A Assembleia e Aplicação de 'tesoura Anéis': A endotelial novo modelo de Orbital, unidirecional e periódica fluxo de fluido e tensão de cisalhamento

O objetivo geral deste modelo é criar um método simples e econômico para estudos de fluxo periódico de fluido in vitro e tensão de cisalhamento em células endoteliais. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da Fisiologia da Célula Endotelial, como, por exemplo, como o cisalhamento periódico afeta a forma, a estrutura e o funcionamento das células endoteliais.

A principal vantagem desta técnica é que ela utiliza um dispositivo de cultura tecidual montado de forma simples, que fornece áreas superficiais relativamente grandes para a avaliação das respostas celulares. Demonstrará este procedimento o Sr. Luke White, um estudante de medicina no meu laboratório. Inicie este procedimento utilizando um software de apresentação para criar um modelo de construção de anel de cisalhamento com um perfil de borda externa de 150 milímetros e um diâmetro interno de 100 milímetros posicionado no centro do círculo de 150 milímetros.

Imprima o modelo em uma folha de papel branco A4. Trabalhando sob uma cabine de exaustão com ventilação adequada e usando luvas, pipete 10 milímetros de cloreto de metileno em uma placa de Petri de vidro de 150 milímetros. É fundamental que a placa seja de vidro, pois o cloreto de metileno solubiliza a maioria dos plásticos.

Alinhe uma placa de Petri de 150 milímetros de plástico com o molde externo de cisalhamento. Use uma ferramenta rotativa para fazer um furo de 3 milímetros no centro de uma placa de 100 milímetros. Remova todas as aparas de plástico geradas pela perfuração.

Mantendo o recipiente de Petri de 100 milímetros com a mão enluvada, inverta-o e mergulhe a borda superior do recipiente na poça de cloreto de metileno por aproximadamente três segundos. Deixe o excesso de cloreto de metileno escorrer do recipiente de 100 milímetros e, em seguida, transfira rapidamente o recipiente úmido com a borda voltada para baixo para o centro do recipiente de 150 milímetros. Alinhe cuidadosamente o recipiente de 100 milímetros sobre o molde marcado.

Gire suavemente a placa de 100 milímetros no sentido horário e anti-horário algumas vezes para garantir uma boa aderência à placa de 150 milímetros. Uma vez que o cloreto de metileno tenha secado, vire as placas de Petri recém-unidas e inspecione cuidadosamente os pontos de contato. Se um selo hermético não tiver se formado completamente, injete 0,5 mililitros de cloreto de metileno através do orifício de 3 milímetros com uma pipeta de transferência.

Levante o recipiente e gire-o suavemente para permitir que o cloreto de metileno alcance a borda. Após garantir que foi formado um selo hermético entre os dois recipientes de Petri, feche o orifício no recipiente de 100 milímetros aplicando um filete de 3 milímetros de vedante de borracha de silicone. Usando uma ferramenta rotativa equipada com uma lâmina de corte plana, corte a porção superior de 3 centímetros de um tubo de cultura de tecidos de poliestireno cônico de 15 milímetros, deixando pelo menos um centímetro do tubo abaixo da tampa.

Use o lado plano da cabeça de corte para polir a borda do tubo cortado até que fique lisa e plana. Remova todas as rebarbas de plástico produzidas pelo desbaste. Com uma caneta, trace o contorno do tubo cônico de 15 mililitros cortado na tampa da placa de 150 milímetros, aproximadamente a 0,5 centímetros da borda da placa.

Faça um furo dentro do círculo desenhado, deixando uma margem de aproximadamente um a dois milímetros da borda do círculo. Coloque a parte superior do tubo cônico cortada sobre o furo perfurado. Usando uma pipeta de transferência, adicione aproximadamente um quarto de mililitro, ou 250 microlitros de cloreto de metileno nas bordas cortadas do tubo cônico para fixar o tubo cônico na tampa de 150 milímetros.

Finalmente, feche a tampa de 150 milímetros sobre a placa de 150 milímetros aplicando um filete de vedação de borracha de silicone com cerca de um milímetro de espessura ao longo da borda interna da placa de Petri superior. É apresentado um esquema de um anel de vedação montado. A cor azul representa a área de células endoteliais cultivadas.

As setas vermelhas externa e interna indicam o movimento orbital do anel de cisalhamento e do meio no interior do anel de cisalhamento quando colocado em um agitador orbital. Prepare para a esterilização pipetando aproximadamente 10 milímetros de PBS no anel de cisalhamento recém-formado, através da porta do tubo cônico de 15 mililitros. Agite suavemente para remover qualquer resíduo no interior do anel de cisalhamento.

Remova o PBS com uma pipeta de Pasteur e um aspirador a vácuo. Repita a lavagem com PBS até que todos os detritos sejam removidos. Para esterilizar o anel de cisalhamento, será utilizada uma combinação de enxágue com etanol a 70% e irradiação com UV.

Desrosqueie a tampa ventilada, pipete aproximadamente 10 mililitros de etanol 70% através da porta de acesso e rosqueie novamente a tampa. Gire e vire várias vezes o anel de vedação, garantindo que o interior do anel seja completamente lavado. Sob uma cabine de cultura de tecidos, aspire o excesso de etanol 70%.

Com um frasco pulverizador, pulverize completamente a porta de acesso e a tampa com etanol 70%. Em seguida, coloque o anel de cisalhamento e a tampa sob radiação UV na capela de cultura de tecidos até ficarem completamente secos. Uma vez que o anel de cisalhamento esteja seco, rosqueie a tampa novamente.

Armazene os anéis de cisalhamento esterilizados em temperatura ambiente até que sejam utilizados no plaqueamento de culturas celulares. Para preparar um estudo de tensão de cisalhamento, plaque primeiro as células endoteliais nos anéis de cisalhamento esterilizados, seguindo o protocolo padrão de cultura celular. Deixe a cultura atingir confluência antes do início dos estudos de fluxo.

Quando as células atingirem confluência, coloque os anéis experimentais de cisalhamento em um agitador orbital posicionado na prateleira inferior do incubador para minimizar o estresse e a vibração da prateleira. Coloque os anéis de cisalhamento do grupo controle estático dentro do mesmo incubador. Deixe os anéis de cisalhamento no agitador pelo tempo desejado de aplicação do estresse de cisalhamento.

Após as camadas celulares terem sido expostas ao cisalhamento pelo tempo desejado, remova os anéis de cisalhamento do incubador. Retire a tampa do anel de cisalhamento e colete as células e/ou o meio para a análise final desejada. Observe que, após abrir os anéis de cisalhamento, os pesquisadores podem colher células e meio para análise utilizando diversos métodos.

Apresentam-se resultados representativos da aparência de monocamadas de células endoteliais cerebrais humanas CMEC D3 em anéis de cisalhamento após 48 horas de exposição a cisalhamento periódico de fluido ou condição estática; observou-se que o alinhamento do cultivo nem sempre é paralelo à direção do fluxo indicada pelas setas. Alguns exemplos de resposta ao cisalhamento periódico são mostrados em monocamadas de células endoteliais microvasculares retinianas de rato. Após 72 horas de cisalhamento periódico de fluido em anéis de cisalhamento, observou-se uma redução significativa na molécula de adesão de plaquetas e células endoteliais em relação ao controle de carga Beta-actina.

Uma vez dominado, é possível construir vários anéis de cisalhamento em cerca de três horas, se o procedimento for realizado corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de alinhar cuidadosamente o prato interno com o prato externo, garantindo que um selo hermético se forme entre eles. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como construir e utilizar anéis de cisalhamento como um método simples para realizar estudos in vitro de fluxo periódico de fluidos e tensões de cisalhamento em células endoteliais. Não se esqueça de que trabalhar com cloreto de metileno pode ser perigoso e que precauções, como trabalhar sob uma cabine de exaustão, devem sempre ser tomadas durante as etapas que o exigem.