Utilização de Nanoestruturas Cristal plasmônicos e Fotônica para Manipulação de Micro-e Nanopartículas melhorada

O objetivo geral deste procedimento é aprisionar objetos biológicos de tamanho micrométrico utilizando pinças plasmônicas e de cristal fotônico. Isso é realizado primeiramente pela fabricação do substrato plasmônico ou do substrato de cristal fotônico. Em seguida, a amostra biológica é preparada adicionando BSA à solução celular e proporcionando espaçamento adequado para a solução celular abaixo da lamínula superior.

Em seguida, o laser é alinhado ao microscópio, que foi equipado com o esquema de filtros adequado. O microscópio é então focalizado na amostra e a captura é realizada. Por fim, partículas micro ou nanométricas podem ser aprisionadas com intensidade incidente reduzida com a ajuda de nanoestruturas plasmônicas ou de cristais fotônicos.

A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como pinças ópticas convencionais, é que a conversão dos campos ópticos por meio de nanoestruturas plasmônicas e de cristais fotônicos reduz a intensidade necessária para aprisionar partículas pequenas, como células, e também não exige um feixe fortemente focalizado, o que diminui o risco de dano fotônico celular devido à exposição à radiação. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais em diversas áreas biológicas, como a interação entre células e o estudo de várias forças na biologia. Pode também ser uma ferramenta útil na fabricação em micro e nanotecnologia, proporcionando manipulação precisa de micropartículas e nanopartículas. Para formar um arranjo de nanopartículas de ouro utilizando um evaporador por feixe de elétrons e cromo como camada de adesão, evapore ouro sobre uma lamínula de vidro até uma espessura de 20 nanômetros.

Limpe a amostra utilizando plasma de oxigênio por cerca de um minuto para remover impurezas orgânicas da superfície. Após induzir a autoorganização da monocamada de poliestireno, deixe cair ou espalhe o líquido sobre a amostra, incube por cerca de uma hora e, em seguida, use um grande volume de água para remover as esferas não adsorvidas e deixe secar ao ar. Finalmente, evapore uma segunda camada de ouro de 20 nanômetros sobre a monocamada de esferas de látex, formando uma matriz aleatória de nanopartículas de ouro.

A matriz de nanopartículas está agora pronta para a amostra biológica. Coloque a lâmina preparada com nanopartículas na platina de um microscópio fluorescente. O próximo passo é preparar núcleos de células de camundongo para o aprisionamento óptico.

Inicie com núcleos celulares de camundongo marcados com laranja de aine para evitar que os núcleos aderem ao substrato. Coloque os núcleos celulares em um frasco pequeno e adicione BSA a 10% em PBS numa concentração de um a 10 de BSA, misturando por vortex. Em seguida, pipete cinco microlitros da solução de núcleos com BSA sobre a lâmina preparada.

Para garantir espaçamento entre os núcleos e uma lamínula, coloque uma pilha de duas lamínulas espaçadoras ao redor da gota e, em seguida, posicione outra lamínula por cima. Para aprisionamento e imagem simultânea, utilize uma configuração personalizada de microscópio de fluorescência, incluindo um filtro de excitação desviado e dois divisores de feixe dicróicos personalizados. As pinças ópticas são construídas enviando um laser de hélio-neônio de 35 miliwatts através de um microscópio zes axio imager D one M, equipado com um conjunto de filtros GFP 17, modificado para permitir que a radiação laser de 633 nanômetros alcance a amostra.

O microscópio focalizará o feixe a laser na amostra, e então o feixe será difratado pelo substrato de nanopartículas plasmônicas ou pela grade de difração. Para imaginar os núcleos celulares, que possuem cerca de cinco mícrons de diâmetro, utilize um Zeiss LDEC epi plan com uma objetiva Neola 50x. Comece colocando a amostra sobre a objetiva e focalizando no plano com o maior número de núcleos, já que estão assentados na superfície do substrato.

Em seguida, foque o microscópio em um núcleo para aprisioná-lo, encontrando núcleos celulares livres flutuando acima das camadas de células na superfície. Então, posicione o ponto da armadilha a laser sobre a partícula. Nesse momento, ela deverá ser aprisionada e manter sua posição no ponto a laser, mesmo quando a platina for movida.

Os núcleos de camundongo que estão no plano focal do microscópio provavelmente irão deslocar-se devido a uma leve corrente microfluídica causada pelo aquecimento e evaporação da amostra, mas os núcleos na armadilha permanecerão em uma posição fixa. Esta figura mostra uma micrografia eletrônica de varredura de nanopartículas de ouro autoagregadas, cada uma com diâmetro de aproximadamente 450 nanômetros. Aqui está uma imagem de microscopia óptica de varredura em campo próximo do substrato plasmônico, onde a distribuição das nanopartículas é esparsa, mostrando a radiação em campo próximo.

O comprimento de onda do laser de excitação é de 633 nanômetros, sendo apresentado aqui um espectro de eficiência de espalhamento do substrato plasmônico com pico em 624 nanômetros. Um espectro de eficiência de absorção do substrato plasmônico mostra o pico em 668 nanômetros. Esferas nanométricas de ouro distribuídas aleatoriamente em um domínio bidimensional de um por um quadrado.

Os micrômetros são mostrados aqui. Cada círculo azul representa o centro da nanoesfera. Mostradas nestes painéis estão as distribuições do campo espalhado em planos de observação, que são paralelos ao arranjo aleatório de nanoesferas.

Esses gráficos mostram as intensidades mínimas de laser necessárias para manter o aprisionamento em função da taxa de fluxo do fluido circundante. Utilizando o aprisionamento plasmônico, todas as intensidades ópticas são medidas no plano da amostra sob o objetivo do microscópio. Cada painel mostra os resultados das medições para esferas únicas de poliestireno com diferentes diâmetros.

Os insets mostram as imagens microscópicas correspondentes das partículas. As barras de escala em todas as imagens representam cinco micrômetros de comprimento. Aqui é apresentado o coeficiente angular da reta ajustada que passa pela origem nos gráficos anteriores em função do tamanho da partícula.

Para o aprisionamento plasmônico. As barras de erro mostram os desvios padrão dos ajustes lineares. Os resultados indicam que partículas maiores requerem maior intensidade de laser para manter uma estabilidade de aprisionamento adequada.

Este esquema mostra o aprisionamento óptico aprimorado utilizando nanoestruturas periódicas unidimensionais. O feixe incidente é difratado pela nanoestrutura periódica no campo distante. É mostrada aqui a distribuição de intensidade da luz com duas polarizações ortogonais na superfície de uma grade de alumínio.

Com um período de 417 nanômetros obtido por meio de simulações no domínio do tempo com diferenças finitas, a distribuição é normalizada em relação à intensidade em uma superfície plana de alumínio. Essas figuras mostram o potencial de aprisionamento para partículas diretamente acima da superfície com gradiente versus a localização da partícula. Para a esfera de poliestireno CA de 350 nanômetros e a esfera de poliestireno DA de um micrômetro, os círculos brancos ilustram os tamanhos das partículas.

As inserções mostram o potencial de aprisionamento acima de uma superfície plana de alumínio. Para o mesmo tamanho de partícula, conforme comparações. Os valores são normalizados para cada tamanho de partícula.

Para todas as figuras de simulação FDTD, o campo de visão é de 10 por oito micrômetros quadrados. Aqui está a eficiência do aprisionamento e a intensidade mínima de aprisionamento medida para microesferas de poliestireno de vários tamanhos com a polarização do feixe perpendicular às linhas do gradiente. O gráfico inserido mostra a assimetria do aprisionamento na eficiência ao deslocar uma microesfera de poliestireno de 3,87 micrômetros, perpendicular e paralelamente às regras do gradiente.

Aqui está uma representação esquemática do ângulo translacional da partícula. Este detalhe mostra a ampliação em função da direção de translação para diferentes polarizações e tamanhos de partículas. A linha contínua com grande assimetria é obtida com luz incidente polarizada perpendicularmente ao gradiente e a linha tracejada.

Obtém-se uma pequena assimetria com luz incidente polarizada paralelamente ao gradiente. Estes painéis representam uma demonstração do aprisionamento de uma esfera de poliestireno fluorescente de 590 nanômetros. O círculo vermelho indica a posição do ponto laser, já que a luz laser era muito fraca para ser vista inicialmente.

A partícula é aprisionada dentro do ponto com maior potência. Ao reduzir a potência, o movimento browniano da partícula supera a força de aprisionamento, permitindo que a partícula escape. Aqui, um núcleo de célula fluorescente de câncer de ovário foi aprisionado; a intensidade mínima necessária para iniciar o aprisionamento foi de 16 micro watts por micrômetro quadrado, obtida utilizando uma objetiva de 20 x.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como criar uma armadilha óptica de baixa intensidade para a manipulação não invasiva de espécimes biológicos em escala micro e nanométrica utilizando substratos nanoestruturados de cristais fotônicos e plasmônicos.