Utilização de Nanoestruturas Cristal plasmônicos e Fotônica para Manipulação de Micro-e Nanopartículas melhorada

O objetivo geral deste procedimento é capturar objetos biológicos do tamanho de mícrons com pinças de cristal plasmônico e fotônico. Isso é feito fabricando primeiro o substrato plasmônico ou substrato de cristal fotônico. Em seguida, a amostra biológica é preparada adicionando BSA à solução celular e fornecendo espaçamento adequado para a solução celular abaixo da lamínula superior.

Em seguida, o laser é alinhado ao microscópio, que foi equipado com o esquema de filtro correto. O microscópio agora está focado na amostra e o aprisionamento é realizado. Finalmente, partículas de tamanho micro ou nanométrico podem ser capturadas com intensidade incidente reduzida com o auxílio de nanoestruturas de cristal plasmônico ou fotônico.

A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como pinças ópticas convencionais, é que a conversão dos campos ópticos por meio de nanoestruturas de cristal plasmônico e fotônico reduz a intensidade necessária para prender pequenas partículas como células, e também não requer um feixe bem focado, o que reduz o risco de danos fotográficos celulares por exposição à radiação. Este método pode ajudar a responder a questões-chave em muitos campos biológicos, como a interação célula a célula e o estudo de várias forças na biologia. Também pode ser uma ferramenta útil para fabricação em micro e nanotecnologia, fornecendo manipulação precisa de micro e nanopartículas Para formar uma matriz de nanopartículas de ouro usando um evaporador de feixe eletrônico e cromo como camada de adesão, evapora o ouro em uma lamínula de vidro com uma espessura de 20 nanômetros.

Limpe a amostra usando plasma de oxigênio por cerca de um minuto para remover as impurezas orgânicas da superfície. Depois de induzir a monocamada de poliestireno a se auto-montar, solte, lance o líquido sobre a amostra, incube-a por cerca de uma hora e, em seguida, use um grande volume de água para lavar as esferas não adsorvíveis ao ar. A monocamada finalmente evapora uma segunda camada de ouro de 20 nanômetros na esfera de látex, monocamada para formar uma matriz aleatória de nanopartículas de ouro.

A matriz de nanopartículas está agora pronta para a amostra biológica. Coloque a lâmina de nanopartículas preparada no palco de um microscópio fluorescente. O próximo passo é preparar os núcleos das células do camundongo para o aprisionamento óptico.

Comece com núcleos de células de camundongo marcados com aine laranja para evitar que os núcleos grudem no substrato. Coloque os núcleos das células em um pequeno frasco e adicione 10% de BSA em PBS a uma concentração de um a 10 BSA misturado por vórtice. Em seguida, pipeta cinco microlitros da solução de BSA dos núcleos na lâmina preparada.

Para fornecer espaçamento entre os núcleos e uma lamínula, coloque uma pilha de duas lamínulas espaçadoras ao redor da gota e, em seguida, coloque outra lamínula por cima. Para captura e imagem simultânea, use uma configuração de microscópio de fluorescência personalizada, incluindo um filtro de excitação desviado e dois divisores de feixe dicróico personalizados. As pinças ópticas são construídas enviando um laser de néon de hélio de 35 miliwatts através de um microscópio zes axio imager D one M, equipado com um conjunto de filtros GFP 17, que é modificado para permitir que a radiação laser de 633 nanômetros atinja a amostra.

O microscópio focalizará o feixe de laser na amostra e, em seguida, o feixe será difratado pelo substrato de nanopartículas plasmônicas ou pela gradação de difração. Para obter imagens dos núcleos das células, que têm cerca de cinco mícrons de diâmetro, use um plano epi Zeiss LDEC com uma objetiva Neola 50 x. Comece colocando a amostra na objetiva e focando no plano com mais núcleos, pois eles estão na superfície do substrato.

Em seguida, concentre o microscópio em um núcleo para prender, encontrando núcleos de células flutuantes acima das camadas de células na superfície. Em seguida, posicione o ponto da armadilha de laser sobre a partícula. Neste ponto, ele deve ser preso e deve manter sua posição no ponto do laser mesmo quando o palco é movido.

Os núcleos do camundongo que estão no plano focal do microscópio provavelmente estarão à deriva com uma leve corrente microfluídica causada pelo aquecimento e evaporação da amostra, mas os núcleos na armadilha permanecerão em uma posição. Esta figura mostra uma micrografia eletrônica de varredura de nanopartículas de ouro automontadas, cada uma com um diâmetro de aproximadamente 450 nanômetros. Aqui está uma imagem de microscopia óptica de varredura de campo próximo do substrato plasmônico onde a distribuição de nanopartículas é esparsa, mostrando a radiação de campo próximo.

O comprimento de onda do laser de excitação é de 633 nanômetros, um espectro de eficiência de espalhamento do substrato plasmônico mostrando o pico em 624 nanômetros é mostrado aqui. Um espectro de eficiência de absorção do substrato plasmônico mostra o pico em 668 nanômetros. Nanoesferas de ouro distribuídas aleatoriamente em um domínio 2D de um por um quadrado.

Micrômetro são mostrados aqui. Cada círculo azul representa o centro da nanoesfera. Mostradas nesses painéis estão distribuições de campo de espalhamento em planos de observação, que são paralelos à matriz de nanoesferas aleatórias.

Esses gráficos mostram as intensidades mínimas de laser para manter o purgador em função da vazão do fluido circundante. Utilizando aprisionamento plasmônico, todas as intensidades ópticas são medidas no plano da amostra sob a objetiva do microscópio. Cada painel mostra os resultados da medição para grânulos de poliestireno simples com diâmetros diferentes.

As inserções mostram as imagens microscópicas correspondentes das partículas. As barras de escala em todas as imagens representam cinco micrômetros de comprimento. Aqui está a inclinação da linha ajustada através da origem nos gráficos anteriores versus o tamanho da partícula.

Para armadilhas plasmônicas. As barras de erro mostram os desvios padrão dos ajustes lineares. Os resultados mostram que partículas maiores requerem maior intensidade de laser para manter a estabilidade de aprisionamento adequada.

Este esquema mostra o aprisionamento óptico aprimorado utilizando nanoestruturas periódicas 1D. O feixe incidente é defractado pela nanoestrutura periódica no campo distante. Aqui é mostrada a distribuição de intensidade da luz com duas polarizações ortogonais na superfície de uma classificação de alumínio.

Com um período de 417 nanômetros obtido usando simulações de domínio de tempo de diferenças finitas, a distribuição é normalizada para a intensidade em uma superfície plana de alumínio. Essas figuras mostram o potencial de aprisionamento de partículas diretamente acima da superfície de classificação versus a localização da partícula. Para o grânulo de poliestireno CA de 350 nanômetros e o cordão de poliestireno DA de um micrômetro, os círculos brancos ilustram os tamanhos das partículas.

As inserções mostram o potencial de aprisionamento acima de uma superfície plana de alumínio. Para o mesmo tamanho de partícula das comparações. Os valores são normalizados para cada tamanho de partícula.

Para todas as figuras de simulação FDTD, o campo de visão é de 10 por oito micrômetros quadrados. Aqui está a eficiência do purgador e a intensidade mínima de aprisionamento medidas para grânulos de poliestireno de vários tamanhos com a polarização do feixe perpendicular às linhas de nivelamento. A inserção mostra a assimetria do trapping na eficiência de aprisionamento para traduzir um cordão de poliestireno de 3,87 micrômetros, perpendicular e paralelo às regras da classificação.

Aqui está uma representação esquemática do ângulo de translação da partícula. Esta inserção mostra o aprimoramento versus a direção de translação para diferentes polarizações e tamanhos de partículas. A grande assimetria da linha sólida é obtida com a luz incidente polarizada perpendicularmente ao nivelamento e à linha tracejada.

Obtém-se uma pequena assimetria com a luz incidente polarizada paralelamente à classificação. Esses painéis representam uma demonstração de aprisionamento de um grânulo de poliestireno fluorescente de 590 nanômetros. O círculo vermelho indica a posição do ponto de laser, pois a luz do laser era muito fraca para ser vista no início.

A partícula fica presa dentro do ponto em maior potência. À medida que a potência é reduzida, o movimento browniano da partícula supera a força de aprisionamento, permitindo que a partícula escape. Aqui, um núcleo de célula de câncer de ovário fluorescente preso a intensidade mínima necessária para iniciar o aprisionamento foi de 16 microwatts por micrômetro quadrado obtido usando uma lente objetiva de 20 x.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como criar uma armadilha óptica de baixa intensidade para a manipulação não invasiva de espécimes biológicos de tamanho micro e nano usando substratos nanoestruturados de cristal plasmônico e fotônico.