Name: A Assembleia e Aplicação de tesoura Anéis: A endotelial novo modelo de Orbital, unidirecional e periódica fluxo de fluido e tensão de cisalhamento (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Aprenda a montar anéis de cisalhamento para estudar células endoteliais sob fluxo periódico e tensão de cisalhamento. Este método simples e econômico permite avaliar respostas celulares em áreas amplas.

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Os autores gostariam de agradecer a assistência do Sr. Christopher Nguyen, Aaron Hunter eo Shreveport Jumpstart, inteligente e programas de treinamento biostart, bem como o departamento de Centenary College of Louisiana de Biofísica, Shreveport, LA.

1. Construção de 150 mm de diâmetro de cisalhamento anéis (Figura 1) NOTA: Os anéis de corte pode ser construído de modo a criar muitas dimensões diferentes, variando as dimensões exteriores e interiores do prato de Petri, resultando em dispositivos com diferentes áreas de superfície total, o rendimento de células e desenvolvido gamas de forças de cisalhamento. Este relatório descreve um prato de 150 milímetros combinado com um prato de 100 milímetros interior para uma área de superfície total de 98 cm2 (Figura 2). <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54632/54632fig1.jpg" /> Figura 1. conjunto do anel de cisalhamento. A porção de topo da figura mostra um anel de corte parcialmente montado. Injectar 0,5 mL de cloreto de metileno através do furo 3 de passagem mm, com uma pipeta de transferência se uma vedação hermética não tem completamente formado entre os pratos interiores e exteriores. O anel de corte é selado pela aplicação de um 1 milímetro de espessura cordão de adesivo de borracha de silicone em torno da ca internae do anel superior cisalhamento. A parte inferior da figura mostra o anel de corte montado. O azul representa a área de células endoteliais banhados. As setas vermelhas externas e internas indicam o movimento orbital do anel de corte e meios de comunicação no interior do anel de cisalhamento quando colocado em um agitador orbital. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54632/54632fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54632/54632fig2.jpg" /> Figura 2. medições de superfície para um anel de corte 150 mm (não desenhada à escala). O painel superior mostra mudança centrífuga de líquido em direcção anel externo em resposta à rotação orbital. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54632/54632fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <ol><li> Criar um modelo de construção de anel de corte, gerando um150 milímetros perfil de aresta exterior em software de apresentação com um diâmetro interno de 100 mm, colocada no centro do círculo de 150 mM. Imprimir o modelo em uma folha de papel A4 branco. </li><li> Pipetar 10 ml de cloreto de metileno (diclorometano) para uma placa de Petri de vidro de 150 milímetros. É fundamental que o prato de vidro e não é de poliestireno (ou de outro plástico de vinilo), como o cloreto de metileno solubiliza a maioria dos plásticos e é utilizado aqui para se juntar peças de plástico. CUIDADO: Use luvas para toda a construção com ventilação capô adequada. cloreto de metileno é um irritante de contato e é hepatotóxico. </li><li> Alinhar de 150 mm plástico de Petri para o modelo de anel de corte exterior. </li><li> Perfurar um furo de 3 mm no centro de uma placa de 100 mm utilizando uma ferramenta rotativa. Remover quaisquer aparas de plástico produzidos a partir da perfuração. </li><li> Enquanto segura com uma mão enluvada, inverter e mergulhar a borda superior da placa de Petri de 100 mm de o passo anterior para dentro da piscina de cloreto de metileno durante cerca de 3 segundos. </li><li> transfer o &quot;humedecido&quot; 100 milímetros prato de borda para baixo no centro de um prato de 150 mm, alinhando cuidadosamente a placa de 100 mm sobre o molde marcado. O cloreto de metileno irá fundir o plástico, juntando-se os 100 mm e 150 mm pratos. Suavemente girar a placa de 100 mm e anti-horário algumas vezes para garantir uma boa aderência ao prato 150 milímetros. NOTA: Tome muito cuidado para garantir o alinhamento correcto do prato interior para o centro do prato exterior. alinhamento excêntrico pode resultar em variações da tensão de corte em locais diferentes no anel de corte. Ter o cuidado de não permitir que o cloreto de metileno a escorrer acidentalmente para a porção de pista exterior da placa de Petri de 150 milímetros durante a colocação da placa de 100 mm. Isto irá fundir o plástico na superfície inferior onde as células serão em crescimento, criando uma superfície irregular que pode causar perturbações de fluxo. </li><li> Uma vez que o cloreto de metileno secou, ​​virar as placas de Petri recém-vinculado ao longo e inspeccionar cuidadosamente os pontos de contato para garantir queuma vedação estanque foi formado entre as duas placas de Petri. </li><li> Se uma vedação hermética não tem completamente formado, injectar 0,5 ml de cloreto de metileno através do furo 3 de passagem mm, com uma pipeta de transferência. Pegar o prato e gentilmente gire-a para permitir que o cloreto de metileno para alcançar a borda. NOTA: Se rodado demasiado rapidamente, o cloreto de metileno pode derramar para dentro da parte exterior do prato de 150 mm, a deformação da superfície onde as células irão crescer e estragando o anel de corte. Vazamento de anéis de corte deve ser descartada. </li><li> Vedar o furo na placa de 100 mm x aplicando um cordão de 3 milímetros de vedante de borracha de silicone. </li><li> Usando uma ferramenta rotativa equipada com uma cabeça de corte plana, corte a parte superior 3 cm de um tubo de cultura de tecidos de poliestireno de 15 ml cônico, deixando pelo menos 1 cm do tubo abaixo do limite. Polir a ponta do tubo cortado até ficar lisa e plana com o lado plano da cabeça de corte. Remover quaisquer aparas de plástico produzidos por trituração. </li><li> Traçar as cortadas tubo de 15 ml para atampa da placa de 150 mm, com um marcador, aproximadamente 0,5 cm de distância da borda do prato. Perfurar um orifício no interior do círculo desenhado, deixando uma margem de aproximadamente 1-2 mm a partir da margem do círculo. </li><li> Coloque o ponto de corte superior tubo cônico sobre o furo perfurado. Usando uma pipeta de transferência, aplicar cerca de 250 ul de cloreto de metileno para as extremidades cortadas do tubo cónica para ligar o tubo cónico com a tampa 150 milímetros. </li><li> Selar a tampa 150 milímetros para o prato de 150 milímetros por aplicação de um cordão de um milímetro de espessura de vedante de borracha de silicone em torno da borda interior da parte superior uma placa de Petri. </li></ol> 2. Esterilização de cisalhamento Anéis <ol><li> Pipetar cerca de 10 ml de solução salina tamponada com fosfato para o anel de corte recém-formada através da porta 15 ml tubo cónico. Giram em torno de remover todos os detritos no interior do anel de cisalhamento. Remover a solução salina tamponada com fosfato com uma pipeta de Pasteur aspirador / vácuo. </li><li> Repita o passo anterior até detritos é removido. </li><li> para Sterilize o anel de corte, utilizar uma combinação de uma lavagem com etanol a 70% com irradiação UV. <ol><li> Desapertar a tampa ventilada, pipeta cerca de 10 ml de etanol a 70% através da porta de acesso e aparafusar a tampa. Rodar e virar sobre o anel de cisalhamento várias vezes, assegurar que o interior do anel de corte é cuidadosamente lavado. </li><li> Sob um exaustor, aspirar o excesso de etanol a 70%. Com um frasco de spray, spray completamente o orifício da tampa e acesso com 70% de etanol. </li><li> Coloque o anel de cisalhamento e cap sob radiação UV na capa de cultura de tecido até que esteja completamente seco. </li></ol></li><li> Depois de seco, o parafuso novamente a tampa e armazenar esterilizado anéis de cisalhamento à temperatura ambiente até ser usado no chapeamento de cultura de células. </li></ol> 3. Estudos tensão de cisalhamento <ol><li> Placa células endoteliais em anéis de cisalhamento esterilizado seguindo o protocolo padrão de cultura de células, tipicamente utilizando uma proporção de 1: 4 dividido por linhas de células endoteliais transformadas. NOTA: Rat microV retinalcélulas endoteliais ascular foram obtidos comercialmente. células células endoteliais do cérebro humano (hCMEC / D3) foram fornecidos como uma generosa oferta do Dr. Pierre-Oliver Couraud (Inserm, França) e foram cultivados em meio basal endotelial completo (EBM). </li><li> Permitir culturas para atingir confluência antes do início dos estudos de fluxo. Utilizar 30 ml de meio de cultura de tecidos (soro de vitelo fetal a 10%, meio de Eagle modificado por Dulbecco com 1% de penicilina / estreptomicina / anfotericina). Mudança do meio de cultura de células a cada 3 dias e manter as células a 37 ° C com 7,5% de CO2 e 92,5% de ar ambiente. </li><li> Coloque o agitador orbital na incubadora. Nota: agitadores orbitais são tipicamente pesada (&gt; 10 kg). Coloque o agitador orbital na prateleira inferior da incubadora para minimizar o stress prateleira e vibração. </li><li> Coloque os anéis de cisalhamento experimentais no agitador orbital. Coloque anéis grupo controle de cisalhamento estático dentro da mesma incubadora. </li><li> Estimar a tensão máxima de cisalhamento dentro do shbrinco com a equação <img alt="equação 1" src="/files/ftp_upload/54632/54632eq1.jpg" /> Onde <img alt="equação 2" src="/files/ftp_upload/54632/54632eq2.jpg" /> é o raio de rotação do agitador orbital (em cm), <img alt="equação 3" src="/files/ftp_upload/54632/54632eq3.jpg" /> é a viscosidade do meio (em poise), <img alt="equação 4" src="/files/ftp_upload/54632/54632eq4.jpg" /> é a densidade do meio (em g / ml), e <img alt="equação 5" src="/files/ftp_upload/54632/54632eq5.jpg" /> é a frequência de rotação (em rotação / seg) 24. </li><li> Inicia-se a configuração de rotação sobre o agitador orbital à rpm desejado (por exemplo, 90 rpm), deixando os anéis de cisalhamento no agitador durante a duração desejada de aplicação de esforço de cisalhamento (por exemplo, 72 horas). NOTA: agitadores orbitais pode produzir calor, de modo que a temperatura da incubadora deve ser monitorizado inicialmente para garantir que 37 ° C é mantida durante toda a duração da experiência. Alternativamente, sanéis HEAR pode ser transferido para as câmaras ambientais (por exemplo, câmara incubador modular) e depois colocadas dentro de uma incubadora rotativa. </li><li> Depois de as camadas de células foram expostas a resistência de corte durante o período de tempo desejado, remover anéis de cisalhamento da incubadora. Retire a tampa anel de cisalhamento e recuperar as células e / ou meios para examinar ponto final desejado análises (por exemplo, Western blot, fluorescência activado separação de células, etc.) 25. </li></ol>

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J. Winny Yun tem uma bolsa de investigação desde a fundação Annette Funicello. J. Steven Alexander tem suporte pesquisa do Departamento de Neurologia, LSUHSC-S.

A construção do sistema de anel de corte durante a exposição das células endoteliais de cisalhamento é uma abordagem simples para realizar estudos de tensão de cisalhamento. No entanto, existem alguns passos que são críticos para a obtenção de anéis de cisalhamento superiores e melhores resultados. A vedação completa deve ser feita entre o anel interno e externo para evitar que materiais de vazamento que poderia criar tensão de cisalhamento inconsistente entre as amostras. Se a vedação não é feita, uma quantidade mínima...

Tensão de cisalhamento de fluidos tem sido mostrado para modular os programas de genes endoteliais 1-5 através da activação de elementos cis-reguladores 6, a actividade de acetiltransferase de histona 7 e elementos de resposta a tensão de cisalhamento (8) SSRE. Cisalhamento influências de stress contribuições endoteliais no sentido de coagulação através da modulação do factor de tecido 9 e activador do plasminogénio tecidular (tPA) 10 expressão. A tensão de cisalhamento também influencia o controle da angiogênese 11 e remodelação dos navios por regulação da síntese e capacidade de resposta 8 PDGF-B. O endoteliais derivado mediadores vasoativos adrenomedullin, a endotelina-1, urotensina II e relaxina são também regulados por cisalhamento 12. Transcrição da produção de óxido nítrico sintase endotelial e produção de óxido nítrico são ambos cisalhamento dependente 10. Cisalhamento endotelial também controla a expressão de ICAM-1 13. tensão de cisalhamento induzidas pelo fluxo pode, por conseguinte, Powerfuinfluenciar lly uma grande variedade de respostas endoteliais. Importante, pulsações vasculares agora também parecem desempenhar papéis importantes na patofisiologia de ambas envelhecimento vascular normal e formas de demência vascular 14 e pode ainda contribuir para outras doenças neurodegenerativas, tais como esclerose múltipla 15. Venosa e células endoteliais arteriais são inerentemente expostos a diversos padrões de fluxo hemodinâmicos in vivo, e diversos fenótipos de células endoteliais diferentes pode ser exibido 16. Dependendo da magnitude e a periodicidade do escoamento, efeitos sobre as células endoteliais podem incluir a activação de células inflamatórias e de apoptose, que podem reflectir alterações no gene ou proteína de expressão 17,18. Estudos sobre as respostas das células endoteliais para tosquiar fenômenos, portanto, permanecem complicado pelas dificuldades na produção de modelos in vitro que produzem adequadamente tais padrões de cisalhamento. Muitos experime diferentental protocolos foram desenvolvidos para aplicar a tensão de cisalhamento de fluidos para monocamadas endoteliais celulares. Um dos sistemas mais utilizados é a câmara de fluxo de placas paralelas, que cria o fluxo laminar uniforme dentro da câmara de 19-21. A bomba peristáltica está normalmente ligado para criar fluxo periódico, que pode recapitular características de fluxo tipicamente encontrados em muitos locais in vivo 22. Outra configuração comum utiliza o modelo de &quot;cone e o prato &#39;, onde a tensão de cisalhamento de fluidos é determinada pela velocidade de rotação do cone 23. Ambos os sistemas, e outros acordos semelhantes a eles, pode ser tedioso para configurar e requerem componentes que podem ser relativamente caros e inacessíveis para muitos laboratórios. Outra limitação importante destes modelos actuais é o número relativamente baixo de estudos em duplicado que podem ser executadas simultaneamente, cada um com uma área superficial relativamente baixa. Isso aumenta o tempo e co<html> mplexity de tais abordagens. Portanto, um modelo ideal que induz ao cisalhamento unidirecional e periódica pode ser aquele em que um elevado número de repetições do estudo pode ser facilmente configurado, cada um com uma área de superfície relativamente grande. Além disso, os modelos acima mencionados exigem uma configuração bastante sofisticados, que pode ser de custo proibitivo para muitos utilizadores. Um modelo que pode produzir distúrbios de cisalhamento de fluidos usando materiais básicos de laboratório pode ter várias vantagens. Um método simples e altamente econômica de aplicar unidirecional, tensão de cisalhamento periódica envolve a colocação de pratos circulares num agitador orbital 24. Este protocolo é muito simples e pode ser escalada até atingir números elevados de estudo repetições, cada um com uma área de superfície relativamente grande, conforme necessário. No entanto, as células situadas no centro do prato são expostos a diferentes padrões de fluxo de células ao longo da periferia, dando origem a respostas celulares fenotípicas misturados no mesmo prato. _content &quot;&gt; Neste relatório, nós descrevemos a construção e utilização de&quot; anéis de corte &#39;, o nosso modelo para a criação de tensão de cisalhamento unidirecional e periódica. O projeto para o anel de corte efetivamente fenótipos induzida por cisalhamento celulares &quot;mistos&quot; limites restringindo o fluxo caminho dentro de uma placa de cultura de circular para a periferia por meio da colocação de um anel interno. a construção e o funcionamento do anel de cisalhamento é simples e económico e pode ser facilmente dimensionada para acomodar uma grande variedade de agitadores orbitais usando fontes de cultura de tecidos amplamente disponíveis. Este modelo pode ser aplicado em experiências com células endoteliais para proporcionar padrões de fluxo unidireccional e periódicas dentro dos níveis fisiológicos e patofisiológicos.

<table><tbody><tr><td>Placa de cultura de tecidos de plástico de 100 x 20 mm</td><td>Corning</td><td>430167</td><td>Os pratos devem ser de poliestireno</td></tr><tr><td>Placa de cultura de tecidos de plástico de 150 x 25 mm</td><td>Corning</td><td>430599</td><td>Os pratos devem ser de poliestireno</td></tr><tr><td>Placa de Petri de vidro de 150 mm</td><td>Fisher</td><td>3160150BO</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de plástico de cultura de tecidos de poliestireno de 15 ml Falcon</td><td></td><td>352099</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de metileno</td><td>Selante de borracha de silicone Sigma-Aldrich</td><td>D65100</td><td></td></tr><tr><td></td><td>DAP</td><td>7079808641</td><td></td></tr><tr><td>etanol</td><td>Decon</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de transferência de 3 ml</td><td>Becton-Dickinson</td><td>357524</td><td></td></tr><tr><td>impressora papel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>tesoura</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>luvas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ferramenta rotativa e conjunto</td><td>Dremel</td><td>4000-6/50</td><td></td></tr><tr><td>cabeça de corte de ferramenta rotativa</td><td>Dremel</td><td>EZ476</td><td></td></tr><tr><td>ferramenta rotativa cabeça</td><td></td><td></td><td></td>de broca</tr><tr><td>agitador orbital de água</td><td></td><td></td><td></td>destilada</tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>57018-754</td><td></td></tr><tr><td>incubadora</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Células endoteliais microvasculares da retina de rato</td><td>Biológicos Celulares</td><td>RA-6065</td><td></td></tr></tbody></table>

a assembleia e aplicação de &#39;tesoura anéis&#39;: a endotelial novo modelo de orbital, unidirecional e periódica fluxo de fluido e tensão de cisalhamento

The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

Os desvios em relação aos níveis normais e padrões de vasculares jogo cisalhamento papéis fluidos importantes na fisiologia vascular e fisiopatologia induzindo adaptativa, bem como alterações patológicas no fenótipo endotelial e expressão gênica. Em particular, os efeitos inadaptado de periódico, o fluxo unidireccional shear stress induzido pode desencadear uma variedade de efeitos sobre vários tipos de células vasculares, em particular as células endoteliais. Embora até agora as células endoteliais de diversas origens anatômicas têm sido cultivadas, análises em profundidade das suas respostas ao cisalhamento de fluidos têm sido dificultados pela relativa complexidade dos modelos de cisalhamento (por exemplo, câmara de fluxo de placas paralelas, cone e modelo de fluxo de placa). Enquanto todos estes representam excelentes abordagens, tais modelos são tecnicamente complicado e sofre de desvantagens, incluindo o tempo de configuração relativamente longo e complexo, áreas de superfície de baixo, os requisitos para bombas e pressurização muitas vezes necessitando de selantes e vedações, criando desafios para both manutenção de esterilidade e uma incapacidade de executar várias experiências. No entanto, se os modelos de taxa de transferência mais elevados de fluxo de cisalhamento e foram disponíveis, um maior progresso na cisalhamento respostas endoteliais vasculares, a pesquisa de cisalhamento particularmente periódica, a nível molecular, podem ser mais rapidamente avançada. Aqui, descrevemos a construção e utilização de anéis de corte: um romance, simples de montar, e modelo de cultura de tecido barato, com uma área de superfície relativamente grande, que facilmente permite um alto número de repetições experimentais em unidirecionais, cisalhamento periódica estudos de estresse sobre células endoteliais.

Aqui nós apresentamos resultados representativos, tanto das células endoteliais do cérebro hCMEC / D3 e do rato monocamadas de células endoteliais microvasculares da retina, cultivadas em anéis de cisalhamento. Depois de se deixar hCMEC / D3 monocamadas de células endoteliais do cérebro a crescer até à confluência em EBM completo, os anéis de cisalhamento foram colocadas num agitador orbital durante 72 horas. Usando a equação ...

Sabe-se que diferentes níveis e padrões de cisalhamento de fluidos modulam a expressão gênica endotelial, o fenótipo e a suscetibilidade a doenças. Discutimos a montagem e o uso de 'anéis de cisalhamento': um modelo que produz padrões de tensão de cisalhamento unidirecionais e periódicos. Os anéis de cisalhamento são simples de montar, econômicos e podem produzir altos rendimentos celulares.

A Assembleia e Aplicação de &#39;tesoura Anéis&#39;: A endotelial novo modelo de Orbital, unidirecional e periódica fluxo de fluido e tensão de cisalhamento

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as ...

O objetivo geral deste modelo é criar um método simples e econômico para estudos de fluxo periódico de fluido in vitro e tensão de cisalhamento em células endoteliais. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da Fisiologia da Célula Endotelial, como, por exemplo, como o cisalhamento periódico afeta a forma, a estrutura e o funcionamento das células endoteliais.A principal vantagem desta técnica é que ela utiliza um dispositivo de cultura tecidual montado de forma simples, que fornece áreas superficiais relativamente grandes para a avaliação das respostas celulares. Demonstrará este procedimento o Sr. Luke White, um estudante de medicina no meu laboratório. Inicie este procedimento utilizando um software de apresentação para criar um modelo de construção de anel de cisalhamento com um perfil de borda externa de 150 milímetros e um diâmetro interno de 100 milímetros posicionado no centro do círculo de 150 milímetros.Imprima o modelo em uma folha de papel branco A4. Trabalhando sob uma cabine de exaustão com ventilação adequada e usando luvas, pipete 10 milímetros de cloreto de metileno em uma placa de Petri de vidro de 150 milímetros. É fundamental que a placa seja de vidro, pois o cloreto de metileno solubiliza a maioria dos plásticos.Alinhe uma placa de Petri de 150 milímetros de plástico com o molde externo de cisalhamento. Use uma ferramenta rotativa para fazer um furo de 3 milímetros no centro de uma placa de 100 milímetros. Remova todas as aparas de plástico geradas pela perfuração.Mantendo o recipiente de Petri de 100 milímetros com a mão enluvada, inverta-o e mergulhe a borda superior do recipiente na poça de cloreto de metileno por aproximadamente três segundos. Deixe o excesso de cloreto de metileno escorrer do recipiente de 100 milímetros e, em seguida, transfira rapidamente o recipiente úmido com a borda voltada para baixo para o centro do recipiente de 150 milímetros. Alinhe cuidadosamente o recipiente de 100 milímetros sobre o molde marcado.Gire suavemente a placa de 100 milímetros no sentido horário e anti-horário algumas vezes para garantir uma boa aderência à placa de 150 milímetros. Uma vez que o cloreto de metileno tenha secado, vire as placas de Petri recém-unidas e inspecione cuidadosamente os pontos de contato. Se um selo hermético não tiver se formado completamente, injete 0,5 mililitros de cloreto de metileno através do orifício de 3 milímetros com uma pipeta de transferência.Levante o recipiente e gire-o suavemente para permitir que o cloreto de metileno alcance a borda. Após garantir que foi formado um selo hermético entre os dois recipientes de Petri, feche o orifício no recipiente de 100 milímetros aplicando um filete de 3 milímetros de vedante de borracha de silicone. Usando uma ferramenta rotativa equipada com uma lâmina de corte plana, corte a porção superior de 3 centímetros de um tubo de cultura de tecidos de poliestireno cônico de 15 milímetros, deixando pelo menos um centímetro do tubo abaixo da tampa.Use o lado plano da cabeça de corte para polir a borda do tubo cortado até que fique lisa e plana. Remova todas as rebarbas de plástico produzidas pelo desbaste. Com uma caneta, trace o contorno do tubo cônico de 15 mililitros cortado na tampa da placa de 150 milímetros, aproximadamente a 0,5 centímetros da borda da placa.Faça um furo dentro do círculo desenhado, deixando uma margem de aproximadamente um a dois milímetros da borda do círculo. Coloque a parte superior do tubo cônico cortada sobre o furo perfurado. Usando uma pipeta de transferência, adicione aproximadamente um quarto de mililitro, ou 250 microlitros de cloreto de metileno nas bordas cortadas do tubo cônico para fixar o tubo cônico na tampa de 150 milímetros.Finalmente, feche a tampa de 150 milímetros sobre a placa de 150 milímetros aplicando um filete de vedação de borracha de silicone com cerca de um milímetro de espessura ao longo da borda interna da placa de Petri superior. É apresentado um esquema de um anel de vedação montado. A cor azul representa a área de células endoteliais cultivadas.As setas vermelhas externa e interna indicam o movimento orbital do anel de cisalhamento e do meio no interior do anel de cisalhamento quando colocado em um agitador orbital. Prepare para a esterilização pipetando aproximadamente 10 milímetros de PBS no anel de cisalhamento recém-formado, através da porta do tubo cônico de 15 mililitros. Agite suavemente para remover qualquer resíduo no interior do anel de cisalhamento.Remova o PBS com uma pipeta de Pasteur e um aspirador a vácuo. Repita a lavagem com PBS até que todos os detritos sejam removidos. Para esterilizar o anel de cisalhamento, será utilizada uma combinação de enxágue com etanol a 70% e irradiação com UV.Desrosqueie a tampa ventilada, pipete aproximadamente 10 mililitros de etanol 70% através da porta de acesso e rosqueie novamente a tampa. Gire e vire várias vezes o anel de vedação, garantindo que o interior do anel seja completamente lavado. Sob uma cabine de cultura de tecidos, aspire o excesso de etanol 70%.Com um frasco pulverizador, pulverize completamente a porta de acesso e a tampa com etanol 70%. Em seguida, coloque o anel de cisalhamento e a tampa sob radiação UV na capela de cultura de tecidos até ficarem completamente secos. Uma vez que o anel de cisalhamento esteja seco, rosqueie a tampa novamente.Armazene os anéis de cisalhamento esterilizados em temperatura ambiente até que sejam utilizados no plaqueamento de culturas celulares. Para preparar um estudo de tensão de cisalhamento, plaque primeiro as células endoteliais nos anéis de cisalhamento esterilizados, seguindo o protocolo padrão de cultura celular. Deixe a cultura atingir confluência antes do início dos estudos de fluxo.Quando as células atingirem confluência, coloque os anéis experimentais de cisalhamento em um agitador orbital posicionado na prateleira inferior do incubador para minimizar o estresse e a vibração da prateleira. Coloque os anéis de cisalhamento do grupo controle estático dentro do mesmo incubador. Deixe os anéis de cisalhamento no agitador pelo tempo desejado de aplicação do estresse de cisalhamento.Após as camadas celulares terem sido expostas ao cisalhamento pelo tempo desejado, remova os anéis de cisalhamento do incubador. Retire a tampa do anel de cisalhamento e colete as células e/ou o meio para a análise final desejada. Observe que, após abrir os anéis de cisalhamento, os pesquisadores podem colher células e meio para análise utilizando diversos métodos.Apresentam-se resultados representativos da aparência de monocamadas de células endoteliais cerebrais humanas CMEC D3 em anéis de cisalhamento após 48 horas de exposição a cisalhamento periódico de fluido ou condição estática; observou-se que o alinhamento do cultivo nem sempre é paralelo à direção do fluxo indicada pelas setas. Alguns exemplos de resposta ao cisalhamento periódico são mostrados em monocamadas de células endoteliais microvasculares retinianas de rato. Após 72 horas de cisalhamento periódico de fluido em anéis de cisalhamento, observou-se uma redução significativa na molécula de adesão de plaquetas e células endoteliais em relação ao controle de carga Beta-actina.Uma vez dominado, é possível construir vários anéis de cisalhamento em cerca de três horas, se o procedimento for realizado corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de alinhar cuidadosamente o prato interno com o prato externo, garantindo que um selo hermético se forme entre eles. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como construir e utilizar anéis de cisalhamento como um método simples para realizar estudos in vitro de fluxo periódico de fluidos e tensões de cisalhamento em células endoteliais. Não se esqueça de que trabalhar com cloreto de metileno pode ser perigoso e que precauções, como trabalhar sob uma cabine de exaustão, devem sempre ser tomadas durante as etapas que o exigem.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Estamos descrevendo um método para submeter células aderentes a tensão de cisalhamento do fluxo laminar em um circuito de fluxo contínuo estéril. Adesão das células, a morfologia pode ser estudada através da câmara transparente, amostras obtidas do circuito para análise de metabólitos e células colhidos após a exposição de cisalhamento para futuros experimentos ou cultura.

Câmara de placas paralelas de fluxo e Circuito de fluxo contínuo para avaliar células progenitoras endoteliais sob estresse de cisalhamento Fluxo Laminar

Este artigo descreve um método versátil para criar anéis de células derivadas do tecido celular por auto-montagem. Células musculares lisas semeadas em forma de anel-agarose agregado poços e contrato de forma robusta em três dimensões (3D) tecidos dentro de 7 dias. Anéis milímetro escala de tecido são conducentes a testes mecânicos e servem como blocos de construção para a montagem dos tecidos.

Dirigido Cellular Automontagem para Fabricar Anéis Cell-Derived Tecido para Análise Biomecânica e Engenharia de Tecidos

Uma plataforma de microcanais-on-a-chip foi desenvolvido pela combinação da técnica fotolitográfica refluído fotossensível, litografia macia, e microfluidos. A plataforma de microcanais reendotelizados imita a geometria tridimensional (3D) de microvasos in vivo, é executado sob fluxo de perfusão contínua controlada, permite a imagem de alta qualidade e em tempo real, e pode ser aplicado para a pesquisa microvascular.

Procedimento para o Desenvolvimento da Multi-profundidade Circular transversal reendotelizados microcanais-on-a-chip

Este manuscrito apresenta um método de moldagem por injeção para engenheiro microvasos que recapitulam propriedades fisiológicas de endotélio. O processo baseado em microfluídico cria redes vasculares 3D patente com condições tailorable, tais como fluxo, composição celular, geometria e gradientes bioquímicos. O processo de fabricação e exemplos de aplicações potenciais são descritos.

Micropatterning e Montagem de microvasos 3D

Aqui, um fluxo de trabalho para a análise de expressão de gene e cultura de células endoteliais sob tensão de cisalhamento fluido é apresentado. Incluído é um arranjo físico para habitação e monitoramento de múltiplas câmaras de fluxo em um ambiente controlado e o uso de um referência exógena do RNA por PCR quantitativo simultaneamente.

Análise de expressão genética das células endoteliais expostos para Shear Stress usando múltiplas câmaras de fluxo paralelo-placa

O objetivo deste protocolo é descrever uma câmara de fluxo de placa paralela modificada para uso na investigação da ativação em tempo real de canais de íons mecanosensíveis por tensão de cisalhamento.

Gravações electrofisiológicas de correntes do íon da único-pilha o esforço de tesoura bem definido

Este protocolo descreve um método de revestimento para restringir o crescimento de células endoteliais a uma região específica de uma placa de 6 poços para aplicação de estresse de tesoura usando o modelo de agitador orbital.

Segmentando o crescimento de células endoteliais em placas de 6-bem em um agitador orbital para estudos mecanobiológicos

Aqui, fornecemos um chip microfluido e um sistema microfluido de circulação de circulação automaticamente controlado e altamente eficiente que recapitula o microambiente inicial da neovascularização, permitindo que as células endoteliais (CE) sejam estimuladas pelo alto estresse da cisalhamento luminal, nível fisiológico de fluxo transendelial e distribuição de vários fatores de crescimento endotelial vascular (VEGF) simultaneamente.

Modelo microfluido para imitar evento inicial de neovascularização

Há necessidade de determinar quais lesões ateroscleróticas progredirão na vasculatura coronária para orientar a intervenção antes do infarto do miocárdio ocorrer. Este artigo descreve a modelagem biomecânica das artérias a partir da Tomografia de Coerência Óptica usando técnicas de interação fluido-estrutura em um solucionador de elementos finitos comerciais para ajudar a prever essa progressão.

Análise de interação biomecânica de fluido-estrutura biomecânica baseada em coerência óptica da progressão da aterosclerose coronária

Aqui, apresentamos um protocolo para fabricar e operar um sistema microfluídico que expõe células endoteliais à hiperglicemia oscilatória sincronizada e ao estresse de cisalhamento pulsátil. Essa abordagem fornece um modelo in vitro fisiologicamente relevante para estudar a disfunção endotelial diabética. Esse protocolo permite a medição quantitativa do estresse oxidativo e das respostas das células endoteliais.

Um Sistema Microfluídico para Modelagem de Disfunção Endotelial sob Estresse Fisiológico Combinado de Cisalhamento Pulsátil e Hiperglicemia Oscilatória

Aprenda a montar anéis de cisalhamento para estudar células endoteliais sob fluxo periódico e tensão de cisalhamento. Este método simples e econômico permite avaliar respostas celulares em áreas amplas.

A Assembleia e Aplicação de tesoura Anéis: A endotelial novo modelo de Orbital, unidirecional e periódica fluxo de fluido e tensão de cisalhamento (Vídeo) | JoVE Journal

A Assembleia e Aplicação de 'tesoura Anéis': A endotelial novo modelo de Orbital, unidirecional e periódica fluxo de fluido e tensão de cisalhamento

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