Bioluminescência imagem de um modelo animal para imunocompetentes Glioblastoma

As células de glioma GL261 fornecem um modelo animal imunocompetente útil de glioblastoma. Os objetivos deste protocolo são demonstrar técnicas adequadas para monitorar o crescimento do tumor intracraniano usando imagens de bioluminescência in vivo e verificar a utilidade das células GL261 modificadas com luciferase para estudar a imunologia tumoral e abordagens imunoterapêuticas para o tratamento do glioblastoma.

O objetivo geral deste protocolo é demonstrar as técnicas adequadas para monitorar o crescimento de células tumorais e tumores intracranianos usando imagens de bioluminescência in vivo para verificar a utilidade da modificação da luciferase de células tumorais murinas GL261. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no estudo da imunologia tumoral e da abordagem imunoterapêutica. Por exemplo, se a modificação do estresse afeta a proliferação celular GL261 e cresce in vivo.

A principal vantagem desta técnica é que a modificação da luciferase das células tumorais GL261 facilita o monitoramento não invasivo de seu crescimento e resposta ao tratamento in situ. Quando a cultura de células de luciferase GL261 atingir 70% de confluência em um frasco T75, colha as células por tripsinização. Conte as células e transfira-as para uma placa de 24 poços em densidades graduadas.

Após três horas em uma incubadora de cultura de células, abra o software de imagem de bioluminescência e inicialize o sistema de imagem. Quando a câmara tiver arrefecido para 90 graus Celsius negativos, defina o software de imagem para Luminescente com um tempo de exposição de 10 segundos e um Binning médio. Em seguida, incube as células em 25 microlitros de luciferina por poço por um minuto à temperatura ambiente e coloque a placa na estação de imagem.

Selecione Adquirir para iniciar a imagem. Quando uma imagem for obtida com sucesso, uma janela de imagem e uma paleta de ferramentas aparecerão. Clique nas Ferramentas de Regiões de Interesse e selecione 6 por 4 no ícone de fenda.

Cubra a área do sinal com fendas de 6 por 4 e selecione o ícone de lápis na guia Medidas. Uma janela com uma tabela de medidas de região de interesse como unidades de fótons por segundo por esterradiano por centímetro quadrado aparecerá. Para realizar um ensaio de proliferação in vitro, colha as culturas de células como acabamos de demonstrar quando atingirem 70% de confluência.

E use uma pipeta multicanal para colocar as células tumorais em 20 poços, cada um de uma placa de 96 poços a 1,5 vezes 10 elevado às 3ª células por 80 microlitros de meio RPMI por poço. Para limitar a evaporação das culturas de células, encha os poços vazios circundantes com 100 microlitros de meio RPMI fresco. Em seguida, para avaliar a proliferação celular, adicione 20 microlitros de reagente MTS a cada poço de células.

E incube a placa a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Após três horas, use um leitor de microplacas para medir a absorbância em 490 nanômetros. Para normalizar os valores de absorbância, divida os valores de cada dia pelas leituras correspondentes obtidas no primeiro dia.

No dia da implantação, suspenda uma vez 10 elevado a 5 células por microlitro em HBSS sem cálcio e magnésio de uma cultura de células tumorais confluentes a 70%. Em seguida, depois de confirmar o nível apropriado de sedação por pinça do dedo do pé, raspe o topo da cabeça de cada animal experimental. Usando uma aplicação de ponta de algodão, limpe cada crânio com 2% de clorexidina.

Em seguida, aplique lubrificante nos olhos de cada mouse. Agora use um bisturi estéril para fazer uma incisão sagital de aproximadamente 1 centímetro de comprimento sobre o osso occipital parietal do primeiro animal. E limpe a superfície do crânio novamente com peróxido de hidrogênio a 3%, observando o bregma aparente.

Em seguida, usando uma agulha estéril de calibre 25, faça um orifício de 3 milímetros no crânio à direita do bregma e logo atrás da sutura coronal. Para garantir a profundidade de injeção adequada, use uma tesoura para cortar 3 milímetros da extremidade pontiaguda de uma ponta de pipeta de 20 microlitros e deslize uma seringa Hamilton de calibre 26 na ponta até que 3 milímetros da agulha estejam saindo da extremidade da ponta. Insira a agulha no orifício do crânio e injete lentamente 3 microlitros de 3 vezes 10 na 5ª das células tumorais durante um período de um minuto.

Deixe a agulha no lugar por mais um minuto e retire-a lentamente. Troque o osso exposto por peróxido de hidrogênio a 3% e solução de clorexidina a 2%. Em seguida, depois de secar o crânio com um aplicador de ponta de algodão fresco, corte um pedaço de 3 milímetros quadrados de cera de osso estéril e prenda a cera na extremidade nua de um aplicador de ponta de algodão.

Cubra o local da injeção com a cera óssea. Em seguida, use uma pinça para desenhar cada lado do couro cabeludo sobre a cera. Depois de fechar a ferida e administrar a analgesia pós-operatória apropriada, repita o procedimento para cada animal experimental.

Para obter imagens do crescimento do tumor intracraniano, primeiro inicialize a estação de imagem como acabamos de demonstrar. Em seguida, depois de confirmar o nível apropriado de sedação por pinça de cauda, configure os parâmetros do sistema de imagem conforme demonstrado. Com exceção de selecionar Automático para o tempo de exposição.

Quando o sistema de imagem estiver pronto, coloque os mouses na estação de imagem e selecione Adquirir para obter imagens da expressão da luciferase. Quando a imagem for adquirida com sucesso, selecione a ferramenta Região de interesse na paleta de ferramentas e Automático no ícone de círculo. Circunde as áreas de sinal para definir as regiões de interesse e, em seguida, obtenha medições das regiões como unidades de fótons por segundo, por esterradiano por centímetro quadrado.

Finalmente, remova os camundongos da câmara de imagem e monitore os animais portadores de tumor até que estejam totalmente recuperados. A imagem de bioluminescência in vitro de células GL261 infectadas com lentivírus contendo luciferase exibe uma expressão robusta de luciferase semelhante aos níveis de luciferase expressos por uma linha celular de glioblastoma humano com expressão de luciferase U87MG de controle positivo. Como esperado, as células GL261 não infectadas não exibem expressão de luciferase de fundo.

Antes do implante intracraniano, não foi observada diferença nas taxas de crescimento in vitro das linhagens celulares de luciferase GL261 e GL261. Como demonstra a imagem de bioluminescência seriada de animais injetados em tumores intracranianos, as células tumorais que expressam luciferase GL261 também exibem uma taxa de crescimento rápida e consistente in vivo, sem diferença significativa nas taxas de sobrevivência entre os grupos experimentais portadores de tumor observados. Uma vez dominada, essa técnica pode ser usada para obter imagens de até 25 ratos por hora, se for executada corretamente.

Após seu desenvolvimento, esta técnica aumenta a capacidade da imagem de bioluminescência de ser útil para monitorar o crescimento do tumor GL261 in vivo, promovendo a investigação de respostas imunoterapêuticas em modelos de camundongos imunocompetentes.