido um método para derivar directamente células estaminais neurais humanos a partir de células progenitoras hematopoiéticas enriquecidas de células do sangue periférico.

Indução direta de Neurais Human células-tronco de sangue periférico células progenitoras hematopoéticas

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

O objetivo geral deste procedimento é induzir diretamente células-tronco neurais a partir de células sanguíneas. Isso é realizado primeiramente enriquecendo células progenitoras hematopoiéticas positivas para CD34 obtidas do sangue. O segundo passo consiste em transfectar as células CD34 com vírus sendai contendo fatores de transcrição.Em seguida, as células-tronco neurais são derivadas utilizando um meio seletivo. O passo final é diferenciar as células-tronco neurais induzidas em neurônios, astrócitos e oligodendrócitos. Por fim, a microscopia de imunofluorescência é utilizada para caracterizar as células resultantes.A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como a diferenciação direta de neurônios a partir de fibroblastos ou a geração de células iPS, é que este método contorna o processo demorado de geração e caracterização de células iPS, mas ainda assim fornece uma grande quantidade de células neuronais que podem se diferenciar em neurônios. Tive a ideia inicial para este método ao notar que as células CT 34 transfectadas aderidas exibiam características muito semelhantes às de células progenitoras neurais cultivadas primariamente, demonstrando que o procedimento seria viável. Um técnico do meu laboratório, Marines, iniciou o processo isolando células CD 34 de células mononucleares do sangue periférico de acordo com as instruções no protocolo descrito, e em seguida começou o cultivo das células CD 34 ressuspendendo-as em meio específico para CD 34 e, então, semeando as células em uma placa de 24 poços a uma densidade de três vezes 10 à quinta células por poço em um mililitro de meio.Após incubação por 24 horas em um incubador de cultura de tecidos a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono, colete as células em suspensão e centrifugue a suspensão celular a 110 ×g em temperatura ambiente. Em seguida, despreze o sobrenadante e ressuspenda as células em meio de manutenção CD34 fresco. Sementeie uma nova placa de 24 poços com um vezes 10 à quinta células por poço em um mililitro de meio, incube a 37 graus Celsius em um incubador com 5% de dióxido de carbono por cinco dias adicionais, substituindo metade do meio a cada dois dias.Aspirando cuidadosamente a metade superior do sobrenadante enquanto as células CD34 estão no fundo dos poços, conforme mostrado aqui no quinto dia. Após o plaqueamento, colete as células CD34 e centrifugue-as a 170 × g durante 10 minutos à temperatura ambiente, descarte o sobrenadante, ressuspenda as células como antes e semeie uma nova placa de 24 poços com uma vez 10 à quinta potência de células por poço em um mililitro de meio. Em seguida, descongele um kit de reprogramação CytoTune iPS Sendai.Primeiro, imergindo as extremidades inferiores dos tubos em um banho-maria a 37 graus Celsius por 10 segundos e, em seguida, descongele completamente em temperatura ambiente. Centrifugue brevemente os tubos e coloque-os sobre gelo. Prepare a mistura do vírus Sendai misturando o volume recomendado de cada vírus listado no certificado de análise do lote correspondente.Recomenda-se uma multiplicidade de infecção de 15. Adicione a mistura do vírus Sendai a cada poço das células CD34. Em seguida, misture os poços agitando suavemente a placa.Incube as células a 37 graus Celsius em uma estufa com 5% de dióxido de carbono após 24 horas. Observe a eficiência de transdução. Observe que agregados celulares e esferas como os mostrados aqui são indicadores de transdução bem-sucedida.Em seguida, incubar as células no incubador de cultura de tecidos por cinco a sete dias até que as células aderidas apareçam e atinjam 30 a 50% de confluência, conforme mostrado aqui a cada dois dias. Trocar metade do meio, transferindo cuidadosamente a metade superior do meio para outro poço. Se as esferas celulares forem transferidas para o novo poço, adicionar uma quantidade igual de meio fresco.Verifique a confluência das células utilizando o microscópio invertido. Quando as células estiverem de 30 a 50% confluentes, aspire o sobrenadante e reserve-o; em seguida, adicione um mililitro de meio de progenitor neural a cada poço para preparar uma placa reserva, utilizando as esferas presentes no sobrenadante. Centrifugue o sobrenadante reservado a 170 × g durante 10 minutos. Em seguida, aspire o sobrenadante e ressuspenda o pellet em meio de progenitor neural; plaque em uma placa de 24 poços revestida com Matrigel.Como antes, troque o meio em cada placa de células a cada dois dias até que as células atinjam 60 a 80% de confluência. Geralmente após uma semana. Quando as células atingirem a confluência requerida, aspire o sobrenadante e adicione um mililitro de meio de células-tronco neurais a cada placa.Em seguida, dissocie as células utilizando um raspador celular, seguido por pipetagem muito suave. Depois, transfira as células de um poço da placa de 24 poços para um poço de uma placa de seis poços.Adicione mais um mililitro de meio ao poço e, após repetir o procedimento para todos os poços, coloque a placa de seis poços no incubador com 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius. Troque o volume completo do meio a cada dois dias até que as células atinjam 60% de confluência, momento em que se deve dissociar e repicar as células numa proporção de um para três, conforme acabou de ser demonstrado, para congelar uma porção de células-tronco neurais indiferenciadas. Primeiro, prepare o meio de congelamento de células-tronco adicionando 20% de dimetil sulfóxido ou DMSO ao meio de células-tronco neurais e coloque-o no gelo.Em seguida, dissocie as células na placa de seis poços, utilizando uma espátula para células e pipetagem suave. Reserve uma alíquota da suspensão para contagem celular e, então, centrifugue as células a 170 × g durante 10 minutos à temperatura ambiente. Enquanto as células estão em centrifugação, conte as células na alíquota da suspensão utilizando um hemocitômetro ou contador automático de células e calcule o volume de meio necessário para obter uma concentração celular de 1 × 10⁶ células por mililitro.Após a centrifugação terminar, despreze o sobrenadante e ressuspenda o pellet em meio para células-tronco neurais a uma concentração de um vezes 10 à sexta células por mililitro. Em seguida, adicione um volume igual de meio de congelação, pipete cinco vezes 10 à quinta células em um volume de um mililitro para um frasco criogênico e congele as células em um recipiente de congelação de acordo com as instruções do fabricante. Quando as células-tronco neurais na placa de seis poços atingirem 80% de confluência, desprenda-as usando um policia de borracha e, em seguida, dissocie-as por pipetagem suave.Reúna a suspensão celular em um tubo estéril. Conte as células utilizando um hemocitômetro ou contador celular automatizado e ajuste a concentração da suspensão celular para um vezes 10 à quinta células por mililitro com meio de células-tronco neurais. Em seguida, pipete um mililitro da suspensão celular sobre um lamínula revestido com poli-D-lisina e laminina, em um poço de uma placa de 24 poços, após repetir o procedimento para o número desejado de poços.Incubar como antes por 24 horas. Após o tempo de incubação, aspirar o meio e substituir por meio de diferenciação neural. Incubar por duas semanas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, trocando o meio duas vezes por semana após as duas semanas.As células-tronco neuronais devem estar totalmente diferenciadas, conforme mostrado aqui, e prontas para aplicações posteriores, como coloração por imunofluorescência. As duas primeiras imagens mostram que as células-tronco neurais expressam nestina e SOX2. Já a terceira imagem demonstra que OCT4 não é expresso, sendo o DPI utilizado como marcador nuclear e a barra de escala representando 200 micrômetros.Após seguir o protocolo de diferenciação descrito no vídeo, os neurônios diferenciados expressam o marcador neuronal beta três tubulina. As células-tronco neurais humanas também podem ser diferenciadas em células gliais. Quando diferenciadas em astrócitos, as células expressam o marcador astrocítico GFAP.Por fim, nesta imagem, as células foram diferenciadas em oligodendrócitos e expressam o marcador de oligodendrócito O4. Após dominar a técnica, a geração de células-tronco neurais humanas induzidas a partir de sangue periférico pode ser realizada em aproximadamente três semanas.Se realizado corretamente, as células-tronco neurais poderiam ser diferenciadas em neurônios posteriormente e eliminar o método por meio dos demorados e complexos processos de geração de IPS, podendo ser uma opção simples para gerar culturas neuronais específicas de pacientes após seu desenvolvimento. Essa técnica abre caminho para pesquisadores na área de neurociência explorarem modelos de cultivo celular individual para diversas doenças neurológicas, o que poderia representar melhor as diferenças genéticas em distúrbios específicos, especialmente a partir de amostras de pacientes individuais.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Nós estabelecemos um protocolo para indução de neuroblastos direta de pluripotentes células estaminais embrionárias humanas mantidas sob condições definidas com pequenas moléculas, que permite a derivação de uma grande oferta de recursos humanos progenitores neurais e células neuronais tipos no desenvolvimento neural do SNC para reparação.

Derivação eficiente dos recursos humanos Progenitores Neuronal e Neurônios de pluripotentes células estaminais embrionárias humanas com a indução de moléculas pequenas

Aqui, mostramos um protocolo simples e eficaz para a geração de iPSCs humanos a partir de 3-4 ml de sangue periférico utilizando um vector lentiviral única reprogramação. Reprogramação de células do sangue prontamente disponíveis promete acelerar a utilização da tecnologia iPSC tornando-o acessível a uma comunidade mais ampla de pesquisa.

Geração de Células-tronco pluripotentes induzidas a partir de sangue periférico usando o STEMCCA Lentivirus Vector

Este vídeo demonstra a reprogramação de células mononucleares do sangue periférico (PBMNCs) em células-tronco neurais induzidas (iNSCs) usando o vírus Sendai. O vírus Sendai é um vírus não integrador que oferece um veículo eficiente e seguro para a reprogramação de células.

Geração de células-tronco neurais induzidas (iNSCs) a partir de células mononucleares do sangue periférico (PBMNCs): um procedimento baseado em vírus de Sendai para reprogramar PBMNCs em iNSCs

Este vídeo demonstra a reprogramação direta de células progenitoras hematopoiéticas geneticamente modificadas em células-tronco neuronais. Os fatores de transcrição expressos pelas células progenitoras hematopoiéticas desencadeiam uma cascata de eventos moleculares que facilitam sua transformação. Outros meios específicos são usados para selecionar e cultivar células-tronco neuronais induzidas.

Reprogramação direta de células progenitoras hematopoiéticas em células-tronco neurais

Geração de células estaminais pluripotentes induzidas proporciona perspectivas fascinantes para a derivação de transplantes autólogos. No entanto, a progressão através de um estado pluripotente e trabalhoso re-diferenciação ainda dificulta a tradução clínica. Aqui nós descrevemos a derivação de fibroblastos humanos adultos ea sua conversão direta em células progenitoras neurais induzidos ea subsequente diferenciação em linhagens neuronais.

Derivação de adultos fibroblastos humanos e sua conversão direta em Expansível Neural células progenitoras

Este protocolo descreve a indução eficiente de endotélio hemogênico e progenitores hematopoiéticos multipotenciais a partir de células-tronco pluripotentes humanas por meio da expressão forçada de fatores de transcrição.

A indução direta de hegemônicos endotélio e sangue por sobre-expressão de fatores de transcrição na pluripotentes humanas Células-Tronco

Propomos um protocolo para reprogramação de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) em células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs). Ao plaquear as células sanguíneas transduzidas em placas revestidas com matriz com centrifugação, as iPSCs são induzidas com sucesso a partir de células flutuantes. Esta técnica sugere um protocolo de reprogramação simples e eficaz para células como PBMCs e CBMCs.

Induzida Geração Stem Cell pluripotentes a partir de células de sangue com o vírus Sendai e centrifugação

Este protocolo descreve um método detalhado para a geração eficiente de iPSCs livres de integração a partir de células sanguíneas periféricas adultas humanas. Com o uso de quatro vetores epissómicos baseados em oriP/EBNA para expressar os fatores de reprogramação, KLF4, MYC, BCL-XL ou OCT4 e SOX2, milhares de colônias de iPSC podem ser obtidas a partir de 1 mL de sangue periférico.

Geração de Integração-livres induzidas células-tronco pluripotentes a partir de células mononucleares de sangue periférico humano Usando epissï¿½ica Vectors

O protocolo apresenta a reprogramação de células mononucleares do sangue periférico para induzir células-tronco neurais por infecção pelo vírus de Sendai, diferenciação de iNSCs em neurônios dopaminérgicos, transplante de precursores da DA na unilateralmente lesionada Modelos do rato da doença de Parkinson, e avaliação da segurança e da eficácia de precursores DA DA do iNSC-derivados para o tratamento do paládio.

Geração de células-tronco neurais induzidas de células mononucleares periféricas e diferenciação para precursores de neurónios dopaminérgicos para estudos de transplante

Aqui, nós apresentamos um protocolo para formar precisamente o endotélio hemogenic das pilhas de haste pluripotentes humanas em uma condição do alimentador-e do Xeno-livre. Este método terá amplas aplicações na modelagem de doenças e triagem para compostos terapêuticos.

Diferenciação do endotélio hemogênico de células-tronco pluripotentes humanas em um alimentador-e condição definida livre de Xeno

Aqui, nós apresentamos um protocolo para a caracterização immunophenotypic e a diferenciação induzida citocinas do sangue do cabo derivado CD34+ a haste hematopoietic e as pilhas do progenitor às quatro linhagens Myeloid. As aplicações deste protocolo incluem investigações sobre o efeito de mutações da doença Myeloid ou de moléculas pequenas na diferenciação Myeloid das pilhas de CD34+ .

Diferenciação Pan-Myeloid do sangue humano do cabo derivado CD34+ da haste hematopoietic e das pilhas do progenitor

Aprenda a induzir células-tronco neurais humanas diretamente de células progenitoras hematopoéticas CD34+ do sangue periférico usando vetores virais. Este método oferece uma fonte promissora para pesquisa em neurociência e medicina regenerativa.

Indução direta de Neurais Human células-tronco de sangue periférico células progenitoras hematopoéticas

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