Name: Medição da Dispersão Não-linearidades de um Nanoparticle plasmonic Individual (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 6 s
Description: Aprenda a medir dispersões não-lineares de nanopartículas plasmônicas individuais para microscopia de super-resolução. Este método utiliza espalhamento forte e não-fotodegradável para aprimorar contraste e resolução em imagens ópticas.

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Este trabalho é apoiado pelo Ministério da Ciência e Tecnologia sob NSC-101-2923-M-002-001-MY3 e NSC-102-2112-M-002-018-MY3. Esta pesquisa também é apoiada pela Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência (JSPS) por meio do "Programa de Financiamento para Pesquisadores Líderes Mundiais da Próxima Geração (Programa NEXT)", iniciado pelo Conselho de Política Científica e Tecnológica (CSTP) e pelo Programa CORE Asiático da JSPS.

1. GNS Preparação de Amostras <ol><li> Antes de preparar a solução de colóide Sonicar GNS 1 ml da amostra para pelo menos 15 minutos a cerca de 40 kHz a evitar a agregação das partículas, o que pode fazer com que o pico LSPR a mudar. </li><li> Largar 100-200 mL de GNS colóide em uma lâmina de vidro com silicato de alumínio e magnésio (MAS) de revestimento comercial para corrigir o GNSS. </li><li> Depois de pelo menos 1 min, remover o colóide adicional, através de lavagem com água destilada. O tempo de espera depende da densidade de distribuição requerido do GNSS. Tipicamente, 1-3 min resulta numa densidade adequada que permite que as partículas a ser facilmente identificado uma vez que a maior parte deles são isolados uns dos outros. Agregação significativa pode ocorrer se o tempo de espera é muito longo. </li><li> Seca-se a amostra por purga com azoto gasoso. </li><li> (Opcional) Para mapear o GNSS no vidro com alta resolução, realizar microscopia eletrônica de varredura (MEV), nesta fase, 23. Uma imagem de exemplo é fornecido em Figure 1, que mostra a densidade característica de GNSS. Usar um SEM de emissão de campo para obter a imagem. Uma vez que o óleo é adicionado sobre a amostra (passo seguinte), que vai ser difícil de remover o óleo e observar a amostra com o SEM. </li><li> Adicionar uma gota de óleo com o mesmo índice de refracção para a amostra para o cobrir GNSS e para eliminar a forte reflexão a partir do substrato de vidro. </li><li> Coloque uma tampa de vidro no topo da amostra e selá-lo com unha polonês. </li><li> Espere pelo menos 5 minutos até que a unha polonês seca. A amostra está pronta agora. </li></ol> 2. Alinhamento da Home-construído microscópio confocal <ol><li> Veja a Figura 2 para o esquema de configuração. Alinhe o caminho iluminação de luz branca do próprio corpo do microscópio. Ligue a fonte de luz de halogénio do microscópio, e seguir o manual do fabricante do microscópio para alcançar a condição de iluminação Köhler. Certifique-se de que os brancos feixes de luz halógena são quase paralelo na parte de trásabertura da objectiva, parcialmente reflectido pelo divisor de feixe a 50/50, e, em seguida, propagar para o laser. </li><li> Ligar os espelhos galvano para garantir que se mantêm na posição inicial correcta, isto é, no centro da gama de varrimento. </li><li> Coloque pelo menos dois alvos, feitas por uma fina folha de papel com anéis concêntricos sobre ele, ao longo do trajeto de luz halógena, e alinhá-los com o feixe de halogéneo. </li><li> Para realizar imagem, selecione o laser de 532 nm. Para executar medidas de espectroscopia, selecione o laser super-continuum. Durante o alinhamento, a potência dos lasers deve ser inferior a 10 mW na abertura traseira do objectivo de evitar a não-linearidade. Em seguida, colimar o feixe de laser incidente oposta ao feixe de saída de halogéneo, com o auxílio dos dois alvos. Quando este processo estiver completo, o alinhamento grosseiro do feixe de laser que foi alcançado. </li><li> Alinhar o feixe de laser através do centro da abertura da parte de trás da lente objectiva. Tipicamente, usar um oiobjetivo l-imersão. Adicionar uma gota de óleo entre a lente objectiva de imersão em óleo e a amostra GNS. Utilizar um tubo fotomultiplicador (PMT), como o detector para recolher os sinais de espalhamento do GNSS. </li><li> Coloque uma pinhole 20 mícrons de diâmetro na frente da PMT para bloquear fora de foco espalhando sinais. Ligue os espelhos galvano e PMT (via software home-construído), ajuste a posição pinhole e altura do estágio da amostra para maximizar os sinais de retroespalhamento do GNSS, e, em seguida, observar um GNS individuais em uma tela de computador. A imagem de amostra xy do GNSS com o alinhamento correto é mostrado na Figura 2B. </li><li> Alterar um pouco a altura da fase de amostra para verificar a concentricidade do foco. Se não é concêntrica, ajustar o feixe com os dois espelhos em frente do scanner até que o centro do GNS permanece na mesma posição enquanto que a altura da plataforma da amostra é alterada. Certifique-se de que a imagem xz do PSF é semelhante à Figura 2Cpara garantir o alinhamento correto do feixe. Processar essas duas imagens com low-pass e filtros lisos Gauss. </li></ol> 3. Caracterização de Scattering Nonlinearity <ol><li> Em baixa intensidade de excitação (menos de 10 4 W / cm 2), adquirir uma imagem de nanopartículas de ouro, seguindo protocolo 2.6. </li><li> Abra a imagem no ImageJ (ou qualquer outro software de análise de imagem). Desenhar uma linha que atravessa um dos GNSS na imagem (ver Figura 2B), e usar Análise -&gt; perfil Lote das ferramentas ImageJ para recuperar o perfil de intensidade de espalhamento. Se encaixa no perfil do PSF escolhido por uma função de Gauss: <img alt="Equação 2" src="/files/ftp_upload/53338/53338eq2.jpg" /> em que y é o valor da leitura PMT, y 0 é o valor de fundo (se houver), A é ​​a amplitude de pico, W é a largura, X é a coordenada espacial, e X c é o centro coordinatE da função de Gauss. A FWHM do PSF correspondente é (½ln2) w. Com base na abertura numérica (AN) da objectiva, a FWHM teórica do PSF confocal pode ser estimado como sendo de aproximadamente 0.43l / NR, onde L é o comprimento de onda de excitação. Compare esses dois números para verificar o alinhamento do sistema de imagem. </li><li> Aumente a intensidade de excitação, alterando manualmente o filtro de densidade neutra (ND) na Figura 2A, e gravar as imagens de retroespalhamento em cada nível de intensidade. Pegue o valor do sinal de espalhamento do centro de cada GNS em diferentes intensidades de excitação, e traçar a curva de dispersão sinais contra intensidades de excitação. Verifique a linearidade dos primeiros pontos, que devem exibir uma relação linear, quando a intensidade de excitação é suficientemente baixo. Desenhar uma linha com base no ajuste linear dos primeiros pontos. Se as intensidades de dispersão dos pontos subsequentes cair abaixo desta tendência linear, saturatioN ocorreu. </li><li> Depois de observar a dispersão saturable, diminuir gradualmente a intensidade abaixo do limiar de saturação e imagem do mesmo GNSS novamente para garantir a reversibilidade dos comportamentos não-lineares. </li></ol> 4. Medição de uma Dispersão de Espectro de um único ouro Nanosphere <ol><li> Para medir o espectro de retroespalhamento a partir de uma única GNS, utilizar o laser super-contínuo como a fonte de laser. O comprimento de onda do laser inicial varia de 450 nm a 1.750 nm. Para remover o excesso de energia de infravermelhos que pode causar dano à amostra e os componentes ópticos, colocar um ou dois espelhos logo após o laser super-contínuo de modo a reflectir a luz visível, e usar feixe despeja para recolher o excesso de luz infravermelha. </li><li> Siga os procedimentos de alinhamento na Seção 2 para dirigir o laser super-contínuo no microscópio confocal de varredura a laser. Use uma banda larga 50/50 BS para garantir a cobertura espectral em toda a gama visível. </li><li> Adquirir umaimagem dos GNSS no vidro. Localizar um único sinal de GNS na imagem, e fixar a focagem da luz incidente de banda larga sobre a partícula. </li><li> Usar um espelho lançando na frente da PMT para dirigir o sinal para o espectrómetro de retroespalhamento, a qual está equipada com um dispositivo de acoplamento de carga, e, em seguida, tomar um espectro das GNS individuais seleccionados. Ter cuidado para que o espectro é aqui uma mistura de GNS espalhamento e de fundo devido a reflexões a partir de outras superfícies. </li><li> Alterne de volta para o detector PMT, e tomar uma outra imagem para confirmar que a posição da partícula não mudou. Em seguida, mudar o foco para um ponto em que nenhuma partícula está presente. Alterne de volta para o espectrômetro, e dar mais um espectro, o que representa o fundo. </li><li> Subtrair o espectro de fundo a partir do passo 4.5 do espectro do passo 4.4 para obter um espectro backscattering clara de uma única GNS. </li></ol> 5. Alinhamento do SAX Microscópio <ol><li> Ver Figura 3para o esquema do microscópio SAX, onde uma modulação temporal, sinusoidal ideal é obtido a partir da freqüência de batimento entre dois moduladores acusto-óptica (OMA). Em primeiro lugar, ajustar o tamanho do feixe do laser para cumprir a exigência dos OMAs subseqüentes. Dividir a luz do laser de 532 nm em dois feixes usando um divisor de feixe 50/50. </li><li> Orientar os dois feixes através dos dois OMA, com um feixe passa através de cada OMA. As frequências de modulação dos dois OMAs deve ser diferente. Por exemplo, um pode ser pelo 40,000 MHz e o outro em 40.010 MHz, obtendo-se uma diferença de frequência de 10 kHz. Esta freqüência diferença será a frequência de modulação fundamentais f m para os sinais SAX. </li><li> Pegue a primeira ordem feixes difratados de ambas as OMA, e combinar os dois feixes usando outro divisor de feixe 50/50. Ajustar os espelhos após as OMA para colimar os dois feixes. </li><li> Adicionar um fotodetector, que é ligado a um osciloscópio para monitorar o modulatio temporaisn. Dividir uma pequena porção do laser com uma lâmina de vidro, e enviá-lo para o fotodetector, tal como mostrado na Figura 3. Com modulação correcta e a sobreposição do feixe, observar modulação de intensidade sinusoidal no principal de frequência f m, semelhante ao da forma de onda mostrada na Figura 4. Nota: O fundo da modulação precisa de ser tão baixa quanto possível para obter a máxima profundidade de modulação. Além disso, usar a função de análise de Fourier do osciloscópio para verificar se a distorção harmônica da modulação está diminuindo. Para atingir implementação SAX bem sucedido, garantir uma sinusoidal modulação de intensidade de excitação perfeito com não-linearidade inicial minimizado. </li><li> Desligue a saída elétrica do fotodetector do osciloscópio e conectar-se a entrada de referência de um amplificador lock-in. </li><li> Como mostrado na Figura 3, alinhar o feixe de laser no sistema confocal seguindo os protocolos anteriores. Here, ligar a saída eléctrica do PMT ao amplificador lock-in como a entrada de sinal. </li><li> Utilizar um vidro de cobertura em branco como a amostra, e verificar a linearidade do sistema de detecção eléctrica, aumentando gradualmente a potência de excitação ,, como mostrado na Figura 5, em que o detector é linear abaixo de um valor de leitura de 1-V. Em todas as medições posteriores, ter o cuidado de restringir a leitura para abaixo deste valor. </li><li> Definir a saída do amplificador lock-in para exportar a grandeza absoluta do sinal de tensão. Ao alterar a componente harmónica fixação no canal de referência, obter as amplitudes dos sinais Sax, A 1, A 2, e assim por diante. </li><li> Exportar a sinais linear e não linear do amplificador lock-in para um cartão de aquisição de dados, que também recebe os sinais de tensão de condução dos espelhos galvano digitalização raster. Com o auxílio de um programa personalizado Labview, sincronizar os sinais do amplificador e do lock-ingalvano espelhos para formar uma imagem. </li><li> Para optimizar a relação de sinal-para-ruído nas imagens, seleccionar adequadamente a aquisição de pixel e o tempo de integração do amplificador lock-in. Por exemplo, quando a frequência de modulação principal M H de excitação é de 10 kHz, ou seja, quando o período é de 100 ms, definir o tempo de integração do amplificador lock-in que ser pelo menos três vezes mais do que o período. Adicionando o tempo do movimento espelho galvano, a velocidade de aquisição é de 1.500 pixels por segundo no modo de imagem SAX. </li></ol>

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

No protocolo, existem vários passos críticos. Em primeiro lugar, quando da preparação das amostras, a densidade de nanopartículas não deve ser demasiado elevada, a fim de evitar o acoplamento entre as partículas plasmonic. Se duas ou mais partículas são muito próximos uns dos outros, os resultados de engate, no comprimento de onda LSPR mudando para comprimentos de onda maiores, reduzindo assim significativamente a não-linearidade. No entanto, esta técnica de imagiologia, na verdade, mapeia a distribuição dos modos plasm...

O estudo da plasmonics tem atraído grande interesse devido às suas aplicações em diversos campos 1-4. Um dos campos mais investigados em plasmonics é plasmonics superfície, em que a oscilação colectiva de electrões de condução casais com uma onda electromagnética externa numa interface entre um metal e dielétrico. Plasmônica de superfície tem sido explorado por suas potenciais aplicações em subwavelength óptica, biophotonics, e microscopia 5,6. O aprimoramento campo forte no volume ultra-pequenas de nanopartículas metálicas, devido à localizada ressonância de plasma de superfície (LSPR) tem atraído grande atenção, não só por causa de sua sensibilidade excepcional para tamanhos de partículas, formas de partículas, e as propriedades dielétricas do meio circundante 7 -10, mas também por causa de sua capacidade de aumentar inerentemente fracos efeitos ópticos não-lineares 11. A sensibilidade excepcional de LSPR é valioso para bio-sensores e near-fietécnicas de imagem ld 12,13. Por outro lado, a não-linearidade melhorada de estruturas plasmonic podem ser utilizados em circuitos integrados em aplicações fotónicas tais como a comutação óptica e de processamento de sinal totalmente óptica 14,15. É bem sabido que a absorção plasmonic é linearmente proporcional à intensidade de excitação em baixos níveis de intensidade. Quando a excitação é suficientemente forte, a absorção atinge a saturação. Curiosamente, em intensidades mais elevadas, a absorção aumenta novamente. Estes efeitos não lineares são chamados de absorção saturada (SA) 15-17 e absorção saturada reversa (RSA) 18, respectivamente. Sabe-se que, devido à LSPR, dispersão é particularmente forte em estruturas plasmonic. Com base em electromagnetics fundamentais, a resposta de espalhamento versus intensidade incidente deverá ser linear. No entanto, em nanopartículas, dispersão e absorção estão intimamente ligados através da teoria de Mie, e tanto pode ser de expressed em termos de partes real e imaginária da constante dieléctrica. Sob a hipótese de que uma única GNS comporta-se como um dipolo sob iluminação de luz, o coeficiente de dispersão (Q SCA) e coeficiente de absorção (abs Q) a partir de um único plasmonic nanopartículas de acordo com a teoria de Mie pode ser expresso como 19 <img alt="Equação 1" src="/files/ftp_upload/53338/53338eq1.jpg" /> em que x é 2 πa / λ, a é o raio da esfera, e m é 2 ε m / ε d. Aqui, m ε e ε d correspondem às constantes dieléctricas do metal e dos dieléctricos envolventes, respectivamente. Uma vez que a forma do coeficiente de dispersão é semelhante ao do thcoeficiente de absorção e, portanto, espera-se observar dispersão saturable em uma única nanopartícula plasmonic 20. Recentemente, espalhamento saturável e não linear em uma partícula plasmonic isolado foi demonstrado pela primeira vez 21. É notável que a saturação de profundidade, a intensidade de dispersão, de facto, diminuiu ligeiramente quando a intensidade de excitação aumentada. Ainda mais surpreendentemente, quando a intensidade de excitação continuou a aumentar após a dispersão tornou-se saturado, a intensidade de dispersão aumentou de novo, mostrando o efeito de dispersão inversa 20 saturável. Wavelength- e estudos dependentes de tamanho têm demonstrado uma forte relação entre LSPR e não-linear dispersão 21. As dependências de intensidade e comprimento de onda de dispersão plasmonic são muito semelhantes aos de absorção, o que sugere um mecanismo comum subjacente a estas condutas não-lineares. Em termos de aplicações, é bem known que não linearidade ajuda a melhorar a resolução de microscopia óptica. Em 2007, a excitação saturada microscopia (SAX) foi proposto, o qual pode melhorar a resolução através da extracção do sinal saturado através de uma modulação sinusoidal temporal do feixe de excitação 22. Microscopia SAX baseia-se no conceito de que, para um ponto focal de laser, a intensidade é mais forte no centro do que na periferia. Se o sinal (quer de fluorescência ou dispersão) apresenta um comportamento de saturação, a saturação deve começar a partir do centro, enquanto a resposta linear permanece na periferia. Por isso, se existe um método para extrair apenas a parte saturada, que vai deixar apenas a parte central, enquanto que rejeita a parte periférica, aumentando assim eficazmente a resolução espacial. Em princípio, não há nenhum limite de resolução mais baixa em microscopia SAX, contanto saturação tão profundo é alcançado, e não há danos amostra devido à iluminação intensa. Tem sido demonstrado que a Resoluçãon de imagens de fluorescência pode ser significativamente melhorada através da utilização da técnica SAX. No entanto, sofre de fluorescência o efeito fotobranqueamento. Combinando a descoberta de espalhamento não-linearidade e do conceito de SAX, microscopia super-resolução com base no espalhamento pode ser realizado 21. Em comparação com microscopias de super-resolução convencionais, a técnica baseada no espalhamento fornece um novo método de contraste não-branqueamento. Neste trabalho, uma descrição passo-a-passo é dado para delinear os procedimentos necessários para obter e extrair a não-linearidade da dispersão plasmonic. Os métodos de identificação de dispersão não-linearidades introduzidas pela mudança na intensidade incidente são descritos. Mais detalhes serão fornecidos para desvendar como esses não-linearidades afeta as imagens de nanopartículas individuais e como resolução espacial pode ser melhorada em conformidade, mediante a técnica SAX.

<table><tbody><tr><td>corpo do microscópio</td><td>Olympus, Japão</td><td>BX-51</td><td></td></tr><tr><td>lente objetiva</td><td>Olympus, Japão</td><td>UPlanSapo, 100X, NA 1.4</td><td></td></tr><tr><td>colóide de ouro de 80 nm</td><td>BBI Solutions, Reino Unido</td><td>EM. Laser supercontínuo GC80</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fianium, Reino Unido</td><td>SC400-2-PP</td><td></td></tr><tr><td>espelhos dielétricos de banda larga</td><td>Thorlabs, EUA</td><td>BB1-E02</td><td></td></tr><tr><td>emissão de campo SEM</td><td>JEOL, Japão</td><td>JSM-6330F</td><td></td></tr><tr><td>espectrômetro</td> opcional <td>Andor Technology, Reino Unido</td><td>Shamrock 163</td><td></td></tr><tr><td>dispositivo de carga acoplada</td><td>Andor Technology, Reino Unido</td><td>iDus Moduladores acústico-ópticos DV420A-OE</td><td></td></tr><tr><td></td><td>IntraAction Corp., EUA</td> Amplificador de bloqueio <td>AOM-402AF1</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Stanford Research Systems, EUA</td><td>SR-830</td><td></td></tr><tr><td>Vidro deslizante revestido com MAS</td><td>Matsunami Glass, Japão,</td> <td>S9215</td><td></td></tr></tbody></table>

medição da dispersão não-linearidades de um nanoparticle plasmonic individual

Measurement of Scattering Nonlinearities from a Single Plasmonic Nanoparticle

Plasmonics, que são baseados na oscilação coletiva de elétrons devido à excitação da luz, envolvem campos elétricos locais fortemente aprimorados e, portanto, têm aplicações potenciais em óptica não linear, o que requer intensidade óptica extraordinária. Uma das não-linearidades mais estudadas em plasmônica é a absorção não linear, incluindo comportamentos de saturação e saturação reversa. Embora o espalhamento e a absorção em nanopartículas estejam intimamente correlacionados pela teoria de Mie, não houve relato de não linearidades no espalhamento plasmônico até muito recentemente. 
No ano passado, não apenas a saturação, mas também a saturação reversa do espalhamento em uma partícula plasmônica isolada foi demonstrada pela primeira vez. Os resultados mostraram que o espalhamento saturável exibe uma clara dependência do comprimento de onda, que parece estar diretamente ligada à ressonância plasmônica de superfície localizada (LSPR). Combinados com as medições dependentes da intensidade, os resultados sugerem a possibilidade de um mecanismo comum subjacente aos comportamentos não lineares de espalhamento e absorção. Essas não linearidades de espalhamento de uma única nanoesfera de ouro (GNS) são amplamente aplicáveis, inclusive em microscopia de super-resolução e interruptores ópticos. 
Neste artigo, é descrito em detalhes como medir a não linearidade do espalhamento em um único PNB e como empregar a técnica de super-resolução para melhorar a resolução da imagem óptica com base no espalhamento saturável. Esta descoberta apresenta a primeira microscopia de super-resolução baseada em espalhamento não linear, que é um novo método de contraste sem branqueamento que pode atingir uma resolução tão baixa quanto l/8 e será potencialmente útil em biomedicina e estudos de materiais.

A Figura 6 mostra o espectro medido a partir de um 80 GNS nm. Uma curva calculada com base na teoria de Mie está dada no mesmo plano, que mostra uma excelente concordância. O pico LSPR é de cerca de 580 nm. Na experiência seguinte, o comprimento de onda do laser foi 532 nm, que foi escolhida, pois está localizado dentro da banda plasmonic para melhorar a dispersão óptica com efeito plasmonic e permitir espalhando saturação 21. A Figura 7 mostra qu...

Espalhamento saturável e saturável reverso foram descobertos em partículas plasmônicas isoladas e adotados como um novo método de contraste sem branqueamento em microscopia de super-resolução. Aqui os procedimentos experimentais de detecção e extração de espalhamento não linear são explicados em detalhes, bem como como melhorar a resolução com o auxílio da microscopia de excitação saturada.

Medição da Dispersão Não-linearidades de um Nanoparticle plasmonic Individual

Plasmonics, which are based on the collective oscillation of electrons due to light excitation, involve strongly enhanced local electric fields and thus ...

O objetivo geral deste experimento é demonstrar o aprimoramento da resolução com espalhamento não linear proveniente de nanoestruturas plasmônicas. No campo da microscopia óptica, o contraste e a resolução são os fatores mais importantes. Nossa técnica se estende ao campo da super-resolução com um novo espalhamento baseado em contraste.A principal vantagem dessa técnica é que o espalhamento proveniente de nanopartículas é forte, altamente não linear e não sofre desbotamento. Demonstrará o procedimento Hsuan Lee, um aluno mais novo do meu laboratório.O experimento será realizado em uma bancada óptica, onde há um microscópio e duas fontes a laser. A primeira fonte a laser é um laser de onda contínua de 532 nanômetros utilizado para imageamento.O segundo é um laser de supercontinuum utilizado para medições de espectroscopia. Este é um esquema da configuração básica para ambos, imageamento e espectroscopia. As amostras serão montadas em uma plataforma de posicionamento piezoelétrica no microscópio confocal.A luz do laser de 532 nanômetros passa por um filtro de densidade neutra. O feixe é direcionado por um divisor de feixe até espelhos galvanométricos que realizam varredura em raster no plano focal do objetivo do microscópio confocal. A luz espalhada de volta é coletada pelo objetivo e focalizada no detector.Inicie alinhando o caminho de iluminação com luz branca do microscópio. Utilize a fonte de luz de halogênio sob iluminação de condensador. Para verificar o alinhamento da íris interna, certifique-se de observar bordas nítidas no octógono por meio da ocular ou da CCD.Em seguida, utilize um peda&ccedil;o de papel para verificar o trajeto da luz externa. Verifique se os feixes s&atilde;o parcialmente refletidos pelo divisor de feixe e se propagam em dire&ccedil;&atilde;o ao laser movendo o papel ao longo do trajeto da luz. Agora, tenha &agrave; m&atilde;o alvos de papel para auxiliar no alinhamento adicional.Os alvos devem ser feitos em papel fino com anéis concêntricos. Coloque esses alvos ao longo do trajeto do feixe de modo que fiquem alinhados com o feixe de halogênio. Aqui, um alvo está posicionado na abertura traseira da lente objetiva.Este é outro alvo na posição ao longo do trajeto óptico. Em seguida, ligue o laser de 532 nanômetros utilizado para imageamento, a fim de alinhá-lo. Use os alvos de papel para auxiliar na colimação da luz laser incidente oposta ao feixe de halogênio.Continue com o alinhamento mais preciso do feixe a laser antes de remover os alvos e prosseguir. Após alinhar o laser, obtenha uma amostra preparada de nanosferas de ouro para o experimento. Esta amostra contém nanosferas de ouro de 80 nanômetros em óleo.A mistura é selada entre duas lâminas de vidro. Em seguida, monte a amostra na platina do microscópio e adicione óleo de imersão. Neste momento, prepare o sistema de detecção para a aquisição de imagens.Colete a luz dispersa com o tubo fotomultiplicador no final do caminho óptico. Ao longo do trajeto do feixe, posicione um orifício de 20 micrômetros de diâmetro para bloquear a luz dispersa desfocada que iria atingir o tubo fotomultiplicador. Prossiga com a aquisição de imagens ativando os espelhos galvanométricos e o fotomultiplicador.Observe o monitor do computador para ver o sinal do scanner traseiro das nanopartículas de ouro. Maximize o sinal do scanner traseiro ajustando a posição do diafragma e a altura da platina da amostra. Após alinhar o microscópio confocal, caracterize a não linearidade de espalhamento da amostra.Para fazer isso, utilize primeiro um medidor de potência para medir a potência do laser após a lente objetiva. A leitura deve ser inferior a 10 microwatts, correspondendo a uma intensidade de excitação inferior a 10 à quarta potência watts por centímetro quadrado. Em seguida, adquira uma imagem das nanopartículas de ouro utilizando o tubo fotomultiplicador.Abra a imagem capturada em um software de análise de imagem para caracterizar o perfil de intensidade de espalhamento. Selecione uma nanoesfera de ouro entre as presentes na imagem e trace uma linha através dela. Em seguida, siga os passos exigidos pelo software para obter o perfil de espalhamento.Ajuste o perfil a uma gaussiana, o que permite uma verificação adicional do alinhamento do sistema de imagem. Agora, comece a escanear sistematicamente as intensidades de excitação. Primeiro, altere o filtro de densidade neutra para aumentar a intensidade de excitação.Determine a nova intensidade de excitação e registre a imagem de espalhamento reverso no novo nível de intensidade. Utilize a imagem para extrair um perfil de espalhamento de uma nanoesfera como anteriormente. Trace o perfil de espalhamento e identifique seu valor no centro da esfera como o sinal de espalhamento.Repita esses passos várias vezes para construir um gráfico do sinal de espalhamento versus intensidade de excitação. Nesta figura, os pontos azuis representam os dados. A linha vermelha é um ajuste polinomial.Existe uma relação linear entre o sinal de espalhamento e baixos valores da energia de excitação. A queda abaixo dessa relação linear indica que ocorreu saturação. O próximo passo é realizar espectroscopia em uma única nanoesfera de ouro.Este esquema fornece uma visão geral da configuração. Utilize uma fonte a laser supercontínua com uma faixa de comprimento de onda de 450-1750 nanômetros. Além disso, utilize um divisor de feixe de banda larga 50/50 para garantir cobertura espectral ao longo do espectro visível.Coloque um espelho refletor na frente do tubo fotomultiplicador para direcionar a luz em direção ao espectrômetro, que é equipado com um dispositivo acoplado por carga. O laser de supercontinuum deve ser alinhado utilizando o mesmo procedimento do laser de 532 nanômetros.Na saída do laser de supercontinuum, tome algumas precauções para remover o excesso de potência no infravermelho do sistema. Coloque espelhos refletores de luz visível no trajeto óptico logo após a saída do laser, antes de enviar o feixe para o microscópio. Em conjunto com os espelhos, utilize absorvedores de feixe para coletar a radiação infravermelha que possa danificar o sistema.Com o laser alinhado, adquira e visualize uma imagem das nanoesferas de ouro. Examine a imagem e identifique uma única nanoesfera para estudo. Fixe o foco da luz ampla incidente sobre a nanoesfera escolhida.Em seguida, certifique-se de que o espectrômetro esteja no trajeto óptico. Nessa posição, o espelho basculante direciona a luz incidente para o tubo fotomultiplicador. Reoriente o espelho para direcionar a luz incidente ao espectrômetro.Prossiga para coletar dados sobre o espectro de espalhamento da única nanopartícula de ouro. Como neste exemplo, o espectro medido será uma mistura do espalhamento da nanoesfera e do fundo devido a reflexões. Após obter o espectro, retorne o espelho basculante.Posicione-o para direcionar a luz ao tubo fotomultiplicador. Tire outra imagem para confirmar que a nanopartícula de ouro não mudou de posição. Em seguida, desloque o foco da luz de banda larga para um ponto onde não haja partícula.Altere novamente o espelho para direcionar a luz ao espectrômetro e prossiga para realizar outra medição de espectro. O novo espectro corresponde ao fundo. Ele será subtraído do espectro da nanoesfera de ouro.Aqui está o espectro de espalhamento reverso claro gerado pela subtração do espectro de fundo do espectro com as nanosferas de ouro. A microscopia de excitação saturada da amostra requer uma configuração diferente. Este é o esquema do microscópio de excitação saturada.A fonte a laser é um laser de 532 nanômetros. Utilize um divisor de feixe 50/50 para criar dois feixes a partir da fonte a laser. Passe cada feixe por um modulador acusto-óptico separado.As diferentes frequências moduladoras geram uma frequência de batimento que servirá como frequência de modulação dos sinais de excitação saturados. Combine os feixes difratados de primeira ordem dos moduladores acusto-ópticos utilizando outro divisor de feixe 50/50. Para monitorar a modulação temporal, use uma lâmina de vidro para desviar uma pequena parte da luz do laser até um fotodetector.Para verificar o sistema, conecte o detector fotográfico a um osciloscópio. Certifique-se de que nenhuma amostra esteja posicionada. Avalie o sinal do detector fotográfico no osciloscópio.O sinal deve ser uma senoide na frequência de batimento se a modulação e a sobreposição do feixe estiverem corretas. Para este experimento, a frequência de batimento esperada é de 10 quilohertz. Esforce-se para obter uma senoide tão perfeita quanto possível, com não linearidade mínima.O próximo passo é incorporar um amplificador com detecção síncrona ao sistema. Para a microscopia de excitação saturada, o amplificador com detecção síncrona recebe entrada do fotodetector e do tubo fotomultiplicador. Desconecte a saída do fotodetector do osciloscópio e conecte-a à entrada de referência do amplificador.Conecte a saída do tubo fotomultiplicador ao amplificador com trava de fase como entrada do sinal. Envie a saída do amplificador para uma placa de aquisição de dados. Neste momento, monte a amostra na platina do microscópio.Utilize a mesma amostra com nanoesferas de ouro de 80 nanômetros em óleo seladas entre duas lâminas de vidro. Retorne ao amplificador com trava de fase enquanto realiza as medições. Configure o amplificador para exportar a magnitude absoluta do sinal de tensão.Neste caso, selecionando R no painel de exibição do canal 1. Altere a configuração do componente harmônico no canal de referência para obter as amplitudes máximas de excitação simples. Essas imagens coloridas são formadas usando um software personalizado para sincronizar e combinar os sinais do amplificador com bloqueio de fase e as tensões de acionamento dos motores galvanométricos.A imagem do microscópio eletrônico de varredura é para comparação. As imagens demonstram o aprimoramento da resolução com diferentes componentes harmônicos. O espectro medido de uma nanoesfera de ouro de 80 nanômetros está em vermelho.A curva sólida calculada utilizando a teoria de Mie mostra excelente concordância. A ressonância de plasmones de superfície localizados está em 580 nanômetros. As imagens de espalhamento, acima, e os perfis lineares, abaixo, apresentam características diferentes em função da intensidade de excitação.Em baixa intensidade, a função de espalhamento pontual é um perfil gaussiano padrão. Intensidades mais altas resultam no achatamento e alargamento da função, indicando saturação. Em valores mais elevados, a intensidade central não é a máxima, resultando em uma função de espalhamento pontual com formato de rosquinha.Eventualmente, a intensidade central torna-se novamente o pico durante a saturação reversa. Os pontos de dados azuis neste gráfico da intensidade central em diferentes intensidades de excitação revelam tanto o comportamento de saturação quanto o de saturação reversa. Os pontos de dados são ajustados a um polinômio de quinta ordem, representado em vermelho.Esses dados podem ser utilizados para extrair os componentes de frequência harmônica. Os componentes harmônicos também podem ser encontrados diretamente utilizando o amplificador com detecção por transposição de frequência. Este gráfico à esquerda corresponde a dados experimentais.O gráfico à direita é o resultado do cálculo utilizando o ajuste polinomial de 5ª ordem. Ambos os gráficos exibem quedas em intensidades específicas ao longo das curvas. Por exemplo, três quedas no segundo harmônico.Além disso, em cada gráfico, para cada ordem harmônica, a inclinação aumenta após o primeiro mínimo. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em menos de três horas, se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante verificar a qualidade da modulação senoidal, a linearidade do sistema de detecção e a estabilidade mecânica da amostra.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como alcançar o aumento de resolução com base na dispersão não linear proveniente de nanoestruturas plasmônicas. Esta técnica fornece uma amostra promissora para pesquisadores na área de microscopia de super-resolução explorarem novos contrastes em outras interações fundamentais entre luz e matéria.

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Research

JoVE Journal

Engineering

Engenharia

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