Medição da Dispersão Não-linearidades de um Nanoparticle plasmonic Individual
3 de janeiro de 2016
Espalhamento saturável e saturável reverso foram descobertos em partículas plasmônicas isoladas e adotados como um novo método de contraste sem branqueamento em microscopia de super-resolução. Aqui os procedimentos experimentais de detecção e extração de espalhamento não linear são explicados em detalhes, bem como como melhorar a resolução com o auxílio da microscopia de excitação saturada.
O objetivo geral deste experimento é demonstrar o aprimoramento da resolução com espalhamento não linear de nanoestruturas plasmônicas. No campo da microscopia óptica, o contraste e a resolução são os fatores mais importantes. Nossa técnica se expande para o campo de super-resolução com o novo espalhamento baseado em contraste.
A principal vantagem dessa técnica é que o espalhamento das nanopartículas é forte, altamente não linear e não branqueamento. Demonstrando o procedimento estará Hsuan Lee. Um aluno melhor do meu laboratório.
O experimento será realizado em uma bancada óptica. Onde há um microscópio e duas fontes de laser. A primeira fonte de laser é um laser de onda contínua de 532 nanômetros usado para imagens.
O segundo é um laser supercontínuo usado para medições de espectroscopia. Este é um esquema da configuração básica para imagens e espectroscopia. As amostras serão montadas em uma platina de posicionamento piezoelétrico no microscópio confocal.
A luz do laser de 532 nanômetros passa por um filtro de densidade neutra. O feixe é direcionado por um divisor de feixe para espelhos galvano que fornecem varredura raster no plano focal da objetiva do microscópio confocal. A luz espalhada para trás é coletada pela objetiva e focada no detector.
Comece alinhando o caminho de iluminação da luz branca do microscópio. Use a fonte de luz halógena sob iluminação do modelador. Para verificar o alinhamento da íris interna, certifique-se de observar bordas afiadas no octógono através da ocular ou CCD.
Em seguida, use um pedaço de papel para verificar o caminho da luz externa. Verifique se os feixes são parcialmente refletidos pelo divisor de feixe e se propagam em direção ao laser movendo o papel ao longo do caminho da luz. Agora, tenha metas de papel prontas para ajudar no alinhamento adicional.
Os alvos devem estar em papel fino com anéis concêntricos. Coloque esses alvos ao longo do caminho do feixe para que fiquem alinhados com o feixe de halogênio. Aqui, um alvo está posicionado na abertura traseira da lente objetiva.
Este é outro alvo em posição ao longo do caminho óptico. Em seguida, ligue o laser de 532 nanômetros usado para imagens para alinhá-lo. Use os alvos de papel para ajudar a colimar a luz laser incidente oposta ao feixe de halogênio.
Continue com um alinhamento mais preciso do feixe de laser antes de remover os alvos e prosseguir. Depois de alinhar o laser, obtenha uma amostra de nanoesfera de ouro preparada para o experimento. Esta amostra tem nanoesferas de ouro de 80 nanômetros em óleo.
A mistura é selada entre duas placas de vidro. Continue montando a amostra no microscópio stage e adicionando óleo objetivo. Neste ponto, prepare o sistema de detecção para imagens.
Colete a luz espalhada com o tubo fotomultiplicador no final do caminho óptico. De volta ao longo do caminho do feixe, tenha um orifício de 20 micrômetros de diâmetro para bloquear a luz espalhada fora de foco do tubo fotomultiplicador. Prossiga com a imagem ligando os espelhos galvano e o multiplicador de fotos.
Observe o monitor do computador para ver o scanner traseiro no sinal das nanopartículas de ouro. Maximize o scanner traseiro no sinal ajustando a posição do orifício e a altura do estágio de amostra. Após alinhar o microscópio confocal, caracterize a não linearidade de espalhamento da amostra.
Para fazer isso, primeiro use um medidor de potência para medir a potência do laser após a lente objetiva. A leitura deve ser inferior a 10 microwatts, correspondendo a uma intensidade de excitação inferior a 10 elevado a quatro watts por centímetro quadrado. Em seguida, adquira uma imagem das nanopartículas de ouro usando o tubo fotomultiplicador.
Abra a imagem capturada no software de análise de imagem para caracterizar o perfil de intensidade de dispersão. Selecione uma nanoesfera de ouro entre as da imagem e desenhe uma linha através dela. Em seguida, siga as etapas necessárias no software para recuperar o perfil de dispersão.
Encaixe o perfil em um gaussiano que permite uma verificação adicional do alinhamento do sistema de imagem. Agora, comece a escanear sistematicamente as intensidades de excitação. Primeiro, troque o filtro de densidade neutra para aumentar a intensidade de excitação.
Determine a nova intensidade de excitação e registre a imagem de retrodifusão no novo nível de intensidade. Use a imagem para extrair um perfil de espalhamento de uma nanoesfera como antes. Plote o perfil de espalhamento e identifique seu valor no centro da esfera como o sinal de espalhamento.
Repita essas etapas várias vezes para construir um gráfico do sinal de espalhamento versus intensidade de excitação. Nesta figura, os pontos azuis representam dados. A linha vermelha é um ajuste polinomial.
Existe uma relação linear entre o sinal de espalhamento e os baixos valores da energia de excitação. A queda abaixo dessa relação linear indica que ocorreu saturação. O próximo passo é realizar espectroscopia em uma única nanoesfera de ouro.
Este esquema fornece uma visão geral da configuração. Use uma fonte de laser supercontínua com uma faixa de comprimento de onda de 450-1750 nanômetros. Além disso, use um divisor de feixe de banda larga 50/50 para garantir a cobertura espectral sobre o espectro visível.
Coloque um espelho giratório na frente do tubo multiplicador de fotos para direcionar a luz para o espectrômetro. Que é equipado com um dispositivo de carga acoplada. O laser supercontínuo deve ser alinhado usando o mesmo procedimento que o laser de 532 nanômetros.
Na saída do laser supercontínuo, tome algumas precauções para remover o excesso de energia infravermelha do sistema. Coloque espelhos refletores de luz visível no caminho óptico logo após a saída do laser, antes de enviar o feixe para o microscópio. Em conjunto com os espelhos, use despejos de feixe para coletar a radiação infravermelha que pode danificar o sistema.
Com o laser alinhado, adquira e imagem das nanoesferas de ouro. Veja a imagem e identifique uma única nanoesfera para estudo. Fixe o foco da luz de banda larga incidente na nanoesfera escolhida.
Em seguida, certifique-se de que o espectrômetro esteja no caminho óptico. Nesta posição, o espelho giratório direciona a luz incidente para o tubo fotomultiplicador. Reoriente o espelho para direcionar a luz incidente para o espectrômetro.
Prossiga para coletar dados sobre o espectro de espalhamento da nanopartícula de ouro única. Como neste exemplo, o espectro medido será uma mistura de dispersão de nanoesferas e fundo devido a reflexões. Depois de tirar o espectro, retorne o espelho de inversão.
Gire-o para direcionar a luz para o tubo multiplicador de fotos. Tire outra imagem para confirmar que a nanopartícula de ouro não mudou de posição. Em seguida, mude o foco da luz de banda larga para um ponto onde não haja partículas.
Mude o espelho novamente para direcionar a luz para o espectrômetro e prossiga para fazer outra medição do espectro. O novo espectro é o pano de fundo. Ele será subtraído do espectro da nanosfera de ouro.
Aqui está o espectro de retroespalhamento claro produzido pela subtração do espectro de fundo do espectro com as nanoesferas de ouro. A microscopia de excitação saturada da amostra requer uma configuração diferente. Este é o esquema do microscópio de excitação saturada.
A fonte de laser é um laser de 532 nanômetros. Use um divisor de feixe 50/50 para criar dois feixes a partir da fonte de laser. Passe cada feixe por um modulador óptico acústico separado.
As diferentes frequências do modulador geram uma frequência de batimento que servirá como frequência de modulação dos sinais de excitação saturados. Combine os feixes difratados de primeira ordem dos moduladores ópticos acústicos com outro divisor de feixe 50/50. Para monitorar a modulação temporal, use uma lâmina de vidro para dividir uma pequena parte da luz do laser em um fotodetector.
Para verificar o sistema, conecte o fotodetector a um osciloscópio. Certifique-se de que nenhuma amostra esteja no lugar. Avalie o sinal do fotodetector no osciloscópio.
O sinal deve ser um sinusóide na frequência de batimento se a modulação e a sobreposição do feixe estiverem corretas. Para este experimento, a frequência de batimento esperada é de 10 kilohertz. Faça esforços para obter uma senóide o mais perfeita possível com o mínimo de não linearidade.
O próximo passo é incorporar um amplificador de bloqueio ao sistema. Para microscopia de excitação saturada, o amplificador de bloqueio tem entrada do fotodetector e do tubo fotomultiplicador. Desconecte a saída do fotodetector do osciloscópio e conecte-o à entrada de referência do amplificador.
Conecte a saída do tubo fotomultiplicador ao amplificador de travamento como entrada de sinal. Envie a saída do amplificador para uma placa de aquisição de dados. Neste ponto, monte a amostra no microscópio stage.
Use a mesma amostra com nanoesferas de ouro de 80 nanômetros em óleo selado entre duas placas de vidro. Retorne ao amplificador de bloqueio enquanto faz as medições. Defina o amplificador para exportar a magnitude absoluta do sinal de tensão.
Neste caso, selecionando R"no painel de exibição do canal 1. Altere a configuração do componente harmônico no canal de referência para obter as amplitudes simples de excitação saturada. Essas imagens coloridas são formadas usando software personalizado para sincronizar e combinar os sinais do amplificador de travamento e as tensões de acionamento dos motores galvano.
A imagem do microscópio eletrônico de varredura é para comparação. As imagens demonstram o aprimoramento da resolução com diferentes componentes harmônicos. O espectro medido de uma nanoesfera de ouro de 80 nanômetros está em vermelho.
A curva sólida calculada usando a teoria de Mie mostra excelente concordância. A ressonância plasmônica de superfície localizada é de 580 nanômetros. As imagens de espalhamento, acima, e os perfis de linha, abaixo, têm características diferentes em função da intensidade de excitação.
Em baixa intensidade, a função de propagação de pontos é um perfil gaussiano padrão. Intensidades mais altas resultam no achatamento e alargamento da função, indicando saturação. Em valores mais altos, a intensidade central não é o máximo, resultando em uma função de propagação de pontos em forma de rosquinha.
Eventualmente, a intensidade central torna-se o pico novamente durante a saturação reversa. Os pontos de dados azuis neste gráfico da intensidade central em diferentes intensidades de excitação revelam o comportamento de saturação e saturação reversa. Os pontos de dados são ajustados a um polinômio de 5ª ordem plotado em vermelho.
Esses dados podem ser usados para extrair os componentes de frequência harmônica. Os componentes harmônicos também podem ser encontrados diretamente usando o amplificador de bloqueio. Este gráfico à esquerda é de dados experimentais.
O gráfico certo é o resultado do cálculo usando o ajuste polinomial de 5ª ordem. Ambos os gráficos exibem quedas em intensidades específicas ao longo das curvas. Por exemplo, três mergulhos no segundo harmônico.
Também em cada parcela, para cada ordem harmônica, a inclinação aumenta após o primeiro mergulho. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em menos de três horas se você executá-la corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante verificar a qualidade da modulação senoidal, a linearidade do sistema de detecção e a estabilidade mecânica da amostra.
Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como obter o aprimoramento da resolução com base no espalhamento não linear de nanoestruturas plasmônicas. Esta técnica fornece uma amostra aspirante para pesquisadores no campo da microscopia de super-resolução explorarem novos contrastes em outras interações fundamentais entre luz e matéria.
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Visão Geral
Este estudo explora o aprimoramento da resolução na microscopia óptica por meio do espalhamento não linear proveniente de nanoestruturas plasmônicas. A técnica aproveita o espalhamento intenso, altamente não linear e não fotodegradável de nanopartículas para melhorar o contraste e a resolução.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Microscopia Óptica
- Plasmônica
- Técnicas de Super-resolução
Antecedentes
- O contraste e a resolução são fundamentais na microscopia óptica.
- A dispersão não linear oferece uma abordagem inovadora para aprimorar as técnicas de imagem.
- Partículas plasmônicas exibem propriedades únicas de dispersão.
- Este método supera limitações das técnicas tradicionais de microscopia.
Objetivo do Estudo
- Demonstrar o aumento da resolução utilizando espalhamento não linear.
- Explicar os procedimentos experimentais para detectar e extrair o espalhamento não linear.
- Mostrar as vantagens da microscopia de excitação saturada.
Métodos Utilizados
- Procedimentos experimentais para o isolamento de partículas plasmônicas.
- Técnicas de detecção para espalhamento não linear.
- Métodos para aumentar a resolução por meio de excitação saturada.
- Demonstração realizada por um estudante do laboratório de pesquisa.
Resultados Principais
- Detecção bem-sucedida de espalhamento saturável e inversamente saturável.
- Demonstração do aprimoramento da resolução em microscopia de super-resolução.
- Estabelecimento de um método de contraste sem desbotamento para imageamento.
- Validação da eficácia da técnica por meio de resultados experimentais.
Conclusões
- A dispersão não linear de partículas plasmônicas melhora significativamente a resolução da microscopia.
- O método oferece uma alternativa promissora às técnicas tradicionais de imagem.
- Aplicações futuras podem expandir as capacidades da microscopia de super-resolução.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A dispersão não linear em nanoestruturas plasmônicas permite o aprimoramento da resolução na microscopia óptica sem fotodesvanecimento, abordando uma limitação fundamental na imagem de células vivas e em estudos longitudinais. Esta abordagem fornece um mecanismo de contraste sem desvanecimento que apoia a confiança preditiva na validação de alvos, permitindo medições repetidas de estruturas biológicas ao longo do tempo. A dependência da técnica em relação à ressonância de plasmones de superfície localizada (LSPR) oferece uma via para redução de riscos mecanicistas no desenvolvimento de ensaios por meio da modulação do sinal dependente da intensidade.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio da resposta de sinal não linear associada à RPLS, apoiando a validação de alvos por meio do comportamento de dispersão dependente do comprimento de onda.
- Valor Operacional: Oferece uma leitura reutilizável e não destrutiva para rastrear biomarcadores ligados a nanopartículas ao longo de múltiplos ciclos de imagem.
- Valor Preditivo: Perfis de saturação e saturação reversa permitem reduzir riscos em estudos de engajamento de alvos ao distinguir sinais específicos de sinais inespecíficos com base na resposta de intensidade.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera perfis quantitativos de dispersão dependentes da intensidade que permitem discriminar eventos de ligação em formatos de alto rendimento.
- Valor Operacional: Apoia a padronização de ensaios por meio de curvas de resposta não lineares reprodutíveis ajustadas a modelos polinomiais, reduzindo a variabilidade entre ensaios.
- Escalabilidade: Compatível com plataformas de microscopia confocal, permitindo integração nos fluxos de trabalho de triagem existentes sem necessidade de novos instrumentos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Relaciona mecanismos de contraste baseados em nanopartículas, desde a descoberta até a validação pré-clínica, por meio de resposta não linear consistente impulsionada pela RPLS.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Permite o monitoramento da estabilidade e dispersão de nanopartículas em meios complexos por meio de deslocamentos nos limiares de saturação do espalhamento.
- Alinhamento com Biomarcadores: Facilita o rastreamento longitudinal de sondas plasmônicas em modelos de tecidos, apoiando a confiança preditiva em estudos de biodistribuição e retenção no alvo.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método insere-se no continuum de descoberta, desde a validação inicial do alvo até a avaliação pré-clínica, onde a dispersão não linear atua como uma leitura estável e quantificável para estudos de mecanismo de ação e otimização de sondas.
- Biologia de Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses ao fornecer leituras dependentes da intensidade que se correlacionam com desvios na ressonância de plasmon após ligação ao alvo.
- Triagem: Fornece sinais prontos para ensaios e reprodutíveis por meio de varreduras padronizadas de intensidade de excitação e aquisição espectral com subtração de fundo.
- Análise: Permite a extração de componentes harmônicos e limiares de saturação por meio de amplificação por detecção síncrona e ajuste polinomial, oferecendo dados multiparamétricos para discriminação de compostos promissores.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se a estudos pré-clínicos por meio de imagem sem desbotamento, permitindo avaliação longitudinal do comportamento de nanopartículas em sistemas relevantes para doenças.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma capacidade de plataforma para uso repetido em diversos projetos, reduzindo a necessidade de revalidação e permitindo a adoção cruzada de métodos de contraste plasmônico por diferentes equipes.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva na validação de alvos por meio de vínculos mecanicistas entre não linearidade de espalhamento e LSPR, reduzindo falsos positivos na triagem inicial.
- Valor Operacional: Padronização e reprodutibilidade por meio da amplificação fixa e subtração de fundo de referência, garantindo quantificação consistente do sinal.
- Valor Estratégico: Melhoria nas decisões de prosseguimento ou interrupção ao permitir medições repetidas e não degradativas que reduzem a incerteza biológica em candidatos líderes.
- Impacto no Portfólio: Priorização ajustada ao risco por meio de sinais quantificáveis e responsivos à intensidade que refletem a estabilidade do engajamento com o alvo ao longo do tempo.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em alinhamento óptico, segurança com laser e preparação de amostras plasmônicas para garantir a integridade do sinal.
- Depende da microscopia confocal com detecção por PMT, filtragem de densidade neutra e controle de estágio piezoelétrico para modulação precisa da intensidade.
- Exige padronização entre equipes dos protocolos de excitação e métodos de subtração de fundo para assegurar reprodutibilidade entre laboratórios.
- A adaptação a tamanhos ou formas alternativas de nanopartículas requer nova validação da posição da RPLS e dos limiares de saturação correspondentes.
- As limitações práticas incluem sensibilidade à deriva da amostra e ao ruído do laser, que devem ser controladas por meio de estabilização mecânica e média de sinal.
Perguntas Frequentes sobre Biofármacos
Chapters in this video
0:05
Title
0:44
Alignment of the Confocal Microscope Setup
4:11
Characterization of Scattering Nonlinearity
6:15
Measurement of a Scattering Spectrum of a Single Gold Nanosphere
9:03
Alignment of the Saturated Excitation (SAX) Microscope
12:15
Results: Spectrum, Scattering Signal vs Excitation Intensity, and Saturated Excitation Harmonic Signal Strengths for a Gold Nanosphere
14:10
Conclusion
