A Assembleia e Aplicação de 'tesoura Anéis': A endotelial novo modelo de Orbital, unidirecional e periódica fluxo de fluido e tensão de cisalhamento

O objetivo geral deste modelo é criar um método simples e econômico para estudos de fluxo periódico de fluidos in vitro e estresse de cisalhamento em células endoteliais. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da Fisiologia das Células Endoteliais. Por exemplo, como o cisalhamento periódico afeta a forma, a estrutura e o funcionamento das células endoteliais.

A principal vantagem dessa técnica é que ela usa um dispositivo de cultura de tecidos montado de forma simples, que fornece áreas de superfície relativamente grandes para avaliação das respostas celulares. Demonstrando este procedimento, estará o Sr. Luke White, um estudante de medicina em meu laboratório. Comece este procedimento usando o software de apresentação para criar um modelo de construção de anel de cisalhamento com um perfil de borda externa de 150 milímetros e um diâmetro interno de 100 milímetros colocado no centro do círculo de 150 milímetros.

Imprima o modelo em uma folha de papel branco A4. Trabalhando sob uma capela com ventilação adequada e usando luvas, pipetar cloreto de metileno de 10 milímetros em uma placa de Petri de vidro de 150 milímetros. É fundamental que o prato seja de vidro, pois o cloreto de metileno solubiliza a maioria dos plásticos.

Alinhe uma placa de Petri de plástico de 150 milímetros no gabarito de cisalhamento externo. Use uma ferramenta rotativa para fazer um furo de três 3 milímetros no centro de um prato de 100 milímetros. Remova quaisquer aparas de plástico produzidas pela perfuração.

Enquanto segura a placa de Petri de 100 milímetros com a mão enluvada, inverta e mergulhe a borda superior da placa na poça de cloreto de metileno por aproximadamente três segundos. Deixe o excesso de cloreto de metileno escorrer do prato de 100 milímetros e, em seguida, transfira rapidamente a borda do prato molhado para o centro do prato de 150 milímetros. Alinhando cuidadosamente o prato de 100 milímetros no modelo marcado.

Gire suavemente a antena parabólica de 100 milímetros no sentido horário e anti-horário algumas vezes para garantir uma boa aderência à antena de 150 milímetros. Depois que o cloreto de metileno secar, vire as placas de Petri recém-ligadas e inspecione cuidadosamente os pontos de contato. Se uma vedação hermética não estiver completamente formada, injete 0,5 mililitros de cloreto de metileno através do orifício de 3 milímetros com uma pipeta de transferência.

Pegue o prato e gire-o suavemente para permitir que o cloreto de metileno alcance a borda. Depois de garantir que uma vedação hermética foi formada entre as duas placas de Petri, sele o orifício na placa de 100 milímetros aplicando um cordão de 3 milímetros de selante de borracha de silicone. Usando uma ferramenta rotativa equipada com uma cabeça de corte plana, corte a parte superior de 3 centímetros de um tubo de cultura de tecidos de poliestireno conocole de 15 milímetros, deixando pelo menos um centímetro do tubo abaixo da tampa.

Use o lado plano da cabeça de corte para polir a borda do tubo cortado até ficar liso e plano. Remova todas as aparas de plástico produzidas pela moagem. Com um marcador, trace o tubo concole de 15 mililitros cortado na tampa do prato de 150 milímetros a aproximadamente 0.5 centímetros de distância da borda do prato.

Faça um furo dentro do círculo desenhado, deixando uma margem de aproximadamente um a dois milímetros da borda do círculo. Coloque a parte superior do tubo conocole cortado sobre o orifício perfurado. Usando uma pitette de transferência, aplique aproximadamente um quarto de mililitro, ou 250 microlitros de cloreto de metileno, nas bordas cortadas do tubo de conócolo para ligar o tubo de conócolo à tampa de 150 milímetros.

Por fim, sele a tampa de 150 milímetros na placa de 150 milímetros aplicando um cordão de um milímetro de espessura de selante de borracha de silicone ao redor da borda interna da placa de Petri superior. Um esquema de um anel de selagem montado é mostrado. O azul representa a área das células endoteliais plaqueadas.

As setas vermelhas externas e internas indicam o movimento orbital do anel de cisalhamento e da mídia dentro do anel de cisalhamento quando colocado em um agitador orbital. Prepare-se para a esterilização pipetando aproximadamente 10 milímetros de PBS no anel de cisalhamento recém-formado, através da porta do tubo conocole de 15 mililitros. Gire para remover quaisquer detritos dentro do anel de cisalhamento.

Remova o PBS com uma pipeta Pasteur e um aspirador a vácuo. Repita a lavagem com PBS até que todos os detritos sejam removidos. Para esterilizar o anel de cisalhamento, será usada uma combinação de enxágue com etanol a 70% e irradiação UV.

Desaperte a tampa ventilada, pipete aproximadamente 10 mililitros de etanol a 70% através da porta de acesso e aperte a tampa novamente. Gire e vire o anel de selagem várias vezes, certificando-se de que o interior do anel de selagem seja bem lavado. Sob um capuz de cultura de tecidos, aspire o excesso de etanol a 70%.

Com um borrifador, borrife bem a porta de acesso e a tampa com 70% de etanol. Em seguida, coloque o anel de cisalhamento e a tampa sob radiação UV na capa de cultura de tecidos até secar completamente. Assim que o anel de cisalhamento estiver seco, aperte a tampa novamente.

Armazene os anéis de cisalhamento esterilizados em temperatura ambiente até que sejam usados no revestimento de cultura de células. Para se preparar para um estudo de tensão de cisalhamento, coloque primeiro as células endoteliais em anéis de cisalhamento esterilizados seguindo o protocolo padrão de cultura de células. Permita que a cultura atinja a confluência antes do início dos estudos de fluxo.

Quando as células atingirem a confluência, coloque os anéis de cisalhamento experimentais em um agitador orbital que é colocado na prateleira inferior da incubadora para minimizar a tensão e a vibração da prateleira. Coloque anéis de cisalhamento do grupo de controle estático dentro da mesma incubadora. Deixe os anéis de cisalhamento no agitador pela duração desejada da aplicação da tensão de cisalhamento.

Depois que as camadas de células forem expostas ao cisalhamento pelo período de tempo desejado, remova os anéis de cisalhamento da incubadora. Retire a tampa do anel de cisalhamento e recupere as células e/ou mídia para a análise do ponto final desejado. Observe que, após a abertura dos anéis de cisalhamento, os investigadores podem coletar células e meios para análise usando vários métodos.

São mostrados resultados representativos do aparecimento de monocamadas de células endoteliais cerebrais CMEC D3 humanas em anéis de cisalhamento após 48 horas de cisalhamento periódico de fluidos ou exposição estática, observou-se que o alinhamento da cultura nem sempre é paralelo à direção do fluxo indicada pelas setas. Algumas respostas ao cisalhamento periódico são mostradas nas camadas mono de células endoteliais microvasculares da retina de ratos. 72 horas de cisalhamento periódico de fluido em anéis de cisalhamento resultaram em uma redução significativa na molécula de adesão de células plaquetárias-endoteliais em relação ao controle de carga de beta-actina.

Uma vez dominados, vários anéis de cisalhamento podem ser construídos em cerca de três horas se forem executados corretamente Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de alinhar cuidadosamente o prato interno com o prato externo e que uma vedação firme se forme entre eles. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como construir e usar anéis de cisalhamento como um método simples para realizar estudos periódicos de fluxo de fluido in vitro e estresse de cisalhamento em células endoteliais. Não se esqueça de que trabalhar com cloreto de metileno pode ser perigoso e precauções, como trabalhar sob uma capela de exaustão, devem sempre ser tomadas durante a execução de etapas que o exijam.