Construção de-base celular Neurotransmissores fluorescentes Engineered Repórteres (CNiFERs) para detecção óptica de neurotransmissores In Vivo

O objetivo geral deste vídeo é descrever a metodologia para a construção e teste de Repórteres Fluorescentes de Neurotransmissores Baseados em Células, ou CNiFERs, que podem ser usados para monitorar opticamente a liberação de neurotransmissores específicos in vivo. Este método pode ajudar a responder a questões-chave na neurociência sobre o tempo e a liberação de neuromoduladores no cérebro. A principal vantagem desta técnica é que ela pode ser adaptada para qualquer tipo de neurotransmissor ou neuromodulador, que sinaliza através do GPCS.

A demonstração regional desse método é útil. É a injeção in vivo, e a imagem subsequente de CNiFERs é tecnicamente desafiadora. Para iniciar este procedimento, consulte as células HEK293 que contêm o detector de cálcio frontal e a proteína g quimérica em um frasco T-25.

Em seguida, cultive as células em uma incubadora umidificada, a 37 graus Celsius, com cinco por cento de CO2, até cerca de 50% confluente. Em seguida, aspirar o meio do balão T-25. Adicione dois mililitros da mistura de meios do vírus lenta e incube o frasco T-25 a 37 graus Celsius, com 5% de CO2.

No dia seguinte, colha as células HEK293 infectadas adicionando um mililitro de tripsina. Em seguida, ressuspenda o pellet celular em cinco mililitros de meio de crescimento HEK293. Semeie um mililitro de células em um frasco T-75 para congelamento e armazenamento e 1,5 mililitros de células em um frasco T-25 para análise FACS.

Para a curva agonista de 10 pontos, para testar as células infectadas, semeie as duas primeiras fileiras de uma placa de 96 poços revestida com fibronectina com 100 microlitros da suspensão celular por poço. Em seguida, incube as células HEK293 que crescem em um frasco T-25, um frasco T-75 e uma placa de 96 poços até cerca de 90% confluente a 37 graus Celsius com 5% de CO2 por um a dois dias. Antes da análise FACS, determine a expressão funcional do GPCR preparando uma placa de medicamento com 10 concentrações diferentes de agonistas que agrupam o EC 50 previsto.

Prepare diferentes concentrações de agonista usando um método de diluição em série e crie um modelo para acompanhar as concentrações do medicamento. Em seguida, defina a temperatura do leitor de placas para 37 graus Celsius. Em seguida, programe o leitor de placas fluorométricas de 96 poços para medir o traste e realizar transferências de solução.

Para medir o traste com um sensor de cálcio baseado em traste geneticamente codificado, TNXXL, defina o comprimento de onda de excitação em 436 mais ou menos 4,5 nanômetros. Em seguida, defina os filtros de emissão e os filtros de corte para ECFP e citrino. Em seguida, programe o leitor de placas para medir as emissões a cada quatro segundos, por um total de 180 segundos.

Escolha as opções para o volume da placa de 100 microlíderes, altura da pipeta de 150 microlitros e entrega de 50 microlitros de medicamento da placa composta tripla. Defina o ponto de tempo para a entrega do medicamento em 30 segundos. Depois disso, aspire o meio das linhas A e B e adicione 100 microlitros de ACSF à placa farejadora de 96 poços, que é cerca de 90% confluente.

Em seguida, carregue a placa de medicamento tripla e a placa de farejador de 96 poços no leitor de placas. Aguarde 30 minutos para equilibrar as placas a 37 graus Celsius, antes de iniciar o programa. Após a execução do leitor de placas, exporte os valores do leitor de fluorescência para um arquivo de texto.

Em seguida, importe esse arquivo para um modelo de planilha feito anteriormente que normaliza as intensidades de florescência para as linhas de base pré-estímulo, calcula a razão de traste de pico para cada concentração de agonista e gera uma curva de resposta à dose. Prepare a pipeta de injeção CNiFER colocando um capilar de vidro em um extrator de eletrodo vertical. Use uma pinça para quebrar a ponta do eletrodo com um diâmetro de aproximadamente 40 micrômetros.

Coloque uma esponja embebida em ACSF em uma janela craniana previamente formada de dois por três milímetros de espessura de um camundongo anestesiado, para mantê-la úmida enquanto prepara as células para a injeção. Em seguida, colha o clone CNiFER que foi cultivado em um frasco T-75 até cerca de 80% de confluência. Aspire o meio e lave as células com PBS estéril.

Remova o PBS e use 10 mililitros de ACFS para desalojar as células do fundo do frasco. Em seguida, tritcherate as células para dissociar os aglomerados de células. Centrifugue durante dois minutos numa centrifugadora de cultura celular.

Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 100 microlitros de ACSF. Em seguida, centrifugue durante 30 segundos a 1400 vezes G e retire o sobrenadante, deixando um pellet coberto com ACSF. Em seguida, encha novamente a pipeta de injeção com óleo mineral.

Carregue a pipeta em um nano injetor. Coloque cinco microlitros de suspensão de células CNiFER em uma tira de filme plástico de parafina perto da preparação do camundongo. Aspirar as células CNiFER para a pipeta puxada.

Agora, mova a pipeta para as coordenadas x e y de destino. Abaixe as pipetas e perfure o crânio afinado, preparado previamente. Continue até cerca de 200 a 400 micrômetros abaixo da superfície do crânio, nas camadas dois e três do córtex.

Injete 4,6 nanolitros de células CNiFER no local mais profundo com o nano injetor. Observe o movimento na interface de óleo e célula. E então, espere cinco minutos para que as células sejam dispensadas.

Retire a pipeta aproximadamente 100 micrômetros e injete mais 4,6 nanolitros de células CNiFER e, novamente, aguarde cinco minutos. Em seguida, retire a pipeta lenta e suavemente para evitar o refluxo dos CNiFERs. Neste procedimento, coloque a plataforma de imagem com o mouse preso à cabeça sob uma objetiva de imersão em água de 10x em um microscópio de imagem de dois fótons.

Insira o cubo de filtro para imagens de trastes que tenha um espelho dicróico de 505 nanômetros e filtros passa-banda que abrangem 460 nanômetros a 500 nanômetros para medir ECFP e 520 nanômetros a 560 nanômetros para medir citrino. Em seguida, adicione ACSF ao poço, contendo a janela do crânio afinada e abaixe a objetiva de imersão em água de 10x no ACSF. Use a ocular em conjunto com a lâmpada de mercúrio e o cubo do filtro GFP para localizar os CNiFERs.

Agora, mude para a objetiva de imersão em água 40x. Em seguida, selecione o caminho de luz apropriado para imagens de dois fótons. Ligue o laser de pulso de femtossegundo infravermelho próximo.

Selecione o comprimento de onda de 820 nanômetros e uma configuração de potência de cinco a 15%Defina a tensão pmt um e pmt dois para um valor submáximo, normalmente 500-1000 volts, dependendo do pmt. Em seguida, defina o ganho como um para cada canal e zere a posição z para o objetivo. Abaixe a objetiva aproximadamente 100 a 200 micrômetros da superfície cortical e inicie a varredura xy.

Ajuste a potência do laser, o ganho e a tensão pmt para cada canal para otimizar a relação sinal-ruído da florescência do CNiFER. Em seguida, use o software para restringir a imagem a uma região que contenha as células CNiFER, bem como a uma região de fundo. Selecione a linha cowman, com média de dois, para uma relação sinal-ruído adequada e use uma taxa de varredura de 3 a um hertz a quatro microssegundos por pixel.

Depois disso, desenhe um ROI ao redor das células CNiFER. Cerca de três a quatro células por plano. Configure a análise em tempo real das intensidades médias do ROI.

Em seguida, inicie a aquisição para monitorar a florescência do CNiFER ao longo do tempo e inicie a estimulação elétrica ou experimento comportamental, enquanto monitora o traste. Neste exemplo, a resposta do traste D2R CNiFER foi medida em um leitor de placas com um sistema de entrega de solução. Este gráfico mostra a resposta do traste durante a aplicação de dopamina aos CNiFERs D2.

Observe que a emissão de ECFP diminui enquanto a emissão de citrino aumenta com a dopamina. E aqui está um gráfico da relação de traste correspondente. Aqui estão mostradas as curvas de resposta à dose para a resposta de D2 CNiFERs à dopamina e à norepineferina.

Além disso, o controle responsivo CNiFERs sem o D2R é apresentado. Este gráfico de barras mostra a resposta da razão de traste para outros neurotransmissores e moduladores em 50 nano molares e um micro molar. Aqui, a estimulação elétrica dos neurônios DA na substância negra provoca uma grande mudança na razão de trastes para D2 CNiFERs.

Observe como a amplitude da resposta aumenta com o aumento da intensidade da estimulação elétrica. O acoplamento da estimulação com a injeção de cocaína aumenta a resposta do CNiFER. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como criar, testar e usar CNiFERs para imagens in vivo.

Ao longo do desenvolvimento dos CNiFERs, é essencial manter a técnica estéril, pois essas células serão implantadas em camundongos vivos. A realização de CNiFERs fornece uma ferramenta importante para pesquisas no campo da neurociência para medir opticamente a liberação de qualquer neurotransmissor, ou neuromodulador, que sinaliza através de um receptor acoplado à proteína G. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.