Name: Bioluminescência imagem de um modelo animal para imunocompetentes Glioblastoma (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Aprenda a monitorar o crescimento de tumores intracranianos usando imagem de bioluminescência in vivo com células GL261 modificadas com luciferase. Este método permite o acompanhamento não invasivo do desenvolvimento tumoral e das respostas ao tratamento em modelos murinos imunocompetentes de glioblastoma.

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Gostaríamos de agradecer a Rajwant Kaur pela assistência técnica. Gostaríamos de agradecer a Maxwell Tom pela ajuda na preparação do lentivírus. Este trabalho foi apoiado pela Cadeira Dotada de Reza e Georgianna Khatib em Cirurgia de Tumor da Base do Crânio na UCSF, e pelo Professor e Presidente Michael J. Marchese da Northwestern University.

Todos os procedimentos descritos abaixo foram revistos e aprovados pelo Institutional Uso de Animais e Cuidados Comitê da Universidade Northwestern e foram realizadas em condições esterilizadas. 1. Modificação de células GL261 com Firefly luciferase Expressando Reporter NOTA: lentivirais baseados em HIV-1 expressam a luciferase do pirilampo (Fluc) sob o controlo do promotor de baço formadoras de focos de vírus (SFFV). O gene repórter óptica foi clonado no vector plasmídeo pHRSIN-CSGW-dlNotI. <ol><li> Manter a 293-T as células em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com soro a 10% de bovino fetal (FBS) e células GL261 em meio RPMI suplementado com 10% FBS e 1% de penicilina-estreptomicina a 37 ° C numa atmosfera humidificada contendo 95 % de ar e 5% de dióxido de carbono (CO 2). </li><li> Quando a cultura de células 293-T atinge 80% de confluência num frasco de T-75, lavar as células uma vez com pHsolução salina de tampão osphate (PBS) sem Ca2 + e Mg2 +, incubar as células com 3 ml de tripsina (0,05%) a 37 ° C durante 5 minutos, tritura-se com uma pipeta de 5 mL, mantendo o balão ligeiramente inclinada e recolher todas as células a partir do fundo do balão. Transferir a 3 ml de suspensão de células tripsinizadas em um tubo de 15 ml, e adiciona 7 ml de meio RPMI carne (um total de 10 ml da suspensão de células). </li><li> Misture bem a suspensão de células com uma pipeta de 5 mL. Tome 100 ul da suspensão de células a partir do tubo e contar o número de células utilizando um hemocitómetro os. Para fazê-lo, misturar 100 ul da suspensão de células com 300 ul de solução de azul de tripano e inserir 2 ul da mistura em um hemocitómetro. Contar o número de células sem coloração azul a partir de quatro pontos de vista distintos, sob um microscópio. Em média, o número de células de cada ponto de vista, como esse número representa 10 4 células / ml. </li><li> Enquanto isso, o tubo de centrífuga contendo a suspensão de células a 300 xg por 7 min. Aspirar os meios de comunicação e ressuspender as peletes de células com meio RPMI fresco para fazer uma suspensão de células a uma densidade de GL261 1,0 x 10 6 / ml. Semente 2,5 x 10 6 células GL261 com 2,5 ml de meio RPMI para um balão T-175, com 27,5 ml de DMEM (dia 1). </li><li> Após 24 horas, substituir o meio com 20 ml de DMEM fresco (dia 2). </li><li> Para produzir o vector lentiviral, misturar o reagente de transfecção de 54 ul com 2 ml de DMEM isento de soro, durante 5 min. Adiciona-se 3 ug de gag-pol, 3 ug de vírus da estomatite vesicular envelope G (VSV-G), e 4,5 ug de Fluc (pSIN-Fluc) em DMEM com o reagente de transfecção, e incubar durante 20 min à temperatura ambiente. Gota a totalidade da mistura de DNA para dentro do balão 293-T (T-175) e incuba-se a 37 ° C numa câmara humidificada contendo 95% de ar e 5% de CO 2 durante 48 horas (dia 2). </li><li> Adicionar 10 ml de DMEM fresco às 24 h após transfecção (volume total de 293-T meio de cultura celular deve ser, aproximadamente, 30 ml) (3 dias). </li><li> Para dividir células GL261 em umPlaca de 24 poços, lave as células uma vez com PBS, sem Ca2 + e Mg2 +, incubar as células com 5 ml de tripsina (0,05%) a 37 ° C durante 5 minutos, tritura-se com uma pipeta de 5 mL, mantendo o balão ligeiramente inclinada , recolher todas as células do fundo do frasco, e contagem de células através de hemocitómetro, como no passo 1.2. Enquanto isso, o tubo de centrifugação a 300 xg durante 7 minutos. Aspirar os meios de comunicação e ressuspender as peletes de células com meio RPMI fresco para fazer uma suspensão de células GL261 a densidade de 2,5 x 10 4 / ml. Semente de 2,5 x 10 4 GL261 células com 1 ml de meio RPMI numa placa de 24 poços (dia 3). </li><li> Recolha de 30 ml de sobrenadante a 10 ml de lentivírus com uma pipeta a partir do balão de 293-T (T-175) em 48 h após transfecção e transferir o sobrenadante para tubo de 50 ml. Aspirar o sobrenadante 30 ml de lentivírus através de uma seringa de 50 ml, através de um filtro de seringa de 0,22 um, e alíquota do sobrenadante viral em alíquotas de 1 ml (dia 4). </li><li> Substitua os 1 ml de RForma PMI em placa de células GL261 (24 poços) com 1 ml de sobrenadante a lentiviral e incubar a 37 ° C numa câmara humidificada (dia 4). </li><li> Após 48 horas de infecção lentiviral, substituir o meio com 1 ml de RPMI fresco (dia 6). </li><li> Após 24 horas, repetir a infecção lentiviral das células GL261 (dia 7). </li><li> Após a 2 ª 48 hr de infecção lentiviral, substituir o meio com 1 ml de RPMI fresco (dia 9). </li><li> Continuar a crescer as células de luciferase modificada GL261 (para ser referido como células GL261.luc) e expandir a cultura de células de um frasco T-75. </li><li> Quando a cultura de células GL261.luc atinge 70% de confluência num frasco de T-75, colher as células por tripsinização e contagem por hemacitómetro como no passo 1.2. Placa da célula GL261.luc em uma placa de 24 poços a densidades de graduação (1,0 x 10 6, 5,0 x 10 5, 2,5 x 10 5, 1,0 x 10 5, 5,0 x 10 4, 2,5 x 10 4 células / cavidade) e incubar a 37 ° C num humidicâmara ficada contendo 95% de ar e 5% de CO 2 durante 3 h. </li><li> Medir celular actividade de luciferase relativa a luciferase modificada U-87 MG (U87.luc) células utilizando imagem de bioluminescência (Figura 1). <ol><li> Inicie o software de imagem (ícone na área de trabalho, clique) e inicializar o sistema de imagem (clique em &quot;Inicializar&quot; botão). Inicialização começará automaticamente e pode levar alguns minutos para o sistema de check-up ea câmera para arrefecer a -90 ° C. </li><li> Adicionar 25 ul de luciferina (sal de potássio, D-luciferina 150 mg / kg) em cada poço. </li><li> Incubam-se as células com luciferina, durante 1 min à temperatura ambiente e a imagem da placa durante 10 segundos. Para configurar o sistema de imagem, selecione &quot;luminescentes&quot;, &quot;10 segundos&quot; tempo de exposição, e binning &quot;Medium&quot;. Colocar a placa de 24 poços na estação de imagens e clicar no botão &quot;adquirir&quot; para iniciar a imagem. </li><li> Depois que a imagem é adquirida com sucesso, você verá uma janela de imagem e ferramenta de palette na tela. Clique em &quot;ROI (regiões de interesse) Ferramentas&quot; e selecione 6 x 4 a partir do ícone de fenda. Criar 6 x 4 fendas para cobrir a área de sinal na imagem da placa de 24 poços e clique na guia medições (ícone do lápis). Observe uma janela com uma tabela de medidas de ROI como unidade de fótons por segundo por esterradiano por metro quadrado cm (fótons / seg / sr / cm 2). </li><li> As células usam U87.luc, previamente modificado com o mesmo lentivírus utilizado aqui para a modificação GL261 11, como um controlo para avaliar a actividade da luciferase em células GL261.luc transduzidas. </li></ol></li></ol> 2. Ensaio de Proliferação In Vitro <ol><li> Quando as culturas de células e GL261 GL261.luc atingir 70% de confluência num frasco de T-75, a colheita das linhas de células por tripsinização e ambos contam como no passo 1.2, e células da placa para uma placa de 96 poços a uma densidade de 1500 células 80 ul de meio RPMI por poço utilizando uma pipeta de canais múltiplos e para minimizar o tempo de erro de pipetagem. Seed cada linha celular total de 20 poços em. Para limitar a evaporação nas cavidades povoadas por células, encher poços vazios com 100 ul de meio RPMI fresco. </li><li> Avaliar a proliferação celular utilizando um ensaio de proliferação celular colorimétrico. Aqui usamos o ensaio de proliferação celular MTS. Usando uma pipeta de multi-canal, adicionar 20 ul de reagente MTS em cada poço da placa de 96 poços que contêm as células. </li><li> Incubar a placa a 37 ° C numa câmara humidificada contendo 95% de ar e 5% de CO 2 durante 3 h. Medir a absorvância a 490 nm utilizando um leitor de microplacas. Isto é repetido nos dias 1, 2, 4, e 7, após o plaqueamento. Para normalizar os valores de absorção, os valores de cada dia são divididas pelas leituras correspondentes obtidos no dia 1 (Figura 2). </li></ol> 3. Tumor Implantação celular Nota: Autoclave todo o equipamento. Prepare a área cirúrgica por pulverização de uma (solução de clorexidina a 2%) desinfetante e cubra com absorbent cortinas. A fim de manter condições estéreis, usar luvas cirúrgicas estéreis durante a cirurgia, e dividir a área cirúrgica em duas áreas de fita cor. Área 1 é rotulado de &quot;Clean&quot; e contém suprimentos esterilizados; Área 2 é rotulado como &quot;sujo&quot; e contém materiais utilizados. <ol><li> Antes da cirurgia animal, preparar uma suspensão de células para a injeção intracraniana. Colheita de células confluentes a partir de um 70% de T-75 balão por tripsinização e contagem de células através de hemocitómetro, como no passo 1.2, e fazer uma suspensão de células a uma densidade de 1,0 x 10 5 células / ml em solução salina equilibrada de Hanks sem Ca 2+ e Mg2 + (HBSS). </li><li> Anestesiar ratos com injecção intraperitoneal de 200 ul de mistura contendo 100 mg / kg de cetamina e 10 mg / kg de xilazina em 0,9% de solução salina. Para confirmar anesthetization adequada, aperte a ponta do mouse. Se o mouse é completamente sob anestesia, o mouse não deve responder ao estímulo. </li><li> Administrar 0,1 mg / kg de buprenorfina por via de injecção subcutânea para aliviar a dor pós-operatória. </li><li> Raspar a parte superior da cabeça dos animais usando clippers e limpo, com um aplicador de algodão-ponta mergulhado em solução de clorexidina a 2%. Aplicar pomada para manter a lubrificação adequada durante a cirurgia. </li><li> Faça uma incisão sagital cerca de 1 cm de comprimento sobre o osso parieto-occipital utilizando um bisturi estéril. Para visualizar a bregma, limpar a superfície do crânio com um aplicador de algodão-ponta embebida em uma solução de peróxido de hidrogénio a 3%. </li><li> Perfurar o crânio com uma agulha estéril de 25-G para fazer um pequeno buraco de 3 mm a direita do bregma e apenas atrás da sutura coronal. </li><li> Para garantir que no local da injecção intracraniana é até uma profundidade de 3 mm do crânio, cortar 3 mm de folga da extremidade pontiaguda de uma ponta de pipeta 20 ul usando uma tesoura e inserir uma seringa para a ponta da pipeta. </li><li> Inserir a seringa perpendicularmente ao buraco criado anteriormente, e injecte lentamente a sus células tumoraispensões contendo 3,0 x 10 5 células em 3 ul de HBSS, ao longo de um período de 1 min. Deixe a agulha no lugar por mais um minuto, e em seguida, puxe lentamente para fora da agulha. </li><li> Swab o crânio com aplicador de algodão-tip embebido em 3% de peróxido de hidrogénio e a solução de clorexidina a 2%. Seque a superfície do crânio com o aplicador de algodão-ponta. Cortar a cera de osso estéril cerca de 3 mm 3 em tamanho e anexar a cera de osso no lado da extremidade do aplicador de algodão-ponta. Aplique a cera de osso para cobrir o buraco com o aplicador de algodão-ponta. </li><li> Desenhar a cada lado do couro cabeludo em conjunto sobre o crânio com a pinça, e grampos para fechar a ferida. Limpar a ferida com um algodão-tip embebido em solução de clorexidina a 2%. </li><li> Monitorar todos os ratos pós-operatório até que se tornem ambulante e manter a atividade normal. Normalmente, o tempo de recuperação é de aproximadamente 30 min. Não devolva os ratos para a gaiola com outros animais até que eles se recuperaram totalmente da anestesia. </li></ol><ol><li> Borrife uma quantidade generosa de desinfectante (solução de cloreto de amónio dimetil 0,05%) em uma toalha de papel limpa. Use o papel toalha encharcada de desinfetante para limpar completamente a folha de preto, cones do nariz e divisor dentro da câmara de imagem onde os animais estarão em contacto com o dispositivo. Limpe completamente todas as superfícies com uma toalha de papel limpo e seco. Repita esta mais uma vez e esperar 5 min. </li><li> Inicializar a estação de imagens como no passo 1.14.1. </li><li> Anestesiar o rato com uma mistura de 300 ul contendo 200 ul de cetamina / xilazina e 100 ul de luciferina (sal de potássio, D-luciferina 150 mg / kg) por injecção intraperitoneal. </li><li> Esperar 10 min após a injecção e confirmar se os ratos estão completamente sob anestesia por beliscar a cauda. Para configurar o sistema de imagem, selecione &quot;luminescentes&quot;, vez &quot;Auto&quot; exposição e binning &quot;Medium&quot;. Colocar os ratinhos no stati imagiologiaem e clique no botão &quot;Adquirir&quot; para iniciar a imagem. Assegure-se que o tempo após a injecção é consistente com cada sessão de imagem. </li><li> Depois que a imagem é adquirida com sucesso, uma janela de imagem e paleta de ferramentas deve aparecer. Clique em &quot;Ferramentas&quot; e selecione ROI &quot;auto&quot; do ícone do círculo. Para definir ROIs, cercar a área do sinal na imagem, e em seguida, tomar medidas do ROI como unidade de fótons / seg / SR / cm2. </li><li> Tome os ratos para fora da câmara de imagem e monitorar os ratos até que se tornem ambulante e manter a atividade normal. Normalmente o tempo de recuperação é de aproximadamente 15 min. Não devolva os ratos para a gaiola com outros animais até que eles se recuperaram totalmente da anestesia. </li><li> Monitorizar o crescimento do tumor por imagem de bioluminescência duas vezes por semana até os animais apresentam os seguintes sintomas: perda de peso (perda de mais de 20% em relação ao peso antes da implantação), inapetência (anorexia completa durante 24 h), e falta de purposefu sustentadal resposta a estímulos suave (fraca tentativa de levantar-se), momento em que eles devem ser sacrificados. Eutanásia animais com estes sintomas usando uma câmara de CO 2, seguida por deslocação cervical. <ol><li> Coloque os ratos para a câmara de eutanásia (não devem ser lotados na câmara) e influxo comprimido CO 2 por 5-6 min. Observe que todos os animais são inconsciência e não respirar após cerca de 5 min. </li><li> Tome os ratos para fora da câmara. Certifique-se de que o coração não está batendo, sentindo o peito entre o polegar eo indicador e verificar que não há reflexo de piscar. </li><li> Restringir o rato em uma posição de bruços sobre uma superfície plana e agarrar a parte de trás do pescoço, na base do crânio com uma mão e a base da cauda com o polegar e o dedo indicador da outra mão. </li><li> Contenha o cabeça e rapidamente puxar a cauda para trás. Certifique-se de que o crânio é separado da primeira vértebra cervical usando o polegar eo dedo indicador. </li></ol></li><li> Normavalores de luminescência alize para cada dia contra as leituras correspondentes obtidos no primeiro dia de imagem de bioluminescência como no passo 2.3 (Figura 3A). </li><li> Para a análise estatística, gerar curvas de sobrevivência utilizando o estimador de Kaplan-Meier 12 e comparar as diferenças entre as curvas de sobrevivência utilizando um teste de log-rank 13. </li></ol>

<ol><li>Clark, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurosurgical+management+and+prognosis+of+patients+with+glioblastoma+that+progresses+during+bevacizumab+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Neurosurgical management and prognosis of patients with glioblastoma that progresses during bevacizumab treatment.</a> Neurosurgery. 70 (2), 361-370 (2012).</li>
<li>Stupp, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiotherapy+plus+concomitant+and+adjuvant+temozolomide+for+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma.</a> N Engl J Med. 352 (10), 987-996 (2005).</li>
<li>Grossman, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+of+patients+with+newly+diagnosed+glioblastoma+treated+with+radiation+and+temozolomide+in+research+studies+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Survival of patients with newly diagnosed glioblastoma treated with radiation and temozolomide in research studies in the United States.</a> Clin Cancer Res. 16 (8), 2443-2449 (2010).</li>
<li>Sughrue, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+considerations+of+modern+animal+models+of+malignant+primary+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Immunological considerations of modern animal models of malignant primary brain tumors.</a> J Transl Med. 7 (84), (2009).</li>
<li>Ausman, J. I., Shapiro, W. R., Rall, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+chemotherapy+of+experimental+brain+tumors%3A+development+of+an+experimental+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Studies on the chemotherapy of experimental brain tumors: development of an experimental model.</a> Cancer Res. 30 (9), 2394-2400 (1970).</li>
<li>Zagzag, D., Zhong, H., Scalzitti, J. M., Laughner, E., Simons, J. W., Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+hypoxia-inducible+factor+1alpha+in+brain+tumors%3A+association+with+angiogenesis%2C+invasion%2C+and+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Expression of hypoxia-inducible factor 1alpha in brain tumors: association with angiogenesis, invasion, and progression.</a> Cancer. 88 (11), 2606-2618 (2000).</li>
<li>Cha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic%2C+contrast-enhanced+perfusion+MRI+in+mouse+gliomas%3A+correlation+with+histopathology%5BTitle%5D)+AND+%22Magn+Reson+Med%22%5BJournal%5D)">Dynamic, contrast-enhanced perfusion MRI in mouse gliomas: correlation with histopathology.</a> Magn Reson Med. 49 (5), 848-855 (2003).</li>
<li>Ksendzovsky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+immunosuppressive+mechanisms+in+a+mouse+glioma+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurooncol%22%5BJournal%5D)">Investigation of immunosuppressive mechanisms in a mouse glioma model.</a> J Neurooncol. 93 (1), 107-114 (2009).</li>
<li>Biollaz, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+anti-tumor+immunity%3A+differences+in+DC+function%2C+TGF-beta+production+and+numbers+of+intratumoral+Foxp3%2B+Treg%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Site-specific anti-tumor immunity: differences in DC function, TGF-beta production and numbers of intratumoral Foxp3+ Treg.</a> Eur J Immunol. 39 (5), 1323-1333 (2009).</li>
<li>El Andaloussi, A., Han, Y., Lesniak, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolongation+of+survival+following+depletion+of+CD4+%2B+CD25%2B+regulatory+T+cells+in+mice+with+experimental+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Prolongation of survival following depletion of CD4 + CD25+ regulatory T cells in mice with experimental brain tumors.</a> J Neurosurg. 105 (3), 430-437 (2006).</li>
<li>Dinca, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+Monitoring+of+Intracranial+Glioblastoma+Xenograft+Response+to+Primary+and+Salvage+Temozolomide+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence Monitoring of Intracranial Glioblastoma Xenograft Response to Primary and Salvage Temozolomide Therapy.</a> J. Neurosurg. 107 (3), 610-616 (2007).</li>
<li>Kaplan, E. L., Meier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-parametric+estimation+from+incomplete+observations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Stat.+Assoc%22%5BJournal%5D)">Non-parametric estimation from incomplete observations.</a> J. Am. Stat. Assoc. 53, 457-481 (1958).</li>
<li>Peto, R., Peto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymptotically+efficient+rank+invariant+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+R.+Stat.+Soc.+Ser.+A.+Stat.+Soc%22%5BJournal%5D)">Asymptotically efficient rank invariant procedures.</a> J. R. Stat. Soc. Ser. A. Stat. Soc. 135, 185207(1972).</li>
<li>Armitage, P., Berry, G., Matthews, J. N. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aArmitage%2C+P+%22Statistical+Methods+in+Medical+Research%22">Statistical Methods in Medical Research</a>. , 4th ed, Blackwell Science. Oxford. (2001).</li>
<li>Newcomb, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+combination+of+ionizing+radiation+and+peripheral+vaccination+produces+long-term+survival+of+mice+bearing+established+invasive+GL261+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The combination of ionizing radiation and peripheral vaccination produces long-term survival of mice bearing established invasive GL261 gliomas.</a> Clin Cancer Res. 12 (15), 4730-4737 (2006).</li>
<li>Pellegatta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurospheres+enriched+in+cancer+stem-like+cells+are+highly+effective+in+eliciting+a+dendritic+cell-mediated+immune+response+against+malignant+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Neurospheres enriched in cancer stem-like cells are highly effective in eliciting a dendritic cell-mediated immune response against malignant gliomas.</a> Cancer Res. 66 (21), 10247-10252 (2006).</li>
<li>Clark, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+luciferase+expression+does+not+alter+immunologic+or+in+vivo+growth+properties+of+GL261+murine+glioma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Stable luciferase expression does not alter immunologic or in vivo growth properties of GL261 murine glioma cells.</a> J Transl Med. 12, 345-34 (2014).</li>
<li>Abdelwahab, M. G., Sankar, T., Preul, M. C., Scheck, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracranial+implantation+with+subsequent+3D+in+vivo+bioluminescent+imaging+of+murine+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Intracranial implantation with subsequent 3D in vivo bioluminescent imaging of murine gliomas.</a> J Vis Exp. (57), e3403(2011).</li>
<li>Ozawa, T., James, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+intracranial+brain+tumor+xenografts+with+subsequent+analysis+of+tumor+growth+and+response+to+therapy+using+bioluminescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging.</a> J Vis Exp. (41), (2010).</li>
<li>Baumann, B. C., Dorsey, J. F., Benci, J. L., Joh, D. Y., Kao, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotactic+intracranial+implantation+and+in+vivo+bioluminescent+imaging+of+tumor+xenografts+in+a+mouse+model+system+of+glioblastoma+multiforme%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Stereotactic intracranial implantation and in vivo bioluminescent imaging of tumor xenografts in a mouse model system of glioblastoma multiforme.</a> J Vis Exp. (67), (2012).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse a serem divulgados.

GL261 células de glioma de murino, quando implantadas intracranianamente em imunocompetentes singeneicos C57BL / 6, oferecem várias vantagens em relação aos modelos de glioma de xenoenxerto em animais humanos. Muitos tumores de xenoenxerto cresce como lesões encapsuladas que não recapitulam exacta da doença humana invasiva. Em contraste, tumor GL261 não só demonstra invasão cerebral adjacente, mas também a neovascularização, figuras mitóticas, necrose 7 e profunda. O mais importante quando se estuda imunologia tumor ou estratégias imunoterapêuticas 15, 16, a C57BL / 6 do mouse mantém um sistema imunológico intacto 8. Estudos anteriores demonstraram expressão robusta da citoquina imunossupressora de TGF-β e tumores intracranianos contêm células T-reguladoras imunossupressores semelhantes ao glioblastoma humano 9, 10. A técnica simples descrito aqui permite a expressão estável de luciferase por células GL261. Nós recentemente relataram simiLar in vitro e in vivo o crescimento de células em comparação com as células GL261.luc GL261, para além das características histológicas semelhantes de tumor e células imunitárias infiltrar 17. Células GL261.luc expressar estavelmente luciferase, que catalisa a oxidação do substrato luciferina converter energia química em fotões de luz e portanto detectável. Luciferina pode ser administrado com segurança a animais e atravessa a barreira hemato-encefálica após injecção intraperitoneal ou intravenosa. Em pequenos animais de pesquisa, tais como murganhos, a bioluminescência podem ser detectados externamente de forma não-invasiva 11. Portanto, o crescimento do tumor pode ser avaliada em série, sem a necessidade de sacrifício do animal ou dispendiosa imagiologia MRI ou CT. Os passos críticos no protocolo envolvem, não só a transdução de lentivírus, mas também a verificação da expressão estável de luciferase in vitro antes de iniciar quaisquer experiências in vivo. Perda de transdução pode require infecção por lentivírus de repetição. Introdução de um gene de resistência a antibiótico no vector de expressão também pode ser utilizado para seleccionar para expressão da luciferase. Técnica meticulosa é necessária para a implantação intracraniana de colocar de forma reprodutível um número consistente de células numa localização anatómica precisa para permitir a comparação de grupos de tratamento diferentes. Uma das principais diferenças entre o presente estudo e estudos anteriores de células que expressam luciferase GL261 é a utilização de uma técnica de mão livre para a implantação de células em comparação com a utilização de uma moldura estereotáxica 18. Temos anteriormente demonstrado resultados consistentes com a implantação técnica de mão livre 19. A vantagem da técnica de mão livre é a capacidade de realizar análises de alto rendimento de agentes de tratamento diferentes. Em nossas mãos, nós podemos implantar cerca de 60 animais em 1 hora. Depois de dominar a técnica, as futuras aplicações da técnica são ilimitadas. Como GL261 demonstrates elevados mitoses e o crescimento rápido do tumor semelhante ao glioblastoma humano, os tratamentos anti-proliferativos podem ser avaliadas. Do mesmo modo, as terapias anti-invasivas e anti-angiogénicas podem ser utilizadas como os tumores GL261 são invasivos e angiogénico. O cuidado deve ser usado para avaliar o efeito de agentes quimioterápicos que visam alvos humanos. Em comparação com estudos anteriores utilizando xenoenxertos de glioblastoma humano que expressam luciferase 20, isso seria considerado uma limitação do nosso modelo. Além disso, o efeito de estratégias imunoterapêuticas de crescimento do tumor podem ser estudados no modelo de xenoenxerto GL261.

O glioma maligno é o tumor cerebral humano mais comum e letal. Mesmo quando tratado com ressecção cirúrgica máxima, radioterapia e quimioterapia, a sobrevida média permanece de 15 a 20 meses nos principais centros de referência de tumores cerebrais1, 2, 3. A forma mais agressiva de glioma maligno, o glioblastoma, é caracterizada por figuras mitóticas, neovascularização, invasão do cérebro adjacente e necrose pseudopaliçada. Os xenoenxertos de tumores cerebrais ortotópicos usando células tumorais cerebrais humanas têm desempenhado uma função essencial na pesquisa neuro-oncológica e facilitado a tradução pré-clínica para testes de novos agentes, antes da entrada em ensaios clínicos em humanos. Enquanto a maioria dos modelos de xenoenxerto humano recapitula muitas características da doença humana, uma limitação fundamental com todos os sistemas de modelo de xenoenxerto baseados em humanos é o uso de animais imunodeficientes4. 
A ausência de uma resposta intacta do hospedeiro modifica claramente o crescimento do tumor tanto em termos de morfologia do tumor quanto de eficiência do enxerto. Embora certas suposições sejam aceitáveis na interpretação dos resultados de modelos xenoenxertados, alcançar conclusões relevantes na área de avaliação terapêutica é um desafio. Certas características biológicas fundamentais provavelmente são semelhantes em animais imunodeficientes e imunocompetentes, mas outras, como inflamação associada a tumores, invasão tecidual, resposta a lesões, são provavelmente muito diferentes. Em contraste, GL261 é uma linha celular de glioma murino induzida quimicamente que recapitula com precisão o glioma quando implantada no cérebro de camundongos C57BL / 6 singênicos imunocompetentes5. Semelhante à doença humana, o crescimento do tumor intracraniano leva rápida e reprodutivelmente a sintomas neurológicos e morte animal6-10. 
O crescimento do tumor subcutâneo pode ser medido diretamente. O crescimento do tumor intracraniano só pode ser medido com sacrifício de animais ou com estudos de imagem caros. A expressão estável da enzima luciferase permite imagens de bioluminescência intracraniana não invasivas e econômicas11. A bioluminescência de células GL261 transfectadas com luciferase se correlaciona bem com o crescimento do tumor intracraniano. Recentemente, comparamos diretamente GL261 com células GL261 modificadas com luciferase e não demonstramos diferença no crescimento e invasão in vitro, perfil imunológico de citocinas, sobrevida in vivo de camundongos C57BL / 6 portadores de tumor intracraniano ou infiltrado de células imunes. Esta técnica é aplicável a estudos pré-clínicos de glioblastoma que envolvem monitoramento não invasivo do crescimento do tumor.

<table><tbody><tr><td>D-Luciferina, Sal de Potássio</td><td>Ouro Biotecnologia</td><td>LUCK-100</td><td>Armazenar longe da luz</td></tr><tr><td>Software de Imagem Viva</td><td>Paquímetro Ciências da Vida</td><td>Contato para Cotação</td><td>nenhum</td></tr><tr><td>Xenogênio Lúxia</td><td>Paquímetro Ciências da Vida</td><td>Contato para Cotação</td><td>nenhum</td></tr><tr><td>24 poços; Cultura de tecidos padrão; </td><td>Falcon</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter 96 AQuar de Proliferação Celular de Uma Solução</td> Branca<td>Promega</td><td>G3582</td><td>nenhum</td></tr><tr><td>Leitor multimodo Synergy 2</td><td>BioTek</td><td>Contato para cotação</td><td>nenhum</td></tr><tr><td>96 poços Placa de ensaio, Placa preta, fundo transparente com tampa, cultura de tecidos Tretaed</td><td>Coster</td><td>3603</td><td>nenhum</td></tr><tr><td>Ketaset</td><td>Pfizer</td><td>NDC 0856-2013-01</td><td>Substância de controle</td></tr><tr><td>xilazina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>23076-35-9</td><td>nenhum</td></tr><tr><td>28G Agulha (com seringa)&nbsp;</td><td>Fisher &nbsp;</td><td>22-004-270</td><td>AKA Seringa de Insulina</td></tr><tr><td>2% Clorexidina</td><td>Fisher</td><td>NC9756995</td><td>AKA " Nolvasan"</td></tr><tr><td>3% de peróxido de hidrogênio</td><td>Fisher</td><td>H312P-4</td><td>Armazenar longe da luz</td></tr><tr><td>pomada oftálmica</td><td>Cardinal Health</td><td>1272830</td><td>AKA " Lágrimas de Akwa"</td></tr><tr><td>25G 1 1/2 agulha</td><td>BD Becton Dickinson</td><td>305127</td><td>nenhum</td></tr><tr><td>Bisturis descartáveis</td><td>Feather</td><td>2975</td><td>No. 21</td></tr><tr><td>Gaze</td><td>Fisher</td><td>22028563</td><td>Autoclave antes do uso</td></tr><tr><td>Almofada de aquecimento</td><td>Dunlap</td><td>HP950</td><td>nenhum</td></tr><tr><td>Grampeador de pele, grampos, removedor</td><td>Stoelting</td><td>59020</td><td>nenhum</td></tr><tr><td>PDI Alchol Prep Pads</td><td>Fisher</td><td>23-501-711</td><td>nenhum</td></tr><tr><td>Reflex 7 mm Wound Clips 100 pack</td><td>Brain Tree Scientific, INC</td><td>203 1000</td><td>Autoclave antes do uso</td></tr><tr><td>Reflex 7 mm Aplicador de Clipe</td><td>de Ferida Brain Tree Scientific, INC</td><td>204 1000</td><td>Autoclave antes do uso</td></tr><tr><td>Reflex 7 mm Removedor de Clipe de Ferida</td><td>Brain Tree Scientific, INC</td><td>205 1000</td><td>nenhum</td></tr><tr><td>Cotonete de ponta redonda de ponta única com cabo de madeira</td><td>Qosmedix</td><td>10107</td><td>Autoclave antes</td></tr><tr><td>do uso Solução salina balanceada de Hanks sem Ca2+ e Mg2+ (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>14170-112</td><td>nenhum</td></tr><tr><td>Seringa Hamilton</td><td>Hamilton</td><td>80300</td><td>nenhum</td></tr><tr><td>Reagente de transfecção FuGENE 6</td><td>Promega</td><td>E2961</td><td>nenhum</td></tr><tr><td>Aparelho Harvard de cera óssea</td><td></td><td>599864</td><td>nenhum</td></tr></tbody></table>

bioluminescência imagem de um modelo animal para imunocompetentes glioblastoma

Bioluminescence Imaging of an Immunocompetent Animal Model for Glioblastoma

Em contraste com os modelos animais de xenoenxerto de glioma humano comumente relatados, os xenoenxertos de glioma murino GL261 recapitulam quase todas as características clínicas e histopatológicas relevantes da doença humana. Quando as células GL261 são implantadas intracranialmente em camundongos C57BL/6 singênicos, o modelo tem a vantagem adicional de manter um microambiente imunológico intacto. A expressão estável de luciferase em células GL261 permite o monitoramento não invasivo e econômico da bioluminescência do crescimento tumoral intracraniano. Recentemente, demonstramos que a expressão da luciferase em células GL261 não afeta as propriedades de crescimento do tumor, a expressão de citocinas imunomoduladoras de células tumorais, a infiltração de células imunes no tumor ou a sobrevida global de animais portadores do tumor intracraniano. Portanto, parece que o modelo de glioma de luciferase GL261 pode ser útil no estudo de novas modalidades quimioterápicas e imunoterapêuticas. Aqui relatamos a técnica para gerar expressão estável de luciferase em células GL261 e como estudar o crescimento in vitro e in vivo das células tumorais por imagem de bioluminescência.

GL261 células foram infectadas com lentivírus contendo luciferase como descrito acima nos passos 1. In vitro imagem de bioluminescência robusta demonstra a expressão de luciferase em níveis semelhantes aos do controlo positivo U87.luc linha celular de glioblastoma humano (Figura 1). Como esperado, as células não infectadas GL261 demonstrar nenhuma expressão fundo da luciferase. Este passo é simples, mas crítico para executar antes de mais estudos utilizando a linha celular infectada para confirmar a expressão de luciferase estável. A expressão de luciferase após a implantação intracraniana. Antes de implantação intracraniana, que não demonstrou nenhuma diferença na taxa de crescimento in vitro de células em comparação com GL261.luc GL261 (Figura 2). Para o crescimento intracraniana e análise de sobrevivência, as células foram injectadas no brains de ratinhos C57BL / 6, conforme o protocolo passo 3. O crescimento do tumor em ratinhos portadores de tumores GL261.luc foi serialmente analisados ​​para imagem de bioluminescência usando o protocolo passo 4 e demonstraram um crescimento tumoral detectável (Figura 3A). Os ratinhos portadores de tumores GL261.luc rapidamente e tornou-se de forma consistente e moribundos foram eutanizados. É importante notar, não há qualquer diferença na sobrevivência global entre GL261.luc e GL261 animais portadores de tumor (Figura 3B). In vivo, a bioluminescência de imagem, por conseguinte, pode ser utilizado para monitorizar a resposta ao tratamento de glioblastoma experimentais. O crescimento do tumor de confiança rápida e curta sobrevida global pode produzir grandes quantidades de dados em um período relativamente curto de tempo. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53287/53287fig1.jpg" /> Figura 1. A actividade de luciferase em células GL261.luc. U87.luc, células GL261.luc e GL261 (controlo negativo) foram semeadas a densidades de1,0 x 10 6, 5,0 x 10 5, 2,5 x 10 5, 1,0 x 10 5, 5,0 x 10 4, e 2,5 x 10 células / cavidade 4 da esquerda para a direita. Luminescência (fótons / seg / sr / cm 2) foi medido pela estação de imagens Lumina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53287/53287fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53287/53287fig2.jpg" /> Figura 2. Expressão de Luciferase não afecta a proliferação de células GL261. GL261.luc células não causam um diferença na proliferação como demonstrado pela MTS ensaio de proliferação celular. O gráfico mostra o aumento de vezes, em relação ao dia 1, tal como determinado comparando o valor médio de absorvância (média ± SEM) no ponto de tempo thespecified ao valor médio no dia 1 (t -test valores desemparelhados para comparaçõesentre cada linha celular: P = 0,7796) 14. As barras de erro representam os valores médios (média ± SEM) a partir de amostras em quadruplicado em cada dia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53287/53287fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53287/53287fig3.jpg" /> Figura 3. a expressão de luciferase dose não afetar em no crescimento do tumor in vivo e sobrevivência animal. (A) o monitoramento bioluminescência demonstra o crescimento progressivo do tumor GL261.luc intracraniana em camundongos C57BL / 6. (B) análise de sobrevivência de Kaplan-Meier demonstra nenhuma diferença na sobrevida global para os ratos implantados intracranially com a utilização de células GL261 (linha sólida) ou GL261.luc (linha a tracejado).Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

As células de glioma GL261 fornecem um modelo animal imunocompetente útil de glioblastoma. Os objetivos deste protocolo são demonstrar técnicas adequadas para monitorar o crescimento do tumor intracraniano usando imagens de bioluminescência in vivo e verificar a utilidade das células GL261 modificadas com luciferase para estudar a imunologia tumoral e abordagens imunoterapêuticas para o tratamento do glioblastoma.

Bioluminescência imagem de um modelo animal para imunocompetentes Glioblastoma

In contrast to commonly reported human glioma xenograft animal models, GL261 murine glioma xenografts recapitulate nearly all relevant clinical and ...

O objetivo geral deste protocolo é demonstrar as técnicas adequadas para monitorar o crescimento de células tumorais e tumores intracranianos utilizando imagem de bioluminescência in vivo, a fim de verificar a utilidade da modificação com luciferase em células tumorais murinas GL261. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no estudo da imunologia tumoral e das abordagens imunoterapêuticas, como, por exemplo, se a modificação por estresse afeta a proliferação das células GL261 e seu crescimento in vivo.A principal vantagem dessa técnica é que a modificação da luciferase em células tumorais GL261 facilita o monitoramento não invasivo do seu crescimento e da resposta ao tratamento in situ. Quando o cultivo celular GL261 com luciferase atingir 70% de confluência em um frasco T75, colete as células por tripsinização. Conte as células e, em seguida, transfira-as para uma placa de 24 poços em densidades graduadas.Após três horas em um incubador de cultura celular, abra o software de imagem de bioluminescência e inicialize o sistema de imagem. Quando a câmera atingir menos 90 graus Celsius, configure o software de imagem para Luminescência com um tempo de exposição de 10 segundos e Binagem Média. Em seguida, incube as células em 25 microlitros de luciferina por poço durante um minuto à temperatura ambiente e coloque a placa na estação de imagem.Selecione Adquirir para iniciar a aquisição de imagem. Quando uma imagem for obtida com sucesso, uma janela de imagem e uma paleta de ferramentas aparecerão. Clique em Ferramentas de Regiões de Interesse e selecione 6 por 4 no ícone de fenda.Cubra a área do sinal com 6 por 4 fendas e selecione o ícone de lápis na guia Medidas. Uma janela com uma tabela de medidas da região de interesse em unidades de fótons por segundo por esterorradiano por centímetro quadrado será exibida. Para realizar um ensaio de proliferação in vitro, colete as culturas celulares conforme acabou de ser demonstrado quando atingirem 70% de confluência.E use uma pipeta multicanal para colocar as células tumorais em 20 poços de uma placa de 96 poços, com 1,5 vezes 10 à 3ª células por 80 microlitros de meio RPMI por poço. Para limitar a evaporação das culturas celulares, preencha os poços vazios ao redor com 100 microlitros de meio RPMI fresco. Em seguida, para avaliar a proliferação celular, adicione 20 microlitros do reagente MTS a cada poço de células.E incubar a placa a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Após três horas, utilizar um leitor de microplacas para medir a absorbância em 490 nanômetros. Para normalizar os valores de absorbância, dividir os valores de cada dia pelas leituras correspondentes obtidas no dia um.No dia da implantação, suspenda uma vez 10 elevado à 5ª células por microlitro em HBSS sem cálcio e magnésio a partir de uma cultura de células tumorais com 70% de confluência. Em seguida, após confirmar o nível adequado de sedação por meio de pinçamento do dedo do pé, depile o topo da cabeça de cada animal experimental. Usando um aplicador de algodão, limpe cada crânio com clorexidina 2%.Em seguida, aplique lubrificante nos olhos de cada camundongo. Agora, use um bisturi estéril para fazer uma incisão sagital com aproximadamente 1 centímetro de comprimento sobre o osso parietal occipital do primeiro animal. E limpe novamente a superfície do crânio com peróxido de hidrogênio a 3%, observando o bregma aparente.Em seguida, utilizando uma agulha estéril de 25 gauge, faça um furo de 3 milímetros no crânio à direita do bregma e logo atrás da sutura coronal. Para garantir a profundidade adequada da injeção, use uma tesoura para cortar 3 milímetros da extremidade pontiaguda de uma ponteira de pipeta de 20 microlitros e insira uma seringa Hamilton de 26 gauge na ponteira até que 3 milímetros da agulha fiquem expostos na extremidade da ponteira. Introduza a agulha no furo no crânio e injete lentamente 3 microlitros de 3 vezes 10 à 5ª potência das células tumorais ao longo de um período de um minuto.Deixe a agulha no lugar por mais um minuto e, em seguida, retire-a lentamente. Troque o osso exposto por solução de peróxido de hidrogênio a 3% e clorexidina a 2%. Depois, após secar o crânio com um aplicador novo de cotonete, recorte um pedaço de cera óssea estéril de 3 milímetros quadrados e fixe a cera à ponta descoberta de um aplicador de cotonete.Cubra o local da injeção com cera óssea. Em seguida, use uma pinça para puxar cada lado do couro cabeludo sobre a cera. Após fechar a ferida e administrar a analgesia pós-operatória apropriada, repita o procedimento para cada animal experimental.Para obter imagens do crescimento do tumor intracraniano, inicialize primeiro a estação de imagem conforme acabou de ser demonstrado. Em seguida, após confirmar o nível apropriado de sedação por meio do aperto da cauda, configure os parâmetros do sistema de imagem conforme acabou de ser demonstrado. Com exceção de selecionar Automático para o tempo de exposição.Quando o sistema de imagem estiver pronto, posicione os camundongos na estação de imagem e selecione Adquirir para obter imagens da expressão de luciferase. Quando a imagem tiver sido adquirida com sucesso, selecione a Ferramenta de Região de Interesse da paleta de ferramentas e Auto a partir do ícone de círculo. Contorne as áreas de sinal para definir as regiões de interesse e, em seguida, obtenha as medidas das regiões em unidades de fótons por segundo, por esterorradiano por centímetro quadrado.Por fim, retire os camundongos da câmara de imagem e monitore os animais com tumor até que estejam completamente recuperados. A imagem de bioluminescência in vitro de células GL261 infectadas com lentivírus contendo luciferase exibe uma expressão robusta de luciferase, semelhante aos níveis de luciferase expressos por uma linhagem celular de glioblastoma humano U87MG que expressa luciferase, utilizada como controle positivo. Como esperado, as células GL261 não infectadas não exibem expressão de fundo de luciferase.Antes do implante intracraniano, não se observa diferença nas taxas de crescimento in vitro das linhagens celulares GL261 luciferase e GL261. Como demonstra a imagem de bioluminescência serial de animais com tumores intracranianos injetados, as células tumorais que expressam GL261 luciferase também exibem uma taxa de crescimento rápida e consistente in vivo, sem diferença significativa nas taxas de sobrevida entre os grupos experimentais portadores de tumor observados. Uma vez dominada, esta técnica pode ser usada para obter imagens de até 25 camundongos por hora, se realizada corretamente.Após seu desenvolvimento, esta técnica aumenta a capacidade da imagem de bioluminescência de monitorar de forma útil o crescimento do tumor GL261 in vivo, aprimorando a investigação das respostas imunoterapêuticas em modelos de camundongos imunocompetentes.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Luciferase modificados xenotransplantes tumorais humanos cerebral intracraniana pode ser estabelecida em camundongos atímicos, com posterior acompanhamento do crescimento tumoral e resposta à terapia com imagem de bioluminescência. Em combinação com a análise de sobrevivência, o monitoramento bioluminescência é uma ferramenta de pesquisa essencial para ensaios pré-clínicos de terapias sendo considerado para o tratamento de tumores cerebrais.

Estabelecer xenoenxertos tumor intracraniano Cérebro com posterior análise do crescimento tumoral e resposta à terapia com imagem Bioluminescência

Imagem de bioluminescência de hipóxia induzida a atividade do fator-1α é aplicada para monitorar o desenvolvimento hipóxia intracraniana tumor em um câncer de mama modelo de cérebro de rato metástase.

Na imagem de bioluminescência vivo Tumor de mama Dynamics Hipóxia metástase do cancro cerebral em um modelo de rato

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Nós descrevemos um método integrado para a implantação, precisa estereotáxica de células de glioblastoma multiforme humano no cérebro de camundongos nude e série...

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Neste vídeo, descrevemos a tomografia molecular de fluorescência ou FMT para imagens in vivo de xenoenxertos de glioblastoma marcados com proteína fluorescente em modelos de camundongos. A técnica é útil para elucidar os efeitos da terapêutica antitumoral em nível molecular.

Tomografia Molecular de Fluorescência: Uma Técnica de Imagem para Imagem In Vivo de Xenoenxertos de Glioblastoma Marcados com Proteína Fluorescente em Modelo de Camundongo

Fonte: Clark, A.J., et al. Imagem de bioluminescência de um modelo animal imunocompetente para glioblastoma. J. Vis. Exp. (2016)Este vídeo demonstra imagens de bioluminescência para rastrear a progressão do glioblastoma em um modelo de camundongo imunocompetente, usando células tumorais que expressam luciferase e luciferina para quantificar o crescimento do tumor de forma não invasiva.

Imagem de bioluminescência de um modelo de camundongo imunocompetente para glioblastoma

Nós estabelecemos um modelo de glioblastoma ortotópico cortical em camundongos para microscopia de dois fótons intravital que recapitula as restrições biofísicas normalmente no jogo durante o crescimento do tumor. Uma janela de vidro crônica substituir o crânio acima do tumor permite o acompanhamento da progressão do tumor ao longo do tempo por meio de microscopia de dois fótons.

Um Glioblastoma Rato modelo ortotópico Manter restrições Cérebro parênquima físicas e Adequado para intravital dois fótons Microscopia

imagem de bioluminescência é uma ferramenta bem conhecida para localizar tumores e metástases, mas a quantificação dessas imagens muitas vezes requer cálculos complexos e instrumentos particulares. Nós descrevemos o método luminoscore de usar fácil, com base nas condições de aquisição precisas, sem necessidade de cálculos, e permitindo que a carga tumoral e resposta ao tratamento a ser monitorado em modelos do rato.

Método Tumor Quantificação Baseada em bioluminescência para a progressão do tumor Monitoramento e efeitos do tratamento em modelos de ratos linfoma

Ortotópico intracraniana injeção de células de tumor tem sido usada na pesquisa do câncer para estudar a biologia do tumor de cérebro, progressão, evolução e resposta terapêutica. Aqui nós apresentamos fluorescência molecular tomografia computadorizada de xenografts tumor, que fornece em tempo real imagens intravital e quantificação de um tumor massa em modelos pré-clínicos glioblastoma.

Fluorescência Molecular Tomography para a imagem latente na Vivo de Glioblastoma Xenografts

A barreira hematoencefálica é um obstáculo significativo na entrega de terapias para o glioblastoma, uma doença para a qual não há cura. Aqui, relatamos uma nano plataforma terapêutica de óxido de ferro guiada por imagem in vivo que pode contornar essa barreira fisiológica em virtude do tamanho e se acumular no tumor.

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O glioblastoma é uma forma devastadora de câncer cerebral primário, e a terapia térmica intersticial a laser está emergindo como uma alternativa promissora à ressecção cirúrgica convencional para glioblastoma inoperável. Este protocolo descreve um modelo de camundongo pré-clínico otimizado que pode ser usado para estudar os efeitos do tratamento ou tratamentos adjuvantes e combinatórios.

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Aprenda a monitorar o crescimento de tumores intracranianos usando imagem de bioluminescência in vivo com células GL261 modificadas com luciferase. Este método permite o acompanhamento não invasivo do desenvolvimento tumoral e das respostas ao tratamento em modelos murinos imunocompetentes de glioblastoma.

Bioluminescência imagem de um modelo animal para imunocompetentes Glioblastoma

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