Name: Construção de-base celular Neurotransmissores fluorescentes Engineered Repórteres (CNiFERs) para detecção óptica de neurotransmissores In Vivo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: Aprenda a construir CNiFERs usando células HEK293 para monitorar neurotransmissores em tempo real no cérebro. Este método permite detectar dinâmicas de neuromoduladores in vivo com imagem fluorescente.

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Agradecemos B. Conklin (Universidade da Califórnia, San Francisco) por fornecer os qi5 G e G QS5 cDNAs, A. Schweitzer para assistência com a eletrônica, N. Taylor para a assistência com a seleção de clones, Ian Glaaser e Robert Rifkin para leitura de prova e Olivier Griesbeck para TN-XXL. Este trabalho foi apoiado por bolsas de investigação, através do Instituto Nacional sobre Abuso de Drogas (NIDA) (DA029706; DA037170), o Instituto Nacional de Imagem Biomédica e Bioengenharia (NIBIB) (EB003832), Hoffman-La Roche (88610A) eo &quot;Neuroscience relacionados com a droga de bolsa de formação abuso &quot;por meio de NIDA (DA007315).

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</ol>

Os autores não têm nada para revelar.

A criação de CNiFERs proporciona uma estratégia inovadora e original para opticamente medição da libertação de neurotransmissores no cérebro in vivo. CNiFERs são idealmente adequados para a medição da libertação de extrasynaptic, ou seja, o volume de condução, para neurotransmissores. Importante, cada CNiFER possui as propriedades do GPCR nativo, proporcionando uma medição óptica fisiológica das alterações nos níveis de neurotransmissores no cérebro. Até à data, CNiFERs foram criados para a detecção de...

Para entender completamente como os neurônios se comunicam no cérebro, é necessário ter um método para medir a liberação de neurotransmissores in vivo. Existem várias técnicas bem estabelecidas para a medição in vivo neurotransmissores. Uma técnica utilizada é de microdiálise, em que uma cânula é inserida no cérebro e um pequeno volume de fluido cerebrospinal são recolhidas e analisadas por cromatografia líquida de elevado desempenho e detecção electroquímica 1. Microdiálise tem uma resolução espacial na ordem de alguns diâmetros da sonda, por exemplo, ~ 0,5 mm para uma microssonda de 200 um de diâmetro. A resolução temporal desta técnica, no entanto, é lento devido a intervalos de amostragem que duram tipicamente ~ 5 minutos ou mais 1. Além disso, as análises não são feitos em tempo real. Uma outra técnica é a pesquisa rápida voltametria cíclica (FSCV), que usa uma sonda de fibra de carbono que é introduzido no cérebro. FSCV tem excelente Tempresolução oral (subsecond), de alta sensibilidade (nanomolar), e resolução espacial com o diâmetro da sonda de 5 a 30 um. No entanto, está limitado a FSCV transmissores, que produzem uma característica de oxidação e redução perfil com tensão em uma sonda potenciométrica de carbono 2. Uma terceira técnica para medir neurotransmissores é diretamente através de neurotransmissores geneticamente codificado (NT) biossensores 3. Com este método, uma proteína de fusão é criada que contém um domínio de ligação ao ligando para um transmissor acoplado a uma transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET) par com base na fluoróforos de 4 ou 5 permutado um GFP. Ao contrário dos dois métodos anteriores, estes biossensores são geneticamente codificado e expresso na superfície de uma célula hospedeira, tal como um neurónio, através da produção de animais transgénicos ou de forma aguda com a utilização de agentes virais para infectar as células. Até à data, biossensores geneticamente codificados só foram desenvolvidos para detecting glutamato e GABA 3-5. Limitações com estas técnicas têm sido a baixa sensibilidade, na gama nM, e a incapacidade para expandir a detecção de um grande número de emissores, por exemplo, neurotransmissores clássicos, neuropéptidos e neuromoduladores, que sinalizam através de receptores acoplados à proteína G (GPCRs). Na verdade, existem cerca de 800 GPCRs no genoma humano. Para lidar com essas deficiências, desenvolvemos uma ferramenta inovadora para liberação medida opticamente de qualquer neurotransmissor que sinaliza através de um GPCR. CNiFERs (com base nas células repórteres fluorescentes modificadas neurotransmissor) são células HEK293 clonais manipuladas para expressar um GPCR específico que, quando estimulados, desencadeia um aumento na intracelular [Ca2 +] que é detectado por um sensor baseado em FRET de Ca 2+ geneticamente codificado, TN-XXL. Assim, obrigatório neurotransmissor CNiFERs transformar-se numa alteração na fluorescência, proporcionando uma óptica R em tempo real e directa do receptoread-out da actividade neurotransmissora local. Ao utilizar o receptor nativo para um determinado neurotransmissor, CNiFERs reter a especificidade química, afinidade e dinâmicas temporais dos receptores expresso endogenamente. Até à data, criámos três tipos de CNiFERs, um para detectar a acetilcolina utilizando o receptor M1, um para a detecção de dopamina utilizando o receptor D2, e um para detectar a norepinefrina usando o receptor de 6,7 α1a. A tecnologia CNiFER é facilmente expansível e escalável, tornando-se passível de qualquer tipo de GPCR. Neste artigo Jove, que descrevem e ilustram a metodologia para conceber, realizar, e teste em CNiFERs vivo para qualquer aplicação.

<table><tbody><tr><td>pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro&nbsp;</td><td>System Biosciences</td><td>CD510B-1</td><td>Clonagem: para gerar lentivírus</td></tr><tr><td>12 x 75 *Tubo de Ensaio BD Falcon de Polipropileno de Alta Clareza Fundo Redondo</td><td>BD Biosciences</td><td>352063</td><td>FACS</td></tr><tr><td>BD 40 um Filtros de células Falcon</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td>FACS</td></tr><tr><td>0.05% Tripsina EDTA&nbsp;</td>Placa de 96 Poços <td>Invitrogen</td><td>25200056</td><td>FACS</td></tr><tr><td>, fundo plano, transparente&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>3596</td><td>FACS</td></tr><tr><td>96 placas de cultura de células de poços&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>CLS3997</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Optilux fundo preto transparente&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>3603</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Flexstation pipet tips</td><td>Molecular Devices</td><td>9000-0911</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Cloreto de Acetilcolina Flexstation&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2661</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Norepinefrina&nbsp; &nbsp;</td><td>Cloridrato de dopamina Sigma-Aldrich</td><td>A7256</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1090</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>GABA&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2129</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Histamine&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7125</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Glutamato&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49621</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Epinefrina&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4642</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Somatostatina&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1763</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>5HT&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9523</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>VIP&nbsp;</td><td>Alpha Diagnostics Inc.&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>SP-69627</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Orexin A</td><td>Alpha Diagnostics Inc.&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>12-p-01</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Substância P&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6883</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Adenosina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4036</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Melatonina&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5250C</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Leitor de Placa de Fluorescência & software</td><td>Molecular Devices</td><td>Flexstation 3</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>&nbsp; DMEM (glicose alta) com Glutamax&nbsp; &nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>10569-010</td><td>Cultura de tecidos</td></tr><tr><td>&nbsp; Soro fetal bovino</td><td>Life Technologies</td><td>10082-139</td><td>Cultura de tecidos</td></tr><tr><td>&nbsp; Pen/Strep&nbsp; antibióticos</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>Cultura de tecidos</td></tr><tr><td>&nbsp; Puromicina&nbsp; &nbsp;</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pr-1</td><td>Cultura de tecidos</td></tr><tr><td>&nbsp; Fibronectina&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0895</td><td>Cultura de tecidos</td></tr><tr><td>CoolCell LX Caixa de congelamento de células sem álcool com taxa controlada</td><td>Bioexpress</td><td>D-3508)</td>Cola de cianoacrilato <td>para cultura de</td></tr><tr><td>tecidos&nbsp;</td><td>Loctite</td><td>Loctite no. 495</td><td>cirurgia e injeção estereotáxica</td></tr><tr><td>filme plástico de parafina&nbsp;</td><td>VWR</td><td>Parafilm&reg;</td><td>cirurgia e injeção estereotáxica</td></tr><tr><td>Nanoinjetor</td><td>Drummond</td><td>3-000-204</td><td>cirurgia e injeção estereotáxica</td></tr><tr><td>Eletrodos de vidro</td><td>Drummond</td><td>3-000-203G</td><td>cirurgia e injeção estereotáxica</td></tr><tr><td>broca manual</td><td>OSADA</td><td>Exl-M40</td><td>cirurgia e injeção estereotáxica</td></tr><tr><td>Rebarbas para broca</td><td>Fine Scientific</td><td>19007-05; 19007-07)</td><td>cirurgia e injeção</td></tr> <tr><td>estereotáxicaBanho de esterilização</td><td>FST</td><td>18000-45, cirurgia de esterilizador de esferas quentes</td><td>e câmara/máscara de isoflurano de injeção estereotáxica</td></tr><tr><td></td><td>Highland Medical Equipment</td><td>564-0427, máquina anestésica de mesa HME 109 com vaporizador de isoflurano, medidor de vazão de O2, válvula de gangue; 564-0852, Câmara de Indução 16X7X7,5cm</td><td>cirurgia e injeção estereotáxica</td></tr><tr><td>Escopo 3D com braço</td><td>Cirurgia Zeiss</td><td></td><td>e injeção estereotáxica</td></tr><tr><td>cirurgia de luz</td><td></td><td></td> de fibra óptica <td>e injeção estereotáxica</td></tr><tr><td>Betadine&nbsp;</td><td></td><td></td><td>cirurgia e injeção estereotáxica</td></tr><tr><td>70% (v/v) álcool</td><td></td><td></td> isopropílico <td>cirurgia e injeção estereotáxica</td></tr><tr><td>Almofadas de preparação de iodo-povidona</td><td>dynarex</td><td>1108</td><td>cirurgia e injeção estereotáxica</td></tr><tr><td>NaCl 0,9% (injeção, USP, 918610)</td><td></td><td></td><td>cirurgia e injeção estereotáxica</td></tr><tr><td>CICLOSPORINA (INJEÇÃO, USP)</td><td></td><td></td><td>cirurgia e injeção estereotáxica</td></tr><tr><td>Buprenex (injeção) buprenorfina (0,03 &mu; g por g roedor)</td><td>Cirurgia Sigma-Aldrich</td><td></td><td>e injeção estereotáxica</td></tr><tr><td>Pomada oftálmica&nbsp;</td><td>Akorn</td><td>NDC 17478-235-35</td><td>cirurgia e injeção estereotáxica</td></tr><tr><td>Cirurgia</td><td>Surgifoam Ethicon</td><td></td><td>e injeção estereotáxica</td></tr><tr><td>Cimento dental grip</td><td>Dentsply</td><td>#675571, cirurgia 675572</td><td>e injeção estereotáxica</td></tr><tr><td>SuperCola Instantânea&nbsp;</td><td>NDindustries</td><td></td><td>cirurgia e injeção estereotáxica</td></tr><tr><td>LOCTITE 4041</td><td></td><td></td><td>cirurgia e injeção estereotáxica</td></tr><tr><td>METABOND</td><td>C& B</td><td></td><td>cirurgia e injeção estereotáxica</td></tr><tr><td>nº 0 tampa de vidro</td><td>Fisher</td><td></td><td>cirurgia e injeção estereotáxica</td></tr><tr><td>quadro estereotáxico&nbsp;</td><td>Cirurgia Kopf</td><td></td><td>e injeção estereotáxica</td></tr><tr><td>Sonda retal e almofada de aquecimento</td><td>FHC</td><td>40-90-8D, controlador de temperatura DC, 40-90-2-06, almofada de aquecimento de 6,5X9,5 cm40-90-5D-02, cirurgia de sonda de termistor retal</td> e placa de ensaio óptica <td>de injeção estereotáxica</td></tr><tr><td>para imagem Cirurgia</td><td>Thorlabs</td><td></td><td>e injeção estereotáxica</td></tr><tr><td>Óleo mineral</td><td>Fisher</td><td>S55667</td><td>cirurgia e injeção estereotáxica</td></tr><tr><td>Kwik-Cast (Elastômero de silicone)</td> Instrumentos <td></td><td>de Precisão Mundial</td><td>cirurgia e injeção estereotáxica</td></tr><tr><td>Sutura&nbsp; &nbsp;</td><td>Ethicon</td><td>18' ', 1667, 4-0</td><td>cirurgia e injeção estereotáxica</td></tr><tr><td>Tesoura</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>91500-09, 15018-10</td><td>cirurgia e injeção estereotáxica</td></tr><tr><td>Forcepts</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>11252-30; # 55, 11295-51; Grafe, 11050-10</td><td>cirurgia e injeção estereotáxica</td></tr><tr><td>Estudante Halsted-Mosquito Hemostats</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>91308-12</td><td>cirurgia e injeção estereotáxica</td></tr><tr><td>Kit de cauterizador de pequenos vasos</td><td>Fine Scientific</td><td>Tools 18000-00</td><td>cirurgia e injeção estereotáxica</td></tr><tr><td>Esterilizadores de esferas quentes</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>18000-45</td><td>cirurgia e injeção</td></tr> <tr><td>estereotáxicaEstojo de instrumento com tapete de silicone</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>20311-21</td><td>cirurgia e injeção estereotáxica</td></tr><tr><td>Recipientes de esterilização de plástico com tapete de silicone</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>20810-01</td><td>cirurgia e injeção estereotáxica</td></tr><tr><td>2P escopo de fluorescência de estágio fixo para in vivo imagem</td><td>Olympus</td><td>FV1200 MPE</td><td>imagem in vivo</td></tr><tr><td>Laser</td> <td>multifotônicoSpectraPhysics</td><td>Mai Tai DeepSee</td><td>imagem in vivo</td></tr><tr><td>Laser Verde Olympus</td><td></td><td>473 nm Laser</td><td>in vivo imagem</td></tr><tr><td>xy base translacional</td><td>Scientifica</td><td>MMBP</td><td>imagem in vivo</td></tr><tr><td>Cubo de filtro FRET para YFP e CFP</td><td>Olympus</td><td></td><td>imagem in vivo</td></tr><tr><td>10x e 40x objetivos de imersão em água</td><td>Olympus</td><td></td><td>imagem in vivo</td></tr><tr><td>mesa de ar</td><td>Newport</td><td></td><td>in vivo</td></tr><tr><td>imagem personalizada de gaiola à prova de luz</td><td>Thorlab</td><td></td><td>in vivo</td></tr></tbody></table>

construção de-base celular neurotransmissores fluorescentes engineered repórteres (cnifers) para detecção óptica de neurotransmissores<em&gt; in vivo</em

Construction of Cell-based Neurotransmitter Fluorescent Engineered Reporters (CNiFERs) for Optical Detection of Neurotransmitters In Vivo

Com base nas células repórteres fluorescentes neurotransmissor modificadas (CNiFERs) fornecer uma nova ferramenta para neurocientistas para detectar opticamente a libertação de neurotransmissores no cérebro in vivo. A CNiFER específica é criada a partir de uma célula de rim embrionário humano que expressa estavelmente um receptor específico G acoplado a proteína, que os casais a G q / 11 proteínas G, e uma baseada em FRET Ca 2+ -detector, TN-XXL. A activação do receptor conduz a um aumento no sinal de FRET. CNiFERs tem sensibilidade nM e uma resposta temporal do segundo porque um clone CNiFER utiliza o receptor nativo para um neurotransmissor particular, por exemplo, para D2R dopamina. CNiFERs são directamente implantadas no cérebro, permitindo-lhes sentir a libertação de neurotransmissores, com uma resolução espacial de menos de cem um, tornando-as ideais para medir a transmissão de volume in vivo. CNiFERs também podem ser utilizados para pesquisar outros fármacos para o potencial reactividade cruzada em VIvo. Nós recentemente expandiu a família de CNiFERs para incluir GPCRs que o casal a G i / o G proteínas. CNiFERs estão disponíveis para a detecção de acetilcolina (ACh), dopamina (DA) e norepinefrina (NE). Dado que qualquer GPCR pode ser utilizado para criar um novo CNiFER e que há aproximadamente 800 GPCRs no genoma humano, descrevemos aqui o procedimento geral para conceber, realizar, e testar qualquer tipo de CNiFER.

Um CNiFER é derivada de uma célula de rim embrionário humano (HEK293) que é manipulada para expressar de forma estável pelo menos duas proteínas: uma proteína G específica acoplada do receptor (GPCR) e uma [Ca 2+] Sensor geneticamente codificado, TN-XL. TN-XXL sofre de ressonância de fluorescência de transferência de energia (FRET) entre proteínas ciano e amarelo fluorescente, eCFP e citrino, respectivamente, em resposta ao Ca 2+ 6,15. A activação de GPCR...

Nós apresentamos um protocolo para criar baseada em células neurotransmissor fluorescentes repórteres modificadas (CNiFERs) para a detecção óptica de liberação do neurotransmissor volumétrica.

Construção de-base celular Neurotransmissores fluorescentes Engineered Repórteres (CNiFERs) para detecção óptica de neurotransmissores<em&gt; In Vivo</em

Cell-based neurotransmitter fluorescent engineered reporters (CNiFERs) provide a new tool for neuroscientists to optically detect the release of ...

O objetivo geral deste vídeo é descrever a metodologia para a construção e testagem de Sensores Fluorescentes Baseados em Células para Neurotransmissores, ou CNiFERs, que podem ser usados para monitorar opticamente a liberação de neurotransmissores específicos in vivo. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais em neurociência sobre o momento e a liberação de neuromoduladores no cérebro. A principal vantagem desta técnica é que ela pode ser adaptada para qualquer tipo de neurotransmissor ou neuromodulador que sinalize por meio de GPCRs.A demonstração regional deste método é útil. A injeção in vivo e a subsequente obtenção de imagens de CNiFERs são tecnicamente desafiadoras. Para iniciar este procedimento, observe as células HEK293 que contêm o detector de cálcio com base frontal e a proteína G quimérica em um frasco T-25.Em seguida, cultive as células em um incubador umidificado, a 37 graus Celsius, com cinco por cento de CO2, até atingirem cerca de 50% de confluência. Depois disso, aspire o meio do frasco T-25. Adicione dois mililitros da mistura de meio de lentavírus e incube o frasco T-25 a 37 graus Celsius, com 5% de CO2.No dia seguinte, colete as células HEK293 infectadas adicionando um mililitro de tripsina. Em seguida, ressuspenda o pellet celular em cinco mililitros de meio de crescimento para HEK293. Semee um mililitro de células em um frasco T-75 para congelamento e armazenamento, e 1,5 mililitro de células em um frasco T-25 para análise por FACS.Para a curva de agonista de 10 pontos, para testar as células infectadas, semeie as duas primeiras fileiras de uma placa de 96 poços revestida com fibronectina com 100 microlitros da suspensão celular por poço. Em seguida, incube as células HEK293 crescendo em um frasco T-25, um frasco T-75 e uma placa de 96 poços até atingirem cerca de 90% de confluência a 37 graus Celsius com 5% de CO₂ por um a dois dias. Antes da análise por FACS, determine a expressão funcional do RCPG preparando uma placa de fármaco com 10 concentrações diferentes de agonista que delimitem a EC 50 prevista.Prepare diferentes concentrações do agonista utilizando um método de diluição em série e crie um modelo para acompanhar as concentrações do fármaco. Em seguida, ajuste a temperatura do leitor de placas para 37 graus Celsius. Depois, programe o leitor fluorométrico de placa de 96 poços para medir FRET e realizar transferências de solução.Para medir o fret com um sensor de Cálcio baseado em fret geneticamente codificado, TNXXL, ajuste o comprimento de onda de excitação em 436 mais ou menos 4,5 nanômetros. Em seguida, configure os filtros de emissão e os filtros de corte para ECFP e citrina. Depois, programe o leitor de placas para medir as emissões a cada quatro segundos, durante um total de 180 segundos.Escolha as opções para volume da placa de 100 micro-litros, altura da pipeta de 150 microlitros e entrega de 50 microlitros de fármaco a partir da placa de composto triplicada. Defina o ponto temporal para a administração do fármaco em 30 segundos. Em seguida, aspire o meio das linhas A e B e adicione 100 microlitros de ACSF à placa de detecção de 96 poços, que está com cerca de 90% de confluência.Em seguida, carregue a placa de drogas em triplicata e a placa sniffer de 96 poços no leitor de placas. Deixe as placas se equilibrarem por 30 minutos a 37 graus Celsius antes de iniciar o programa. Após a leitura no leitor de placas, exporte os valores de fluorescência para um arquivo de texto.Em seguida, importe este arquivo para um modelo de planilha previamente criado que normalize as intensidades de fluorescência em relação às linhas de base pré-estímulo, calcule a razão máxima de FRET para cada concentração do agonista e gere uma curva de resposta dose-dependente. Prepare a pipeta de injeção de CNiFER colocando uma capilar de vidro em um puxador de eletrodos vertical. Use um par de pinças para quebrar a ponta do eletrodo até um diâmetro de aproximadamente 40 micrômetros.Coloque uma esponja embebida em ACSF sobre uma janela fina de crânio de dois por três milímetros já formada em um camundongo anestesiado, para mantê-la úmida enquanto prepara as células para injeção. Em seguida, colete o clone CNiFER cultivado em um frasco T-75 até cerca de 80% de confluência. Aspire o meio e lave as células com PBS estéril.Remova o PBS e use 10 mililitros de ACFS para desprender as células do fundo do frasco. Em seguida, pipete vigorosamente as células para dissociar os agregados celulares. Centrifugue por dois minutos em uma centrífuga de cultura celular.Remova o sobrenatante e ressuspenda o pellet em 100 microlitros de ACSF. Em seguida, centrifugue por 30 segundos a 1400 ×g e remova o sobrenatante, deixando um pellet coberto com ACSF. Posteriormente, preencha a pipeta de injeção com óleo mineral.Coloque a pipeta em um nano-injetor. Coloque cinco microlitros de suspensão de células CNiFER em uma tira de filme de parafina plástica próxima à preparação do camundongo. Aspire as células CNiFER para dentro da pipeta puxada.Agora, mova a pipeta para as coordenadas x e y de destino. Abaixe as pipetas e perfure o crânio afinado, preparado anteriormente. Continue até cerca de 200 a 400 micrômetros abaixo da superfície do crânio, nas camadas dois e três da córtex.Injete 4,6 nanolitros de células CNiFER no local mais profundo com o nano injetor. Observe o movimento na interface entre o óleo e as células. Em seguida, aguarde cinco minutos para que as células sejam dispensadas.Retire a pipeta aproximadamente 100 micrômetros e injete outros 4,6 nanolitros de células CNiFER e, novamente, espere cinco minutos. Depois disso, retire a pipeta lentamente e com cuidado para evitar refluxo das CNiFERs. Neste procedimento, posicione a plataforma de imagem com o mouse com a cabeça imobilizada sob uma objetiva de imersão em água 10x em um microscópio de imagem de dois fótons.Insira o cubo de filtro para imagemamento FRET que possui um espelho dicróico em 505 nanômetros e filtros de passagem de banda que abrangem de 460 nanômetros a 500 nanômetros para medir ECFP e de 520 nanômetros a 560 nanômetros para medir citrina. Em seguida, adicione ACSF ao poço, contendo a janela de crânio afinado, e abaixe a objetiva de imersão em água de 10x até o ACSF. Use a ocular em conjunto com a lâmpada de mercúrio e o cubo de filtro GFP para localizar os CNiFERs.Agora, mude para a objetiva de imersão em água de 40x. Em seguida, selecione o caminho óptico apropriado para a imagem de dois fótons. Ligue o laser de pulso femtosegundo de infravermelho próximo.Selecione o comprimento de onda de 820 nanômetros e uma configuração de potência entre 5 e 15%. Ajuste a tensão do pmt um e do pmt dois para um valor submáximo, tipicamente entre 500 e 1000 volts, dependendo do pmt. Em seguida, defina o ganho como um para cada canal e zere a posição z do objetivo. Abaixe o objetivo aproximadamente de 100 a 200 micrômetros a partir da superfície cortical e inicie a varredura xy.Ajuste a potência do laser, o ganho e a voltagem do PMT para cada canal a fim de otimizar a relação sinal-ruído da fluorescência dos CNiFER. Em seguida, use o software para restringir a aquisição de imagens a uma região que contenha as células CNiFER, bem como uma região de fundo. Selecione a linha de Cowman, com média de dois, para obter uma relação sinal-ruído adequada, e utilize uma taxa de varredura de 3 a 1 hertz com quatro microssegundos por pixel.Em seguida, desenhe uma ROI ao redor das células CNiFER. Cerque cerca de três a quatro células por plano. Configure a análise em tempo real das intensidades médias da ROI.Em seguida, inicie a aquisição para monitorar a fluorescência do CNiFER ao longo do tempo e comece a estimulação elétrica ou o experimento comportamental, enquanto monitora o FRET. Neste exemplo, a resposta do FRET do CNiFER D2R foi medida em um leitor de placas com um sistema de entrega de solução. Este gráfico mostra a resposta do FRET durante a aplicação de dopamina em CNiFERs D2.Observe que a emissão de ECFP diminui enquanto a emissão de citrina aumenta com a dopamina. E aqui está um gráfico da razão de FRET correspondente. São mostradas aqui as curvas de resposta à dose para a resposta dos D2 CNiFERs à dopamina e à noradrenalina.Além disso, são apresentados os CNiFERs de controle responsivos que não possuem o D2R. Este gráfico de barras mostra a resposta da razão FRET para outros neurotransmissores e moduladores em 50 nano molar e um micro molar. Aqui, a estimulação elétrica dos neurônios dopaminérgicos na substância negra provoca uma grande alteração na razão FRET para os CNiFERs D2.Observe como a amplitude da resposta aumenta com o aumento da intensidade da estimulação elétrica. O acoplamento da estimulação com injeção de cocaína potencializa a resposta do CNiFER. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como criar, testar e utilizar CNiFERs para imagem in vivo.Durante o desenvolvimento dos CNiFERs, é essencial manter uma técnica estéril, pois essas células serão eventualmente implantadas em camundongos vivos. A realização dos CNiFERs fornece uma ferramenta importante para pesquisas na área de neurociência, permitindo medir opticalmente a liberação de qualquer neurotransmissor ou neuromodulador que sinalize por meio de um receptor acoplado à proteína G. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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