Name: Modulações Ambientais do número de Midbrain dopamina Neurônios no Adulto Mice (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Aprenda manipulações ambientais para estudar plasticidade cerebral e mudanças comportamentais em camundongos adultos. Este método utiliza enriquecimento ambiental e pareamento por gênero para investigar neuroplasticidade.

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Este estudo foi apoiado pelo Projeto do Conselho Nacional de Saúde e Pesquisa Médica da Austrália (NHMRC) 1022839. AJH é um Australian Research Council (ARC) FT3 Future Fellow (FT100100835). O Instituto Florey de Neurociência e Saúde Mental reconhece o apoio do Subsídio de Apoio à Infraestrutura Operacional do Governo de Victoria.

NOTA: Todos os procedimentos experimentais em animais foram aprovados pelo Instituto Florey do Comitê de Ética Animal Health Neuroscience &amp; Mental e em conformidade com da Austrália Nacional de Saúde e Pesquisa Médica do Conselho publicou código de boas práticas para o cuidado e uso de animais para fins científicos (7 ª edição, 2004). 1. As manipulações ambientais <ol><li> O emparelhamento de Gênero <ol><li> Use sexualmente maduros (&gt; 8 semanas de idade), os ratos machos e fêmeas pareados por idade. NOTA: Normalmente usamos camundongos C57BL / 6, mas tiveram os mesmos resultados usando camundongos Swiss neste protocolo. Normalmente usamos n = 8 machos e fêmeas n = 8 para cada experimento, dividido em n = 2 pares macho-macho (n = 4 machos), n = 2 pares fêmea-fêmea (n = 4 mulheres), e n = 4 pares macho-fêmea (n = 4 machos e 4 fêmeas = n). </li><li> Após a chegada no animal instalação de detenção, casa-grupo dos camundongos por sexo para&gt; 3 dias para se aclimatar. Aqui e througHout o emparelhamento sexo, manter estímulos ambientais externos (por exemplo, temperatura ambiente, a luz: ciclo escuro, comida, água, manuseio e limpeza) constante ou distribuir igualmente a todos os ratos. </li><li> Aleatoriamente atribuir a cada rato a um par macho-macho, um par fêmea-fêmea, ou um par macho-fêmea. Colocar cada par em uma gaiola limpa em isolamento (2 ratos / gaiola) com acesso ad libitum à comida e água, e simplesmente os alojar deste modo continuamente durante 7 dias. NOTA: pecuária rotina é OK, durante este período, mas deve ser distribuída igualmente para todos os ratos. Tome cuidado para evitar o emparelhamento da ninhada masculinos e femininos. </li></ol></li><li> Enriquecimento Ambiental <ol><li> Use sexualmente maduros (&gt; 8 semanas de idade), do sexo masculino ou feminino ratos da mesma idade. NOTA: Normalmente usamos n = 18 ratos para cada experimento, divididas em grupo n = 6 / tratamento. </li><li> Após a chegada na zona de exploração de animais mantê-los alojados em padrão idêntico alojados em grupo (SH) (por exemplo, </em&gt; Veja abaixo) condições, nesta fase, por&gt; 3 dias para se aclimatar. Aqui e em todo o experimento, manter estímulos ambientais externos (por exemplo, temperatura ambiente, a luz: ciclo escuro, comida, água, manuseio e limpeza) constante ou distribuir igualmente a todos os ratos. </li><li> Para começar o enriquecimento ambiental, atribuir aleatoriamente cada mouse para um dos 3 grupos: SH; roda de corrida (RW), ou ambiente enriquecido (EE) e colocar cada grupo de ratinhos em conjunto numa gaiola limpa idêntico com acesso ad libitum a comida e água. NOTA: Aqui, maiores gaiolas de retenção de ratos de todos os grupos, medindo 27 cm de largura, 42 cm de comprimento e 16 cm de profundidade foram usados. <ol><li> Além disso, fornecer as seguintes condições ambientais para cada grupo: SH compreendendo apenas maca (pelotas de papel ou serragem) no chão; RW SH compreendendo mais 2 rodas de correr; EE compreendendo RW além de brinquedos (cordas, escadas, túneis, e objetos como vazios rolos de papel toalha e pedaços de papel de seda) com os quais a explore, brincar, escalar, esconder, e ninho. </li><li> Abrigá-los desta forma continuamente por 14 dias. NOTA: pecuária rotina é OK, durante este período, mas deve ser distribuída igualmente para todos os ratos. </li></ol></li><li> Camundongos EE sujeita a adicional &#39;super-enriquecimento&#39; (SE), colocando-os juntos em uma grande gaiola contendo novas brinquedos para uma hora / dia (mesma hora todos os dias), 5 dias / semana. NOTA: Aqui, a 46 centímetros de largura, 69 centímetros de comprimento e 40 cm de profundidade banheira de plástico foi utilizado. <ol><li> Manter a novidade por apresentar um conjunto diferente de brinquedos cada sessão. Brinquedos que são limpos para ser re-apresentado à ratinhos com água e sabão e etanol a 80% para remover odores. </li><li> Após cada sessão de SE, retornar os ratos para sua gaiola EE. SH Handle e RW camundongos o mesmo que os ratos SE (exceto para si SE) ao longo deste período (por exemplo, remover e voltar cada SH e RW rato de e para a sua gaiola). </li></ol></li></ol></li></ol><ol><li> Preparação <ol><li> Use bombas osmóticas estéreis e de infusão de cérebro kits, que estão disponíveis comercialmente. O dia antes da implantação, utilizando uma técnica asséptica, primos dos implantes, preenchendo cada bomba, tubo de ligação e de uma cânula com uma solução de droga ou veículo estéril (tal como descrito nas instruções fornecidas com as bombas). Ligá-los juntos e incubar em solução salina estéril durante a noite a 37 ° C. Incubar implantes drogas e cheio de veículos separadamente para evitar a contaminação cruzada. </li></ol></li><li> Cirurgia. NOTA: Dependendo do país do experimentador, licenças especiais de experimentação animal ou dos subsídios são necessários para perseguir esses tipos de cirurgia e experiências pós-operatório. <ol><li> Esterilizar todos os equipamentos cirúrgicos e empregar uma técnica asséptica por toda parte. Anestesiar um mouse (por exemplo, usando 1-2% isoflurano no ar) e colocá-lo em um stereheadframe otaxic. Verifique a profundidade da anestesia durante o processo e administrar mais anestésico como necessário (por exemplo, ausência de retirada do membro de aperto nocivo pata é indicativo de anestesia adequada). Garantir a olhos são protegidos de dessecação por pomada lubrificante ocular, e que a temperatura corporal do rato permanece normal durante todo o procedimento. </li><li> Fazer uma incisão na linha média através da pele a partir de entre os olhos e terminada 2cm posterior para a extremidade traseira do crânio. Blunt dissecar a pele longe da fáscia para baixo a parte de trás do mouse para criar uma &#39;bolsa&#39; subcutânea grande o suficiente para caber confortavelmente a bomba e tubo de ligação uma vez que a cânula é implantado (o tubo que liga não deve ser dobrado após a conclusão). Raspe limpar a fáscia de sobre a face dorsal do crânio. </li><li> Usando um diâmetro burr dental aproximadamente 1,5 mm, drill down no crânio no estereotáxica apropriado coordenadas uté uma camada fina, flexível de osso continua. Peel esta camada de distância usando uma pinça fina (isso evita danos a dura-máter subjacente e do cérebro com a rebarba dental). Verifique se o crânio é limpo de quaisquer fragmentos de sangue e osso, e não que haja sangramento ainda mais. </li><li> Com a cânula realizada por um detentor de uma cânula, colocar a bomba e tubo de ligação para o &#39;bolso&#39; subcutâneo que recobre as costas do mouse. Em seguida, posicionar a ponta da cânula nas coordenadas estereotáxicas adequadas e sobre a superfície do cérebro. Baixe cuidadosamente a cânula para o cérebro, mas parar de aproximadamente 1 mm de profundidade necessária. NOTA: A profundidade restante será negociado após a aplicação da primeira camada de acrílico dental. </li><li> Certifique-se de novo a superfície do crânio está limpa e seca, em seguida, preparar um pequeno volume de acrílico dental e use um palito para alisá-lo em toda a área exposta do crânio, inclusive no burr-buraco no crânio em torno the cânula. Antes do acrílico endurece, abaixe a cânula ponta a profundidade restante no alvo. </li><li> Prepare um pequeno volume de acrílico dental e camada esta em relação ao primeiro, bem como sobre o suporte de plástico branco para a cânula, para fixar a cânula no lugar. Repita com camadas adicionais de acrílico como necessário. </li><li> Uma vez que o acrílico tem endurecido, retire cuidadosamente o suporte da cânula e cortar o plástico guia cânula removível branco usando uma lâmina de bisturi aquecida com uma chama de gás butano. Por último, suturar a pele fechada durante todo o implante. </li></ol></li><li> O tratamento pós-cirúrgico de Animais <ol><li> Aplicar pomada anti-séptico para as margens de pele, e administrar um agente anti-inflamatório para o rato (por exemplo meloxicam, 3 mg / kg sc). Remover o mouse do quadro, coloque-o sob uma lâmpada de calor, e observar até que ele recupere a consciência. Não devolva um rato que foi submetido a cirurgia para a companhia de outros animais até que esteja totalmente recuperado. NOTA: Expmanipulações erimental como emparelhamento de gênero e meio ambiente enriquecido pode ser iniciada ou retomada no dia seguinte a cirurgia, no mínimo. </li><li> Monitore seu peso corporal, comportamento geral e aparência diária. Trate sinais de infecção (por exemplo, inchaço, vermelhidão, pus) ao redor de incisões cirúrgicas com pomada anti-séptico tópico. Trate quaisquer sinais de doença, dor, stress ou desconforto (por exemplo, perda de&gt; 10% do peso corporal, retraimento social, a falta de preparação, &quot;amaciamento&quot;, disfunção do movimento, convulsões) com analgésicos e / ou antibióticos sistêmicos como necessário. </li><li> Eutanásia ratos se&gt; 15% de perda de peso ou sintomas da doença, dor, stress ou desconforto são não-reembolsáveis ​​no prazo de 1 semana de tratamento curativo. </li></ol></li></ol> 3. tecido cerebral preparação, transformação imunohistoquímica, e estereologia <ol><li> Perfusão <ol><li> Imediatamente após manipulações / drogas ambientais, preparar o cérebro para o estudo. <br/&gt; NOTA: Nas experiências relatadas aqui o número de neurónios TH + SNc foram medidos e comparados em cada um dos diferentes grupos de tratamento. </li><li> Primeiro administrar uma sobredose de anestésico para matar os ratos (por exemplo, 100 mg / kg ip de sódio pentobarbitona). Uma vez anestesiados, mas antes o coração pára de bater, coloque o mouse sobre as suas costas e gravata ou de definir ambos os membros. </li><li> Usando um bisturi de cortar a pele que recobre o tórax, em seguida, uma incisão através do músculo logo abaixo da caixa torácica para dentro da cavidade abdominal. Coloque um grampo no apêndice xifóide da caixa torácica e levante as costelas para cima e longe do fígado expondo o diafragma. </li><li> Corte através do diafragma e através das costelas lateralmente em ambos os lados utilizando tesouras grandes até a caixa torácica pode ser dobrada para trás sobre a cabeça para expor os pulmões e coração. Usando uma tesoura fina fazer uma pequena incisão no átrio direito como um ponto de saída de sangue e soluções perfundidos, em seguida, cortar a base do Ventri esquerdacle e colocar uma cânula-se através do ventrículo esquerdo, o átrio esquerdo e na aorta. </li><li> Fixar a cânula no lugar depois a bomba quente (37 ° C) heparinizados e 0,1 M de fosfato de solução salina tamponada fisiológica (PBS) através da vasculatura até que a solução que sai do átrio direito é totalmente livre de sangue. Em seguida, a bomba de frio (4 ° C) a solução fixadora (tal como 4% de paraformaldeído em PBS) através da vasculatura, até que todo o rato está bem fixado. Remover o cérebro e o lugar em PBS com 30% de sacarose durante 2-3 dias até os dissipadores cerebrais. NOTA: Outros tipos de preparação do tecido pode ser aplicada dependendo da experiência no laboratório correspondente. </li></ol></li><li> Preparação de Cortes congelados de livre flutuação <ol><li> Corte cortes seriados através das regiões do cérebro de interesse e recolher estes em PBS. NOTA: Nós cortamos 40 mm de espessura, utilizando um criostato. Outros tipos de corte de tecido pode ser aplicada dependendo da especialização no correslaboratório ng. </li></ol></li><li> A imuno-histoquímica <ol><li> Execute imunohistoquímica padrão para proteínas de interesse. Incubar secções em 5% de soro normal de cabra e 0,3% de triton X-100 em PBS à temperatura ambiente durante 30 min, em seguida imunorreagem com anticorpo policlonal de coelho anti-TH (1: 400) a 4 ° C durante 48 hr, em seguida, policlonal biotinilado de cabra anti -rabbit (1: 1000) à temperatura ambiente durante 2 h. </li><li> Em seguida, incuba-se avidina-peroxidase (1: 500) à temperatura ambiente durante 1 hora, em seguida, em cobalto-níquel e intensificou-diamino- benzidina (0,5 mg / ml) à temperatura ambiente durante 18-20 min; para a última 3-5 min de incubação a diamino-benzidina adicionar peróxido de hidrogénio (0,01%) para catalisar a precipitação cromagénio. Lave os cortes três vezes para cada 10 min em PBS antes, depois, e entre cada uma das etapas anteriores. </li><li> Monte as secções em lâminas de microscópio gelatinizadas, ar secá-las, então Nissl stain (vermelho neutro), desidratar em álcool, claro (X-3B), e lamela. </li></ol></li><li&gt; Estereologia <ol><li> Estimar o número total de neurônios TH + e TH SNc (LC e VTA) e utilizando métodos estereológicos imparciais. Certifique-se de que o stereologist é cego para o tratamento recebido. Excluir células gliais com base na soma diâmetro &lt;5 um e contam apenas as células com um núcleo visível. </li><li> Identificar o SNc (e VTA e LC) pelas localizações espaciais de células TH + e as estruturas anatómicas / limites de acordo com o atlas do cérebro de Paxinos e Watson 7. Contagem de células TH + no interior de um quadro de contagem (55 x 55 mm = 3,025 uM 2) em intervalos pré-determinados regularmente (x = 140 mm, y = 140 uM para SNc; x = 100 um, y = 100 mm para VTA e LC) ao longo de cada núcleo em cada quarta secção. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Manipulações ambientais A motivação por trás do design dessas manipulações ambientais (emparelhamento de gênero e de enriquecimento ambiental) foi determinar se o meio ambiente, e / ou comportamento solicitado pelo ambiente, está associado a alterações no número de neurônios DA mesencéfalo. O foco foi, portanto, no fornecimento de ambientes e estimular comportamentos que são propensos a se envolver sinalização DA mesencéfalo. Estes emparelhamento incluído com o sexo oposto, e enriqu...

Sinalização DArgic pelos neurônios na área tegmental ventral (VTA) e substantia nigra pars compacta (SNC) do mesencéfalo é pensado para ser importante para os comportamentos cognitivos, emotivos e motoras motivou-recompensa. No entanto, muita ou pouca sinalização DA mesencéfalo causa muitos sintomas incapacitantes em uma variedade de distúrbios neurológicos (por exemplo, doença de Parkinson, déficit de atenção e hiperatividade, esquizofrenia e dependência de drogas). Drogas que aumentam ou diminuem a sinalização DA aliviar estes sintomas, no entanto, eles também produzem efeitos colaterais atribuíveis à sinalização desregulada e efeitos fora do alvo. A eficácia do fármaco também diminui ao longo do tempo, devido a respostas compensatórias do cérebro. Por isso, o desafio é restaurar a sinalização DA mesencéfalo normal em uma forma mais direccionada e fisiológico, e uma abordagem favorecido é aumentando ou diminuindo o número de neurônios DA mesencéfalo. A evidência foi acumulando para several décadas que a expressão de genes e proteínas envolvidas no metabolismo e DA tráfico e outras catecolaminas em células de adulto é modificável (revisto em 1). No mesencéfalo, o número de tirosina-hidroxilase imunopositivas (TH +, a enzima limitante da velocidade na síntese de DA), em seguida, diminui, aumenta neurónios após a administração da neurotoxina 2,3, enquanto que o número de TH immunonegative (TH) neurónios mostra o padrão oposto (isto é, aumenta em seguida, diminui 3). Isto é consistente com a perda, em seguida, ganhar do &quot;DA fenótipo &#39;por algumas células. O número de neurónios TH + TH e SNc também foi mostrado para mudar em direcções iguais mas opostos na sequência de vários tratamentos que alteram a actividade eléctrica destas células 4,5. Por exemplo, a infusão de pequeno-condutância, potássio activados por cálcio (SK) canal antagonista apamina em mesencéfalo durante 2 semanas, diminui o número de TH + e aumentos (pela mesma quantidade) o number de TH SNc neurônios 4,5. Em contraste, a infusão do agonista do canal SK-1 EBIO aumenta o número de TH + e diminui (pela mesma quantidade) o número de neurónios TH SNc 4,5. Alterações semelhantes foram vistos na sequência de uma variedade de tratamentos que visam a atividade neuronal do SNC, incluindo alguns que visava inputs aferentes 4. Esta aparente de regulação do número de neurónios SNc DArgic por actividade neuronal aferente e entrada levanta a possibilidade de que o ambiente ou comportamento pode influenciar o número de neurónios SNc. Na verdade ratos adultos expostos a diferentes ambientes têm mais ou menos mesencéfalo (SNc e VTA) TH + neurônios, e pelo menos algumas dessas mudanças induzidas pelo meio ambiente são abolidas pelo bloqueio simultâneo de entrada sináptica no mesencéfalo 6. Os objectivos desta comunicação são os seguintes: (1) fornecer mais detalhes sobre como implementar nossas manipulações ambientais e infusões de drogas; e (2) fornecer mais dados de apoio a nossa afirmação de que o environment regula o número de neurônios DA mesencéfalo, através da entrada de aferentes.

<table><tbody><tr><td>Isofluorano</td><td>Baxter Healthcare Pty Ltd, Baxter Drive, NSW 2146, Austrália</td><td>AHN3640</td><td></td></tr><tr><td>ALZET Bomba osmótica 1002</td><td>DURECT Corporation, PO Box 530 Cupertino, CA 95015-0530</td><td>0004317</td><td></td></tr><tr><td>ALZET Kit de infusão cerebral 1</td><td>DURECT Corporation, PO Box 530 Cupertino, CA 95015-0530</td><td>0004760</td><td></td></tr><tr><td>Suporte de cânula ALZET 1</td><td>DURECT Corporation, PO Box 530 Cupertino, CA 95015-0530</td><td>0008860</td><td></td></tr><tr><td>Vertex Monomer Self-curing (solvente acrílico dental)</td><td>Vertex Dental, Postbus 10, 3700 AA ZEIST, Holanda</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Vertex Self Curing (pó acrílico dental)</td><td>Vertex Dental, Postbus 10, 3700 AA ZEIST, Holanda</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>METACAM (Meloxicam)</td><td>Troy Laboratories, 98 long Street, smithfield NSW 2164 Austrália</td><td>L10100</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbitão de sódio</td><td>Lethabarb, Virbac, Milperra, NSW, Austrália</td><td>571177</td><td></td></tr><tr><td>Soro de cabra normal</td><td>chemicon-temecula, CA</td><td>S26-Litre</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Merck Millipore Headquarters, 290 Concord road, Billerica, MA 01821</td><td>1.08603.1000</td><td></td></tr><tr><td>Coelho policlonal anti-tirosina hidroxilase</td><td>Merck Millipore Headquarters, 290 Concord road, Billerica, MA 01821</td><td>AB152</td><td></td></tr><tr><td>Cabra biotinilada policlonal anti-coelho</td><td>Dako Australia Pty. Ltd., Suite 4, Nível 4, 56 Berry street, North Sydney, NSW, Austrália 2060</td><td>EO432</td><td></td></tr><tr><td>Avidin peroxidase</td><td>Sigma-aldrich, Castle Hill, NSW 1765 AU</td><td>A3151-1mg</td><td></td></tr><tr><td>Diaminobenzidina</td><td>Sigma-aldrich, Castle Hill, NSW 1765 AU</td><td>D-5637</td><td></td></tr><tr><td>Investigador estéreo</td><td>MicroBrightField Bioscience, 185 Allen Brook Lane, Suite 101, Williston, VT 05495</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

modulações ambientais do número de midbrain dopamina neurônios no adulto mice

Environmental Modulations of the Number of Midbrain Dopamine Neurons in Adult Mice

Mudanças duradouras no cérebro ou &quot;plasticidade cerebral&quot; subjazem o comportamento adaptativo e reparação cerebral após doença ou lesão. Além disso, as interações com o meio ambiente pode induzir plasticidade cerebral. Cada vez mais, a pesquisa está tentando identificar quais ambientes estimular a plasticidade cerebral benéfica para o tratamento de desordens cerebrais e comportamentais. Duas modificações ambientais que são descritos aumentar ou diminuir o número de tirosina-hidroxilase imunopositivas (TH +, a enzima limitante da velocidade de dopamina (DA síntese)) neurónios do mesencéfalo do rato adulto. O primeiro inclui o emparelhamento masculino e camundongos fêmeas juntos continuamente durante uma semana, o que aumenta TH mesencéfalo + neurônios em aproximadamente 12% no sexo masculino, mas diminui TH mesencéfalo + neurônios em aproximadamente 12% no sexo feminino. A segunda compreende ratos habitação continuamente por 2 semanas em &quot;ambientes enriquecidos&quot; (EE) contendo rodas de corrida, brinquedos, cordas, material de nidificação, etc., que increases TH mesencéfalo + neurônios em cerca de 14% no sexo masculino. Além disso, um protocolo é descrito por concomitantemente infundindo drogas diretamente no mesencéfalo durante estas manipulações ambientais para ajudar a identificar os mecanismos subjacentes a plasticidade do cérebro por motivos ambientais. Por exemplo, EE-indução de mais TH mesencéfalo + neurônios é abolida pelo bloqueio simultâneo de entrada sináptica em neurônios do mesencéfalo. Juntos, estes dados indicam que a informação sobre o meio ambiente é retransmitida via de entrada sináptica nos neurônios do mesencéfalo para ligar ou desligar a expressão de genes &#39;da&#39;. Assim, a estimulação ambiental adequada, ou droga segmentação dos mecanismos subjacentes, pode ser útil para o tratamento de distúrbios cerebrais e comportamentais associados com desequilíbrios no mesencéfalo DA (por exemplo, doença de Parkinson, déficit de atenção e hiperatividade, esquizofrenia e dependência de drogas).

Ratos adultos submetidos a essas manipulações ambientais alteraram número de mesencéfalo (SNC e VTA), mas não LC, TH + neurônios, e EE mais infusão mesencéfalo simultânea de picrotoxin ou bicuculina (GABA os antagonistas do receptor) abole EE-indução de mais SNc TH + neurônios. Estes dados foram previamente publicados em 6. Os presentes dados foram compilados em experiências duplicadas realizados como parte desse estudo anterior, mas não foram publicados em outros lugares. <p class="jove_conten...

Este protocolo descreve duas manipulações ambientais diferentes e um protocolo de infusão cerebral concomitante para estudar as alterações cerebrais induzidas pelo ambiente subjacentes ao comportamento adaptativo e ao reparo cerebral em camundongos adultos.

Modulações Ambientais do número de Midbrain dopamina Neurônios no Adulto Mice

Long-lasting changes in the brain or &#8216;brain plasticity&#8217; underlie adaptive behavior and brain repair following disease or injury. Furthermore, ...

O objetivo geral do experimento a seguir é fornecer situações ambientais controladas que estimulem a plasticidade cerebral e alterações comportamentais em camundongos. Isso é alcançado alojando camundongos em pares macho-fêmea em comparação com pares controle macho-macho e fêmea-fêmea, para estudar os efeitos do emparelhamento prolongado por gênero no cérebro; alternativamente, os camundongos podem ser alojados juntos em gaiolas repletas de diferentes objetos para exploração e brincadeiras, em vez de gaiolas padrão, para estudar os efeitos do enriquecimento ambiental no cérebro. Outros tratamentos, como a administração de fármacos, podem ser adicionados a essas estimulações ambientais para ajudar a identificar os mecanismos por trás das alterações cerebrais e comportamentais observadas.Os resultados mostram que esses enriquecimentos e tratamentos ambientais induzem alterações no número de neurônios dopaminérgicos do mesencéfalo que dependem da transmissão sináptica GABAérgica no mesencéfalo. O enriquecimento ambiental é um paradigma que aumenta a estimulação somatossensorial, motora e cognitiva em camundongos. Com essa abordagem, estudos demonstraram aumento da neuroplasticidade e também melhorias na aprendizagem e na memória em diversos modelos de doenças.As implicações desta técnica estendem-se à compreensão dos mecanismos de plasticidade cerebral adulta provocados por influências ambientais. E isso é relevante para o tratamento de muitas dessas doenças do cérebro e da mente. Tivemos pela primeira vez a ideia deste método quando observamos que o número de neurônios dopaminérgicos do mesencéfalo está mudando em resposta à perturbação da atividade neuronal mesencefálica induzida por entradas sinápticas.A demonstração visual da bomba osmótica e da cânula de infusão cerebral pode ser fundamental, pois os procedimentos podem ser bastante difíceis de aprender. Descrições escritas para o acasalamento por sexo. Mantenha em grupo camundongos machos e fêmeas sexualmente maduros, pareados por idade e separados por sexo, evitando a formação de casais provenientes da mesma ninhada; coloque aleatoriamente cada camundongo em um par macho-macho, fêmea-fêmea ou macho-fêmea, em uma gaiola limpa e isolada, com acesso ad libitum a alimento e água aqui e durante todo o período de acasalamento por sexo.Mantenha todos os estímulos ambientais externos constantes ou igualmente distribuídos a todos os camundongos e aloje os animais continuamente por sete dias. Para enriquecimento ambiental, designe aleatoriamente camundongos machos ou fêmeas sexualmente maduros e com idade correspondente a um dos três grupos: ambiente padrão, roda giratória ou ambiente enriquecido por pelo menos três dias. Mantenha-os dessa forma.Com acesso ad libitum a alimento e água por 14 dias. Durante o enriquecimento ambiental, a gaiola padrão deve conter apenas cama. A roda para corrida deve conter cama mais duas rodas para corrida, e o enriquecimento ambiental deve ter cama, duas rodas para corrida e brinquedos.Sujeite os camundongos com enriquecimento ambiental a um superenriquecimento adicional, colocando-os juntos em uma gaiola maior contendo brinquedos novos por uma hora por dia. Ao mesmo tempo todos os dias, durante cinco dias por semana, devolva os camundongos à sua gaiola com enriquecimento ambiental. Após cada sessão, mantenha a novidade apresentando um conjunto diferente de brinquedos para cada sessão.Limpe todos os brinquedos que serão apresentados aos camundongos com água e sabão e etanol a 80%. Para remover qualquer odor, desloque os grupos de rodas de corrida e moradia padrão da mesma maneira e por um período semelhante todos os dias, mas sem a adição dos materiais de enriquecimento superdimensionado no dia anterior à implantação. Utilizando técnica asséptica, encha cada bomba osmótica estéril, tubo de conexão e cânula com solução estéril do fármaco ou veículo, conforme as instruções do fabricante.Em seguida, conecte as peças e incube-as durante a noite em salina estéril a 37 graus Celsius no dia da cirurgia. Após confirmar a sedação por meio do teste do pinoço, aplique pomada oftálmica no animal e posicione-o em decúbito dorsal sobre uma placa aquecida. A seguir, utilizando técnica asséptica, faça uma incisão mediana na pele, iniciando dois centímetros posteriormente à borda posterior do crânio e terminando entre os olhos; disseque cuidadosamente a pele da fáscia subjacente ao longo das costas do camundongo, criando um bolsão subcutâneo grande o suficiente para acomodar confortavelmente a bomba e o tubo de conexão.Em seguida, raspe a fáscia limpa da região dorsal do crânio e use uma broca dentária com diâmetro de aproximadamente 1,5 milímetro para perfurar o crânio nas coordenadas estereotáxicas apropriadas até que reste uma camada fina e flexível de osso, remova esta camada com pinça fina. Uma vez que o crânio esteja livre de qualquer sangue e fragmentos ósseos e não haja mais sangramento, use um suporte de cânula para posicionar a bomba e o tubo de conexão no bolsão recém-criado. Agora, posicione a ponta da cânula nas coordenadas estereotáxicas apropriadas na superfície do cérebro e, em seguida, abaixe cuidadosamente o tubo no cérebro, um milímetro antes da profundidade necessária.Certifique-se de que a superfície do crânio esteja limpa e seca novamente, e então use um palito de dente para espalhar acrilato dental recém-preparado sobre toda a área exposta do crânio, incluindo o orifício de trepanação ao redor da cânula, antes que o acrilato endureça. Abaixe a ponta da cânula até a profundidade restante no alvo. Em seguida, quando a cânula estiver posicionada, aplique cuidadosamente uma segunda camada de acrilato dental recém-preparado sobre o crânio e também sobre o suporte plástico branco da cânula, fixando-a firmemente no lugar.Após a cura do acrílico, remova cuidadosamente o suporte da cânula e use uma lâmina de bisturi aquecida para derreter a aba plástica da cânula. Em seguida, feche a pele com pontos cirúrgicos sobre todo o implante. Aplique pomada antisséptica nas bordas da pele e administre um anti-inflamatório ao animal.Por fim, remova o camundongo da estrutura. Coloque-o sob uma lâmpada de aquecimento e monitore o animal até que esteja completamente recuperado. Camundongos machos adultos acasalados com camundongas adultas por sete dias apresentam aproximadamente 12% mais neurônios na área positiva para tirosina hidroxilase do SNc do mesencéfalo do que machos acasalados com machos.Por outro lado, fêmeas acasaladas com machos possuem aproximadamente 12% menos neurônios positivos para TH na SNC do que fêmeas acasaladas com fêmeas. O número de neurônios positivos para TH na SNC e na área tegmental ventral também é aumentado em camundongos machos adultos submetidos a um acasalamento enriquecido ambientalmente mais superenriquecimento por 14 dias. Com o enriquecimento ambiental mais superenriquecimento, animais que receberam infusão de veículo exibiram aproximadamente 14% mais neurônios positivos para TH na SNC.Em seguida, animais mantidos em condições padrão infundidos com veículo e animais submetidos a alojamento ambientalmente enriquecido mais enriquecimento superior com infusão de antagonista do receptor gabaa, no entanto, não apresentam esse aumento. Ao tentar manipulações ambientais, é importante lembrar-se de minimizar ao máximo qualquer perturbação aos animais, como manter o ruído no mínimo e evitar mudanças de gaiola. Muitas vezes, ao configurar um ambiente enriquecido, é essencial incluir materiais variados para ninho e manter o local do ninho constante para minimizar o estresse dos seus animais.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como manipular o ambiente de camundongos adultos para provocar alterações no cérebro e no comportamento. Não se esqueça de que, ao trabalhar com drogas, elas podem ser extremamente perigosas; portanto, use sempre roupas de proteção ao preparar as bombas osmóticas.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Principal dissociada mesencéfalo culturas de células de dopamina permitir o estudo das características pré-sináptica dos neurônios dopaminérgicos. Eles podem ser usados ​​para monitorar em tempo real a cinética de liberação de dopamina e proteína / mRNA níveis de reguladores de exocitose dopamina. Aqui, nós mostrar-lhe como gerar essas culturas de recém-nascidos de roedores.

Principal Dissociated Midbrain dopamina culturas de células de recém-nascidos de roedores

Um protocolo para a realização unilaterais 6-OHDA lesões do feixe prosencéfalo medial em ratinhos é descrito. Este método tem uma baixa taxa de mortalidade (13,3%) com 89% dos animais sobreviventes mostrando&gt; perda de 95% da dopamina do estriado e 90,63 ± -4,02% viés ipsiversive rotacional para o lado da lesão.

Desenvolvimento de um Unilateralmente-lesionadas modelo de rato 6-OHDA da Doença de Parkinson

A dopamina é distintamente regulada nos núcleos mesencéfalo, que contêm a célula corpos e dendrites de os neurónios de dopamina. Descrevemos aqui uma abordagem dissecção e manipulação da amostra para maximizar os resultados, e, assim, conclusões e compreensão, na regulação da dopamina nos núcleos mesencéfalo da substantia nigra (SN) e área tegmental ventral (VTA) em roedores.

Profiling abrangente do Regulamento dopamina em substância negra e área tegmental ventral

Nos distúrbios da doença de Parkinson e de movimento, em geral, os ensaios comportamentais sensíveis e fiáveis ​​são essenciais para testar novas terapêuticas potenciais. Aqui, descrevemos uma bateria gerenciável de testes sensório-motores para os ratos que são sensíveis a diferentes graus de lesão no sistema nigroestriatal e útil para estudos pré-clínicos.

Avaliação da função sensório-motora em rato modelos de doença de Parkinson

Os métodos para a manipulação e análise de NF-kB-dependente neurogenesis adulto hipocampo são descritos. Um protocolo detalhado é apresentado para o teste de comportamento dependente do giro dentado (denominado o padrão de separação espacial-Barnes labirinto) para a investigação dos resultados cognitivos em ratos. Esta técnica também deve ajudar a permitir investigações em outras configurações experimentais.

Os métodos para a modulação e Análise de NF-kB-dependente Adulto Neurogenesis

Os isozimos lipoxygenase (LOX) podem gerar produtos que podem aumentar ou diminuir a neuroinflamação e neurodegeneração. Um estudo de interação gene-ambiente poderia identificar efeitos específicos da isozyme lox. Utilizando o modelo 1-metil-4-fenil-1,2,3,3,6-tetrahidropyridine (MPTP) de dano nigrostriatal em duas linhas transgênicas deficientes de isozim lox permite comparar a contribuição de isozimes LOX na integridade e inflamação do dopaminérgico.

Modelos de interação gene-ambiente para desmasca mecanismos de suscetibilidade na doença de Parkinson

Os neurônios dopaminérgicos desempenham um papel regulador vital no cérebro. Sua perda está associada à doença de Parkinson. Neste vídeo, mostramos como gerar culturas primárias de neurônios dopaminérgicos centrais a partir de mesencéfalo embrionário de camundongo. Tais culturas são úteis para estudar a extrema vulnerabilidade desses neurônios a vários estresses.

Cultura primária de neurônios dopaminérgicos mouse

As causas da degeneração dos neurônios dopaminérgicos do mesencéfalo durante a doença de Parkinson não são totalmente compreendidas. Os sistemas de cultura celular fornecem uma ferramenta essencial para o estudo das propriedades neurofisiológicas desses neurônios. Aqui apresentamos um protocolo otimizado, que pode ser utilizado para modelagem in vitro da neurodegeneração.

Isolamento, cultura e Long-Term Manutenção da Primária mesencefálico Dopaminergic neurônios dos cérebros de roedores Embryonic

Absorção de dopamina synaptosomal e ferramentas experimentais de cromatografia líquida de alto desempenho análise representam para investigar a homeostase de dopamina em camundongos avaliando-se a função do transportador de dopamina e níveis de dopamina no tecido striatal, respectivamente. Aqui nós apresentamos protocolos para medir o teor de tecido de dopamina e avaliar a funcionalidade do transportador de dopamina.

Avaliação da homeostase Dopaminergic em camundongos pelo uso de análise de cromatografia líquida de alta performance e captação da dopamina Synaptosomal

Este trabalho apresenta um protocolo passo a passo para a estimativa stereological imparcial de números de celular neuronal dopaminérgicos na substância negra do mouse usando o equipamento padrão de microscopia (i.e., um microscópio de luz, uma tabela de objetos motorizado (x, y, z avião) e software de domínio público para análise de imagem digital.

Stereological estimativa do número de neurônios Dopaminergic na substância negra do Mouse usando o fracionador óptico e equipamento padrão de microscopia

Desenvolvemos um modelo de estresse de derrota social acelerada para camundongos adolescentes C57BL/6, que funciona em machos e fêmeas e permite a exposição durante períodos discretos da adolescência. A exposição a esse modelo induz evitação social, mas apenas em um subconjunto de camundongos machos e fêmeas derrotados.

Modelo de estresse de derrota social para camundongos adolescentes C57BL / 6 machos e fêmeas

Aprenda manipulações ambientais para estudar plasticidade cerebral e mudanças comportamentais em camundongos adultos. Este método utiliza enriquecimento ambiental e pareamento por gênero para investigar neuroplasticidade.

Modulações Ambientais do número de Midbrain dopamina Neurônios no Adulto Mice

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