Name: Aproveitando a demanda Bioorthogonal Inverse Electron Diels-Alder para Pretargeted PET Imagem (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-03T15:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: Aprenda a técnica de imagem PET pré-direcionada para câncer colorretal utilizando reação bioortogonal entre tetrazina e trans-ciclooctina. Este método oferece alto contraste tumoral com menor dose de radiação.

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Os autores agradecem ao Prof. Ralph Weissleder, Dr. Pat Zanzonico e Dr. NagaVaraKishore Pillarsetty pelas conversas úteis e ao NIH pelo financiamento (BMZ: 1K99CA178205-01A1)

ÉTICA DECLARAÇÃO: Todas as experiências com animais in vivo descritos foram realizados de acordo com um protocolo aprovado e sob as diretrizes éticas do Memorial Sloan Kettering Cancer Center, Animal Care Institucional e Comitê de Uso (IACUC). 1. Síntese de Tz-Bn-NOTA <ol><li> Num recipiente de reacção pequeno, dissolver 7 mg NH2-Bn-NOTE (1,25 x 10 ~ 2 mmol) em 600 ul de tampão de NaHCO3 (0,1 M, pH 8,1). Verificar o pH da solução. Se necessário, ajustar o pH da solução para 8,1 utilizando pequenas alíquotas de 0,1 M de Na 2 CO 3. </li><li> Adicionar a solução de NH 2-Bn-NOTE a 0,5 mg Tz-NHS (1,25 x 10 -3 mmol) num tubo de microcentrífuga de 1,7 ml. NOTA: O Tz-NHS pode ser pesadas seco ou adicionado de uma solução de estoque de DMSO ou DMF seco (&lt;50 ul). </li><li> Permitir que a solução de reacção resultante a reagir durante 30 min à TAcom agitação moderada. </li><li> Após 30 min, purificar o produto utilizando cromatografia em C 18 de HPLC de fase reversa, para remover não reagido NH2-Bn-NOTE. O NH 2 -Bn-NOTA pode ser monitorado em um comprimento de onda de 254 nm, enquanto o Tz-NHS e Tz-Bn-NOTA são melhor monitorados em um comprimento de onda de 525 nm. NOTA: Os tempos de retenção são obviamente altamente dependente da configuração do equipamento de HPLC de cada laboratório (bombas, colunas, tubos, etc). No entanto, para apresentar um exemplo, se um gradiente de 0: 100 de MeCN / H 2 O (ambos com 0,1% de TFA) até 100: 0 de MeCN / H2O ao longo de 25 min e uma analítica de 4,6 x 250 mm coluna C 18 é usada , os tempos de retenção de Tz-Bn-NOTA, Tz-NHS, e NH2-Bn-NOTE será de cerca de 15 min, 16,5 min e 10 min, respectivamente. O produto pode ser purificado a partir de outros componentes da reacção em um único ou múltiplos de execução é executado utilizando uma coluna C 18 preparativa ou semi-preparativa de HPLC. 1 H-RMN, analytical HPLC e ESI-MS são todos os métodos que podem ser utilizados para verificar a pureza do precursor de completada Tz-Bn-NOTE 11. </li><li> Congelar o eluente HPLC coletados utilizando nitrogênio líquido. </li><li> Enrole o tubo de coleta congelado em papel de alumínio opaco. </li><li> Colocar o tubo de recolha congelado num recipiente de liofilização S / N para remover a fase móvel de HPLC. </li><li> Armazenar o produto purificado (um sólido cor de rosa claro) no escuro a -80 ° C. NOTA: Este é um ponto de parada aceitável no procedimento. O precursor Tz-Bn-NOTE concluída é estável durante pelo menos 1 ano, sob estas condições. </li></ol> 2. Preparação de huA33-TCO Imunoconjugado <ol><li> Num tubo de microcentrífuga de 1,7 ml, preparar um 1 mg / ml de solução de TCO-NHS em DMF seca (2,7 mM). </li><li> Num tubo de microcentrífuga de 1,7 ml, preparar uma solução de (13,3 mM) de huA33 em 1 ml de solução salina tamponada com fosfato, pH 7,4 (0,01 M de PO 4 3- 2 mg / ml, </sub&gt; 0,154 M de NaCl). </li><li> Usando pequenas alíquotas (&lt;5 ul) de 0,1 M de Na 2 CO 3, ajustar o pH da solução de anticorpo para 8,8-9,0. Utilize um papel de pH ou um medidor de pH com uma microeletrodos para monitorar o pH, e ter cuidado para não permitir que o pH a subir acima de pH 9,0. </li><li> Uma vez que a solução de anticorpo é o pH correcto, adicionar um volume da solução de TCO-NHS correspondentes a 8 equivalentes molares do éster activado. Por exemplo, adicionar 7,9 mL de solução a 1 mg / ml TCO-NHS (1,07 x 10 -7 mol TCO-NHS) para 1 ml de solução de 2 mg / mL de anticorpo huA33 (1,33 x 10 -8 moles huA33). Não ultrapasse 5% em volume em DMF a solução. </li><li> Misturar suavemente a solução invertendo o tubo várias vezes microcentrífuga. </li><li> Enrole o tubo de microcentrífuga em papel de alumínio opaco. </li><li> Permitir que a solução a incubar durante 1 hr à temperatura ambiente com agitação suave. </li><li> Após 1 h à temperatura ambiente, purificar o imunoconjugado resultante utilizando um siz descartável pré-embaladoe exclusão coluna de dessalinização. Em primeiro lugar, lavar a coluna de exclusão de tamanho tal como descrito pelo fornecedor para remover quaisquer conservantes presentes na coluna durante o armazenamento. Em seguida, adicione a mistura de reacção para a coluna de exclusão de tamanho, lavar a coluna com 1,5 ml de 0,9% de solução salina estéril, e em seguida recolher o produto utilizando-se 2 ml de solução salina estéril a 0,9%, como o eluente. NOTA: Esta etapa irá produzir o concluída huA33-TCO como uma solução de 2 ml. </li><li> Medir a concentração da resultante huA33-TCO em um espectrofotómetro de UV-Vis. </li><li> Se uma concentração mais elevada é desejada, concentra-se a solução huA33-TCO utilizando uma unidade de filtração centrífuga com um peso molecular de 50.000 de corte. NOTA: É importante observar que enquanto huA33 e uma variedade de outros anticorpos conhecidos (por exemplo, bevacizumab, trastuzumab, cetuximab, e J591) são muito tolerantes de ser concentrada, agregação e precipitação pode ocorrer após concentração em outros casos. Pesquisadores de tentar esta procedure com um novo anticorpo deve confiar na literatura ou o seu próprio conhecimento do anticorpo em questão diz respeito à possibilidade ou não de se concentrar o anticorpo. </li><li> Guardar o imunoconjugado completado huA33-TCO a 4 ° C no escuro. NOTA: Este é um ponto de parada aceitável no procedimento. O conjugado mAb TCO preenchido deve ser estável durante pelo menos 3 meses sob estas condições de armazenamento. </li></ol> 3. 64 Cu Radiomarcação de Tz-Bn-NOTA NOTA: Este passo do protocolo envolve o manuseamento e manipulação de radioactividade. Antes de executar estes passos - ou realizar qualquer outro trabalho com radioatividade - pesquisadores deve consultar com Radiação Secretaria de Segurança de sua instituição de origem. Tomar todas as medidas possíveis para minimizar a exposição à radiação ionizante. <ol><li> Num tubo de microcentrífuga de 1,7 ml, preparar uma solução de Tz-Bn-NOTE 0,5 mg / ml (723 uM). </li><li> Numa MicroC 1,7 mlentrifuge tubo, adicionar 10 ul da solução Tz-Bn-NOTE (5 ug) a 400 uL de tampão NH4OAc 0,2 M pH 5,5. </li><li> No interesse do bom radioquímica nota-keeping, medir e registrar a quantidade de radioactividade na amostra usando um calibrador de dose antes e depois das etapas que se seguiram no protocolo abaixo (3,4-3,8). Isso vai ajudar com a determinação exata da yields radioquímica. </li><li> Adicionar 2.000 ï¿½i (74 MBq) de 64 Cu à solução Tz-Bn-NOTA. NOTA: Tipicamente, [64 Cu] CuCl 2 é fornecido em um pequeno volume (&lt;30 ul) de HCl 0,1 N, e, por conseguinte, apenas pequenas quantidades (&lt;10 ul) desta solução de estoque são necessários para a reacção de marcação radioactiva. Se forem necessárias maiores volumes do [64 Cu] CuCl2 estoque, a reacção de marcação radioactiva é tolerante de aumentar o volume de reacção total. No entanto, o pH da solução de reacção radiomarcação devem ser cuidadosamente monitorizados para assegurarque ele não caia abaixo de pH 4.0. </li><li> Permitir que a solução a incubar durante 10 min à temperatura ambiente com agitação suave. </li><li> Após 10 min de incubação, purificar o produto usando cromatografia de HPLC de fase reversa C-18. Os tempos de retenção são obviamente altamente dependente da configuração do equipamento de HPLC de cada laboratório (bombas, colunas, tubos, etc). No entanto, para apresentar um exemplo, se um gradiente de 5:95 de MeCN / H 2 O (ambos com 0,1% de TFA) a 95: 5 de MeCN / H2O ao longo de 15 min é usada, o tempo de retenção de 64 Cu-Tz- Bn-NOTA deve ser em torno de 9,8 min, enquanto livre, não complexada 64 Cu eluirá com a frente do solvente em cerca de 2-4 min. </li><li> Usando um evaporador rotativo, remover o eluente de HPLC. </li><li> Recolher o produto de 64 Cu-Tz-Bn-NOTA em 0,9% de solução salina estéril. NOTA: Tendo em conta a 12,7 h meia-vida física de 64 Cu, este não é um ponto de paragem no processo aceitável. Realizar a síntese de 64 Cu-Tz-Bn-NOTUm imediatamente antes da injeção do radioactivo, e siga o passo a passo 3.7 imediatamente 4.5. </li></ol> 4. In Vivo Pretargeted de imagem PET NOTA: Como no Protocolo Secção 3, esta etapa do protocolo envolve o manuseamento e manipulação de radioactividade. Antes de executar estes passos pesquisadores deve consultar com Radiação Secretaria de Segurança de sua instituição de origem. Tomar todas as medidas possíveis para minimizar a exposição à radiação ionizante. <ol><li> Em um rato nu atímica feminino, implante subcutâneo 1 x 10 células de câncer colorretal 6 SW1222 e ​​permitir que estes se transformar em um 100-150 mm 3 heterólogo (9-12 dias após a inoculação) 11. </li><li> Dilui-se uma alíquota da solução-huA33 TCO Protocolo de secção 2 para uma concentração de 0,5 mg / ml em 0,9% de solução salina estéril. </li><li> Injectar 200 ul da solução-huA33 TCO (100 ug) na veia da cauda do rato xenoenxerto de rolamento. </li><li> Permitir que 24 horas para a acumulação do huA33-TCO no tumor do mouse. </li><li> Dilui-se a 64 de Cu-Tz-Bn-NOTE radioligando para uma concentração de 1,5 mCi / ml em 0,9% de solução salina estéril. </li><li> Injectar 200 ul da solução de ligando radioactivo 64 Cu-Tz-Bn-NOTE (300 uCi; 11,1; 1,6 MBq de 64 nmol de Cu-Tz-Bn-NOTA, assumindo uma actividade especifica de 6,7 MBq / nmol) na veia da cauda do camundongos portadores de xenotransplante. </li><li> No ponto de tempo de imagem desejada (por exemplo, 2, 6, 12, ou 24 horas após a injecção), anestesiar o rato com uma isoflurano a 2%: mistura de gás oxigénio. </li><li> Posicione o mouse em cima da cama do pequeno scanner de PET animal. Manter a anestesia durante a varredura usando um isoflurano 1%: mistura de gás oxigênio. Antes de colocar o animal na mesa do scanner, verifique anestesia utilizando o método toe-pitada e aplicar pomada veterinária aos olhos do mouse para evitar o ressecamento durante a anestesia. </li><li> Adquirir os dados de PET para o mouse através de um estáticodigitalizar com um mínimo de 20 milhões de eventos coincidentes, utilizando uma janela de energia de 350-700 keV e uma janela de tempo coincidência de 6 ns. Depois de concluir a aquisição da imagem, não deixe o mouse autônoma e não colocá-lo em uma gaiola com outros ratos até que recuperou a consciência. </li></ol>

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<li>Carrasquillo, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((124I-huA33+antibody+PET+of+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">124I-huA33 antibody PET of colorectal cancer.</a> Journal of Nuclear Medicine. 52, 1173-1180 (2011).</li>
<li>Sakamoto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phase+I+radioimmunolocalization+trial+of+humanized+monoclonal+antibody+huA33+in+patients+with+gastric+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Science%22%5BJournal%5D)">A phase I radioimmunolocalization trial of humanized monoclonal antibody huA33 in patients with gastric carcinoma.</a> Cancer Science. 97, 1248-1254 (2006).</li>
<li>Rossin, R., Lappchen, R., vanden Bosch, S. M., LaForest, R., Robillard, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diels-Alder+reaction+for+tumor+pretargeting%3A+In+vivo+chemistry+can+boost+tumor+radiation+dose+compared+with+directly+labeled+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">Diels-Alder reaction for tumor pretargeting: In vivo chemistry can boost tumor radiation dose compared with directly labeled antibody.</a> Journal of Nuclear Medicine. 54, 1989-1995 (2013).</li>
<li>Rossin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+reactive+trans-cyclooctene+tags+with+improved+stability+for+Diels-Alder+chemistry+in+living+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Highly reactive trans-cyclooctene tags with improved stability for Diels-Alder chemistry in living systems.</a> Bioconjugate Chemistry. 34, 1210-1217 (2014).</li>
<li>Emmetiere, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((18F-labeled-bioorthogonal+liposomes+for+in+vivo+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">18F-labeled-bioorthogonal liposomes for in vivo targeting.</a> Bioconjugate Chemistry. 24, 1784-1789 (2013).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

A principal vantagem desta estratégia de imagem PET pretargeted é que ele é capaz de delinear com tumores alvo-fundo-de contraste de imagem em apenas uma fracção da dose de radiação de fundo produzida por anticorpos marcados directamente. Por exemplo, no sistema de imagem do cancro colo-rectal descrito aqui, os dados obtidos em experiências de biodistribuição agudas foram utilizados para realizar os cálculos de dosimetria para a estratégia de pré-direccionamento com base de Cu-64, juntamente com directamente ...

Ao longo dos últimos trinta anos, a tomografia por emissão de pósitrons (PET) tornou-se uma ferramenta indispensável para o diagnóstico e tratamento do câncer. Os anticorpos têm sido considerados promissores vectores para a entrega de radioisótopos emissores de positrões para tumores devido à sua afinidade e especificidade para requintado biomarcadores de cancro. 1,2 farmacocinética No entanto, a relativamente lenta in vivo de anticorpos exige a utilização de radioisótopos com multi-dia semi-vidas físicas. Esta combinação pode render altas doses de radiação para os órgãos não-alvo de doentes, uma importante complicação que é de especial importância clínica desde radioimunoconjugados são injetados por via intravenosa e, portanto, - ao contrário de tomografias corpo parciais - resultado em doses absorvidas em cada parte do corpo, independentemente dos tecidos interrogados. A fim de contornar este problema, esforço significativo foi dedicado ao desenvolvimento de estratégias de imagem PET que dissociar o radioisótopo e do grupo alvo, o que reforça as propriedades vantajosas de anticorpos contornando simultaneamente suas limitações farmacocinéticos intrínsecos. Estas estratégias - mais frequentemente denominado prï¿½marcaï¿½o ou segmentação de várias etapas - empregam tipicamente quatro passos: (1) a administração de um anticorpo capaz de se ligar tanto a um antigénio e um radioligando; (2) a acumulação de anticorpos no tecido-alvo e a sua depuração do sangue; (3) a administração de uma pequena molécula radioactivo; e (4) da ligação in vivo do ligando radioactivo ao anticorpo, seguido pela rápida eliminação do excesso de radioligando 3-8 Em alguns casos., um agente de compensação adicional é injectado entre as etapas 2 e 3, a fim de acelerar a eliminação de qualquer anticorpo que ainda tem que se ligar o tumor e permanece no sangue. 5 Em termos gerais, twO tipos de estratégias pré-direccionamento são mais prevalentes na literatura. Embora ambos provaram ser um sucesso em modelos pré-clínicos, eles também possuem limitações fundamentais que têm impedido a sua aplicabilidade clínica. A primeira estratégia baseia-se na elevada afinidade entre os anticorpos e conjugados estreptavidina-radiomarcadores modificados com biotina; no entanto, a imunogenicidade dos anticorpos modificados com estreptavidina provou ser um problema preocupante no que diz respeito à tradução. 5,6,9,10 A segunda estratégia, em contrapartida, utiliza anticorpos biespecíficos que foram geneticamente modificadas para se ligarem tanto um cancro antigénio biomarcador e um pequeno hapteno marcado radioactivamente molécula. 3,11-14 Embora esta última via é certamente criativa, a sua ampla aplicabilidade é limitada pela complexidade, custo e falta de modularidade do sistema. Recentemente, desenvolveu e publicou uma metodologia de imagem PET pretargeted baseado na procura de elétron inversa Diels-Alder (IEDDA) reação de cicloadição entre -cicloocteno trans (TCO) e tetrazina (Tz;. Figura 1) 11 Embora a própria reação tem sido conhecida há décadas, IEDDA química experimentou um renascimento nos últimos anos como uma técnica bioconjugação clique química, como ilustrado pelo o trabalho fascinante dos grupos de Ralph Weissleder, Joseph Fox, e Peter Conti entre outros. 12-15 A IEDDA cicloadição foi aplicado numa grande variedade de configurações, incluindo imagiologia por fluorescência com péptidos, anticorpos e nanopartículas, bem como imagiologia nuclear . com ambas radiohalogens e radiometais 16-26 A ligação é de alto rendimento, limpo, rápido (k 1&gt; 30.000 M-1 s-1), seletivo, e - criticamente -. bioorthogonal 27 E, enquanto uma série de tipos de clique química - incluindo cicloadições catalisada por Cu azida-alcino, cicloadições azida-alcino promoveu-deformação e Staudinger ligções -. bioorthogonal estão bem, é a combinação única de cinética de reação rápida e bioorthogonality que faz IEDDA química tão bem adaptado para prï¿½marcaï¿½o aplicações em organismos inteiros 28,29 Nesse sentido, é importante notar que o relatório recente da nossa laboratórios não foi o primeiro a aplicar IEDDA química para prï¿½marcaï¿½o: o primeiro relato da imagem pretargeted com IEDDA surgiu a partir do trabalho de Rossin, et al e contou com uma metodologia SPECT empregando um 111 tetrazina Em marcado 30.. Como discutimos acima, a metodologia prï¿½marcaï¿½o tem quatro passos bastante simples (Figura 2). No protocolo a mão, uma estratégia para a pretargeted imagens PET de cancro colo-rectal que emprega uma 64 Cu-NOTE-radioligando marcado tetrazina e um conjugado de TCO-modificada do anticorpo huA33 será descrito. No entanto, em última análise, a modularidade desta metodologia é um dos seus grEatest activos, como a porção -cicloocteno trans pode ser adicionado a qualquer anticorpo não de internalização, e o tetrazina pode ser ligado a uma vasta variedade de repórteres radioactivos.

<table><tbody><tr><td>Tetrazina NHS Ester</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>764701</td><td>Store em -80 &deg; C</td></tr><tr><td>Trans-cicloocteno NHS Ester</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>764523</td><td>Store em -80 &deg; C</td></tr><tr><td>p-NH2-Bn-NOTA</td><td>Macrocíclicos</td><td>B-601</td><td>Armazenar a -80 &deg; O</td></tr></tbody></table>

aproveitando a demanda bioorthogonal inverse electron diels-alder para pretargeted pet imagem

Harnessing the Bioorthogonal Inverse Electron Demand Diels-Alder Cycloaddition for Pretargeted PET Imaging

Devido à sua afinidade e especificidade requintadas, os anticorpos tornaram-se vetores extremamente promissores para a entrega de radioisótopos a células cancerígenas para imagens de PET. No entanto, a necessidade de marcar anticorpos com radionuclídeos com meias-vidas físicas longas geralmente resulta em altas taxas de dose de radiação de fundo para tecidos não-alvo. Para contornar esse problema, empregamos uma estratégia de imagem PET pré-direcionada baseada na reação de cicloadição de Diels-Alder de demanda inversa de elétrons. A metodologia dissocia o anticorpo da radioatividade e, assim, explora as características positivas dos anticorpos, evitando suas desvantagens farmacocinéticas. O sistema é composto por quatro etapas: (1) a injeção de um conjugado mAb-trans-cicloocteno (TCO); (2) um período de tempo de localização durante o qual o anticorpo se acumula no tumor e desaparece do sangue; (3) a injeção da tetrazina radiomarcada; e (4) a ligadura por clique in vivo dos componentes seguida pela eliminação do excesso de radioligante. No exemplo apresentado no trabalho em questão, um radioligante tetrazina marcado com 64-NOTA e um anticorpo humanizado conjugado com transcicloocteno (huA33) foram usados com sucesso para delinear tumores de câncer colorretal SW1222 com alto contraste tumor-fundo. Além disso, a metodologia de pré-direcionamento produz imagens de alta qualidade com apenas uma fração da dose de radiação para tecido não-alvo criado por radioimunoconjugados marcados diretamente com 64ou 89Zr. Em última análise, a modularidade deste protocolo é um de seus maiores trunfos, pois a porção transcicloocteno pode ser anexada a qualquer anticorpo não internalizante e a tetrazina pode ser ligada a uma ampla variedade de radioisótopos.

Os três primeiros passos da experiência - a síntese de Tz-Bn-NOTA, a conjugação da TCO para huA33, e a marcação radioactiva do Tz-Bn-NOTE construir (Figuras 3 e 4) - são altamente fiáveis. No caso do processo acima descrito, o construto Tz-Bn-NOTE foi sintetizado com elevado rendimento e pureza. O anticorpo foi modificado com huA33 4,2 ± 0,6 TCO / mAb, e Tz-Bn-NOTE foi marcado radioactivamente com 64 Cu, para se obter o radioligando purificada em&gt; 99% de pureza radioquímic...

A cicloadição de Diels-Alder de demanda inversa de elétrons bioortogonal foi aproveitada para criar uma estratégia de imagem PET pré-direcionada eficaz e modular para o câncer. Neste protocolo, as etapas desta metodologia são descritas no contexto de um sistema modelo que emprega o anticorpo direcionado ao câncer colorretal huA33 e um radioligante marcado com 64.

Aproveitando a demanda Bioorthogonal Inverse Electron Diels-Alder para Pretargeted PET Imagem

Due to their exquisite affinity and specificity, antibodies have become extremely promising vectors for the delivery of radioisotopes to cancer cells for ...

O objetivo geral do experimento a seguir é pré-direcionar tecido canceroso utilizando uma reação bioortogonal entre tetrazina e trans-cicloocteno para imagem por PET. Isso é alcançado pela injeção de um anticorpo marcado com trans-cicloocteno em um camundongo portador de tumor, seguida por um período de intervalo durante o qual o anticorpo se acumula lentamente no tumor e é eliminado do sangue. Um radio-ligante de tetrazina é então injetado no mesmo animal.O radiofármaco liga-se a um anticorpo marcado com TCO no tumor, e, por ser uma molécula pequena, é rapidamente eliminado do sangue. A imagem de PET em pequenos animais resultante mostra uma delineação clara do tumor, com alto contraste e elevadas relações de atividade entre tumor e fundo. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como a imagem de PET com anticorpos diretamente marcados, é que ela fornece imagens de alto contraste com apenas uma fração da dose de radiação ao paciente.As implicações desta técnica estendem-se à terapia, pois técnicas de pré-alvo podem entregar quantidades muito elevadas de radiação aos tumores, enquanto, ao mesmo tempo, as doses administradas aos órgãos saudáveis e aos tecidos normais serão muito baixas. Demonstrarei esta técnica juntamente com Catherine Kaza, técnica em nosso laboratório. A reação de síntese inicia-se pela dissolução de sete miligramas de NH2-BN-Notta em 600 microlitros de bicarbonato de sódio 0,1 molar com pH 8,1.Verifique o pH e use alíquotas pequenas de carbonato de sódio 0,1 molar para ajustar o pH a 8,1, se necessário. Em seguida, adicione esta solução a 0,5 miligramas de TZ NHS em um tubo de microcentrífuga. Deixe esta reação incubar por meia hora à temperatura ambiente com agitação suave.O estoque de TZ NHS pode ser dissolvido em DMF ou DMSO após meia hora. Purifique o produto por HPLC em fase reversa C 18 para remover o NH dois BN notta não reativo, que será detectado em 254 nanômetros. A monitoração do TZ NHS e do TZ BN Notta é melhor realizada em 525 nanômetros.O tempo de retenção da amostra variará conforme o equipamento, mas utilizando um gradiente de acetonitrila para água de zero a 100, 100 a zero durante 25 minutos e uma coluna analítica C18 de 4,6 por 250 milímetros, os tempos de retenção serão de 16,5, 15 e 10 minutos, respectivamente, para os três compostos. Congele o efluente coletado da CLAE em nitrogênio líquido e, em seguida, envolva o tubo em folha opaca. Agora, coloque o tubo congelado em um recipiente para liofilização e deixe-o no liofilizador durante a noite.Para remover a fase móvel da CLAE e verificar a pureza do precursor final de TZ bn sem tampa superior, utilize CLAE analítica por RMN de prótons e/ou espectrometria de massas por ionização por eletrospray (ESI-MS). Inicie esta reação preparando uma solução de 2,7 milimolar de T-C-O-N-H-S em DMF em um tubo de microcentrífuga e, em um segundo tubo de microcentrífuga, prepare uma solução de dois miligramas por mililitro de HUA 33 em um mililitro de PBS pH 7,4.Em seguida, utilizando pequenas adições de carbonato de sódio 0,1 molar, ajuste o pH da solução entre 8,8 e 9,0, mas não superior a isso. A seguir, adicione um volume de T-C-O-N-H-S correspondente a oito equivalentes molares do éster ativado. Misture suavemente a solução com algumas inversões e envolva-a com papel alumínio.Em seguida, coloque o tubo para incubação à temperatura ambiente por cerca de uma hora com agitação suave. Após uma hora, utilize uma coluna descartável pré-embalada de exclusão por tamanho para dessalinização, a fim de purificar o imunoconjugado da reação. Adicione um mililitro da mistura de reação à coluna e, posteriormente, adicione 1,5 mililitro de solução salina estéril a 0,9%.Em seguida, elua o produto HUA 33 TCO humanizado com dois mililitros de salina 0,9%. Meça a concentração do produto com um espectrômetro UV-vis. Se a concentração for inferior à desejada, concentre o produto utilizando um filtro centrífugo de peso molecular 50.000.Inicie preparando uma solução de 0,5 miligramas por mililitro de TZ BN notta em um tubo de microcentrífuga. Em um segundo tubo de microcentrífuga, adicione 10 microlitros da solução de TZ BN Notta preparada a 400 microlitros de tampão de acetato de amônio 0,2 molar com pH 5,5. Certifique-se de medir e registrar a quantidade de radioatividade da sua amostra antes e depois de cada um dos próximos passos.Isso é essencial para o cálculo preciso dos rendimentos radioquímicos e para a manutenção de registros. Agora, adicione 2000 microcuries de cobre-64 à solução de TZ BN Notta. Incube esta mistura à temperatura ambiente por 10 minutos com agitação suave.Para purificar o produto, utilize HPLC em fase reversa C18, diluindo os produtos com um gradiente de acetonitrila-água de cinco a 95 até 95 a cinco ao longo de 15 minutos com 0,1% de TFA. O tz marcado com radionúclídeo, BN nota, será eluído aos 9,8 minutos, enquanto o cobre 64 livre será eluído com a frente do solvente entre dois e quatro minutos. Após usar um evaporador rotativo para remover o eluente da HPLC, dissolva o produto marcado com radionúclídeo em solução salina estéril a 0,9% e, em seguida, prossiga utilizando o produto o mais rápido possível. Este procedimento inicia-se pela diluição de um eloqua da solução de HEA 33 TCO preparada até uma concentração de 0,5 miligramas por mililitro em solução salina estéril a 0,9%.Em seguida, injete 200 microlitros da solução na veia da cauda do camundongo portador do xenoenxerto. Deixe o anticorpo humanizado a 33 TCO circular e se acumular no tumor por 24 horas. Após 24 horas, prepare o TZ BN Notta marcado com cobre 64 numa concentração de 1,5 MILICURIES por mililitro em solução salina estéril a 0,9%.Em seguida, utilize uma injeção na veia da cauda para administrar 200 microlitros da solução de radioligante preparada ao camundongo no momento desejado. Anestesie o camundongo e coloque-o sobre a plataforma de um escâner de animais pequenos. A anestesia deve ser mantida por meio de administração através de um cone nasal, e o estado anestesiado deve ser confirmado com um aperto no dedo do pé.Também para prevenir o ressecamento, aplique uma fina camada de pomada oftálmica. Agora, adquira os dados do animal utilizando um exame estático com 60 milhões de eventos coincidentes entre 350 e 700 quiloeletronvolts, e com um tempo de coincidência de seis nanossegundos. Após a aquisição de imagens, aguarde o camundongo recuperar a consciência antes de devolvê-lo à sua gaiola, possivelmente com outros camundongos. Camundongos nuos timectomizados portadores de câncer colorretal SW 1222 que expressa o antígeno 33.Xenografias foram examinadas utilizando o protocolo descrito. Tanto a biodistribuição aguda quanto os experimentos de imagem por PET revelam que a estratégia de pré-alvo é capaz de delinear o xenografte de câncer colorretal com excelente contraste de imagem e altas razões de atividade tumor/sobreposição. Ao longo de várias horas, o ligante radioativo é eliminado nas fezes e as razões de atividade tumor/sobreposição tornam-se bastante elevadas.Algumas variáveis nesta abordagem de pré-alvo precisaram ser otimizadas, assim como ocorreria com qualquer estratégia de imagem. A administração de 300 microgramas de anticorpo conjugado com TCO, em vez de 100 microgramas, resultou em aumento da radioatividade visível no coração do camundongo, o mesmo ocorrendo quando o intervalo foi reduzido de 24 para 12 horas. Em ambos os casos, a reação de "clique" ainda ocorreu no tumor, ilustrado de forma bastante clara pela captação tumoral nos pontos temporais iniciais.No entanto, a reação "click" está claramente ocorrendo também no sangue, o que não é desejado. Um equilíbrio delicado entre todas as variáveis de pré-direcionamento deve ser alcançado ao tentar este procedimento. É muito importante que a massa do imunoconjugado TCO, bem como o intervalo de tempo entre as injeções, sejam otimizados.Não se esqueça de que trabalhar com radioatividade pode ser extremamente perigoso, e precauções, como o uso de EPI apropriado e garantir que a radiação esteja blindada em todos os momentos, devem ser tomadas durante o experimento.

harnessing-bioorthogonal-inverse-electron-demand-diels-alder

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Bioengineering

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Este vídeo descreve a técnica de radioimunoterapia pré-direcionada ou PRIT, na qual imunoconjugados seguidos de radioligantes são administrados para o tratamento de tumores. Esta radioimunoterapia reduz as doses de radiação para tecidos saudáveis e utiliza radionuclídeos com meias-vidas muito baixas, incompatíveis com vetores baseados em anticorpos.

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Nós apresentamos um método para a rápida imobilização, reversível de moléculas pequenas e montagens de nanopartículas funcionalizadas para a superfície Plasmon Resonance (SPR) estudos, usando seqüencial on-chip química cicloadição bioorthogonal e antígeno-anticorpo de captura.

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