Name: Estudar processos dinâmicos de Nano porte Objects no líquido utilizando a Transmissão Microscopia Eletrônica de Varredura (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: Aprenda microscopia eletrônica de varredura em fase líquida para observar nanopartículas de ouro em água usando microchips de SiN. Este método permite estudar processos dinâmicos nanométricos em tempo real.

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Agradecemos a E. Arzt por seu apoio através do INM. A pesquisa foi em parte apoiada pelo Leibniz Competition 2014.

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

O protocolo descrito permite haste do AuNPs em um líquido, incluindo a observação de processos dinâmicos. A montagem do suporte é uma técnica fácil de aprender. No entanto, vários aspectos devem ser considerados quando se trabalha com o titular TEM fluxo do líquido. Por exemplo, as arestas quebradas do microchip Si ou partículas grandes de os anéis de vedação pode resultar em fuga de líquido da célula. Por outro lado, as partículas grandes (&gt; 200 nm, por exemplo, pó ou Si detritos) na membrana SiN pode resultar num aumento da espessura da célula de líquido, que conduz a um baixo contraste de imagem ou a uma baixa resolução espacial e pode até causar janelas pecado a quebrar. Importante, resíduos de sal ou outros produtos químicos podem influenciar o resultado dos experimentos de uma forma indesejada. Portanto, é crucial que as diferentes etapas de preparação das amostras e montagem titular são realizadas com cuidado e em um ambiente limpo e livre de poeira. A espessura da ce líquidoLL determina a resolução possível, assim como o contraste de imagens obtidas 17. Esta espessura pode ser ajustada por intermédio de separadores localizados em um dos dois microprocessadores de Si. Dependendo das dimensões da amostra, as diferentes espessuras da célula líquido pode ser realizado. Para o estudo de AuNPs, é possível utilizar pequenas espaçadores (200-500 nm), enquanto que as células eucarióticas inteiros precisa espaçadores maiores de até 5 um. A espessura da célula de líquido é ainda influenciada pelo abaulamento das janelas de membrana SiN resultantes da diferença de pressão entre a célula e o líquido de vácuo envolvente. Este efeito torna-se mais pronunciada com janelas de membrana SiN maiores. Assim, de modo a minimizar a espessura da célula de líquido, é recomendado o uso de janelas de membrana SiN pequenas. No caso, é difícil encontrar uma sobreposição entre duas pequenas janelas, eles podem ser montados numa configuração cruzada utilizando um microchip de base diferente. configurações alternativas largEly evitar abaulamento e consistem de um microchip 18 ou membrana monolíticas janelas sustentados por pilares 19, mas essas desvantagens exposição sobre o carregamento da amostra. Um dos aspectos mais difíceis da tecnologia atual é a falta de um controle preciso sobre a espessura líquida. Muitas vezes, o líquido é muito mais espessa do que o esperado a partir das dimensões espaçadores utilizados, como foi mostrado aqui. Vários grupos utilizaram câmaras fechadas líquidos 4, 20, 21, 22; estes sistemas têm algumas vantagens em relação à resolução espacial, como a espessura do líquido pode ser reduzida através da indução de uma bolha no líquido. Em alternativa, as janelas SiN pode ser forçado a entrar em colapso, o que leva a uma camada mais fina de líquido. Em terceiro lugar, o gabinete de outras janelas mais finas existe (por exemplo, o grafeno) 23, também resultando em líquidos muito mais finodo que é possível com o sistema descrito neste protocolo. No entanto, é impossível para o fluxo de líquido em tais sistemas. Como para qualquer técnica de microscopia de alta resolução, deve ser considerado um número de aspectos experimentais. O aspecto mais importante, é a interacção do feixe de electrões com o líquido ou a amostra. Além de danos de radiação, o que limita a resolução espacial possível para muitas amostras sólidas 24, as amostras líquidas também são influenciadas pelos electrões gerados produtos de feixe 15, 25 de radiólise. Uma vez que estes produtos podem influenciar a experiência, a interpretação dos dados cuidadosas e design experimental são fundamentais 26. As configurações do microscópio deve ser escolhido de acordo com os objectivos de um estudo particular. STEM ADF é mais poderoso para as nanopartículas de imagem de alto número atômico (Z) em maiores espessuras da célula líquido, while TEM dá um melhor contraste de materiais de baixo-Z e é tipicamente mais rápido, mas requer mais finas camadas líquidas 3. Em vez de usar o detector ADF, o (BF) detector Campo brilhante é por vezes utilizado para a imagem da célula líquido, desde BF STEM é vantajoso para imagiologia materiais de baixo Z em camadas espessas 27. Com o aumento da espessura da célula de líquido, é necessário mais atual. No entanto, isto também aumenta a concentração de produtos de radiólise e aumenta os danos da radiação. Deve também ser notado que uma inversão de contraste é observado no detector de ADF para líquidos muito grossas (&gt; 10 uM para água). As condições foram alteradas líquidos entre as nossas experiências, removendo o suporte do microscópio e troca tanto a amostra e o líquido. Para além da alteração da concentração de sal, é facilmente possível mudar as outras propriedades do líquido que flui através de diferentes líquidos (por exemplo, um podeusar soluções tampão, a fim de definir um pH específico ou 16 podem introduzir soluções orgânicas ou outros aditivos). É também possível mudar o líquido enquanto que o suporte é ainda inserido no microscópio de líquidos fluindo através do sistema de microfluidos. No entanto, neste caso, não se sabe em que ponto de tempo o líquido para as mudanças de amostra. É também digno de nota que os microchips de apoio eléctrodos estão disponíveis, assim experiências electroquímicas nanoescala pode ser levada a cabo 28. Os objectos de estudo não estão limitados a AuNPs em água, mas uma grande variedade de amostras pode ser estudada usando o protocolo descrito acima, incluindo sílica, óxido de titânio, e polímeros. Se os movimentos dos objectos são demasiado rápido para capturar uma imagem em dentro da aquisição, a viscosidade pode ser reduzida por uma ordem de magnitude, utilizando uma mistura de 50% de glicerol e 50% de água. A partir dos pontos acima mencionados,um número de vantagens, possibilidades, e também desvantagens tornam-se aparentes. Quando se trabalha com a haste de fase líquida, as suas desvantagens mais importantes a considerar são os seguintes: 1) qualquer experiência é influenciada pela interacção dinâmica do feixe de electrões com toda a amostra (o objecto sob observação, o líquido, e as membranas SIN); 2) o tratamento de amostras é tedioso, e muitas vezes é difícil de conseguir uma camada fina de líquido, porque a amostra ou as micropastilhas contêm algumas partículas de tamanho micrométrico; 3) a espessura do líquido normalmente difere grandemente da espessura destina definido pelo espaçador; e 4) a resolução espacial e contraste depende fortemente da espessura do líquido e a diferença entre a densidade de mudança do objecto sob observação e o líquido. Atualmente, existem amplas métodos para a microscopia de objetos em líquido com resolução espacial nanométrica. Microscopia eletrônica em gelo amorfo é uma técnica poderosa 29,mas os procedimentos experimentais envolvidos são delicadas, nem todos os experimentos permitem a preparação da amostra em gelo, e as experiências resolvidas no tempo são impossíveis. Microscopia de raios X 30, 31 pode, em princípio, ser utilizados, mas tem uma resolução espacial limitada e não estão amplamente disponíveis em laboratórios. Microscopia de força atômica em líquido foi estabelecida, mas é uma técnica de superfície de apenas 32, 33, 34, 35. A microscopia de luz não exibem resolução espacial suficiente. No presente, a microscopia de electrões no estado líquido parece ser a técnica mais poderosa para microscopia directa de objectos em nano-escala e os processos em líquido. TEM-fase líquida e STEM ainda não são técnicas de análise de rotina, mas ainda estão em desenvolvimento. O número de parâmetros a ter em conta é considerável, e é ofteN difícil de reproduzir os resultados experimentais. Além disso, os dados quantitativos é difícil de obter, porque os efeitos sob investigação estão interligados com os processos que ocorrem como um resultado do feixe de electrões. O protocolo aqui descrito destina-se a padronizar o protocolo experimental, representando, assim, para todos os aspectos de bases relevantes do experimento. Esperamos que este protocolo vai levar a melhor reprodutibilidade do trabalho experimental neste campo emergente.

Convencional Digitalização Microscopia Electrónica de Transmissão (STEM) é limitada pela gama das amostras adequadas para análise, especificamente as amostras secas e sólidas adequadas para a colocação em alto vácuo. No entanto, muitas questões científicas e tecnológicas preocupar materiais e processos em meio líquido em nanoescala. Amostras totalmente incorporado no líquido pode agora ser estudado com STEM usando um conceito que envolve uma câmara microfluídicos montados no suporte do espécime para a Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) e STEM 1. Esta técnica recém-desenvolvida tornou-se cada vez mais popular, já que oferece uma nova visão sobre os processos importantes de vários temas de investigação, incluindo o crescimento, a dissolução, e os processos de agregação de nanopartículas 2, 3, 4, 5, 6. Não apenas metais, mas também biominerals 7 e os sistemas biológicos podem ser estudados 8, 9, 10, 11. O carregamento de amostras e aquisição de imagem para STEM em fase líquida é diferente do que para STEM de amostras secas e envolvem um protocolo que requer treinamento dedicado. O sistema de microfluidos consiste de dois chips de silício de suporte de nitreto de silício janelas (SIN) membrana transparente para o feixe de electrões a 200 keV de energia 12 (ver figura 1A). Os detalhes das dimensões e da manipulação desses microchips podem ser encontrados em outros lugares 12, 13. A amostra normalmente contém objectos em nano-escala. Neste trabalho observamos nanopartículas de ouro (AuNPs). Os AuNPs são imobilizadas na janela superior (em relação a um feixe de electrões para baixo-viajando) ou flutuar no Liquidentidade. Resolução espacial em nanoescala em STEM é obtida fazendo a varredura do feixe de elétrons ao longo dos AuNPs e coleta de elétrons espalhados transmitidos usando o detector anular escuro Field (ADF) 9. Os dois microchips são colocados numa pequena ranhura na ponta do suporte TEM fluxo do líquido 1 (o titular opera tanto para caule e MET mas é referido como o suporte do MET). Uma das micropastilhas contém um espaçador de modo a que um compartimento de líquido é formada entre os microchips. Anéis de vedação em ambos os lados dos dois microchips proporcionam uma vedação de vácuo do líquido do compartimento 13 (ver Figura 1B). O objetivo deste artigo é demonstrar as etapas básicas de carregamento de amostras e aquisição de dados para que os usuários interessados ​​podem encontrar fácil acesso a esta nova técnica emergente. Um sistema disponível a partir de uma companhia específica é utilizado, mas o protocolo é também válido para os sistemas de outras empresas. A técnica émais complexo do que MET convencional e a haste, e um certo número de aspectos práticos deve ser considerado quando se trabalha com um sistema de recipientes de líquido 13. O mais importante de tudo é o de assegurar que o compartimento de líquido é correctamente montado, proporcionando assim uma camada de líquido fino e um selo de vácuo. Portanto, é muito importante para o trabalho de forma limpa e para evitar a formação de pó durante a preparação e montagem do suporte TEM fluxo do líquido. Em particular, os O-rings e os dois microchips de silício precisam ser isenta de qualquer contaminação. Mesmo as pequenas partículas de pó sobre uma das micropastilhas pode aumentar fortemente a espessura da célula montada, o que pode impedir a consecução de uma resolução espacial útil. Um selo de vácuo é importante para que haja contaminação ou danos será deixado no microscópio electrónico após a experiência. Este protocolo descreve o procedimento de carregamento e vários testes necessários. A operação do microscópio eletrônico é simples, but ele requer alguns passos extras em comparação com a microscopia de amostras sólidas. Com o aumento da espessura líquidos, mais elétrons são absorvidos e espalhados pelo líquido; uma medida da espessura do líquido é essencial. Finalmente, o protocolo explica como as imagens são tiradas e como processos dinâmico pode ser estudada. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54943/54943fig1.jpg"> Figura 1: celular fluxo líquido para digitalização Microscopia Eletrônica de Transmissão (STEM). (A) Representação esquemática da célula de líquido montado. Dois microchips de silício com janelas de membrana de nitreto de silício (SIN) são posicionadas entre dois anéis de vedação. O líquido é colocado entre a membrana SiN e é assim separada do vácuo no microscópio eletrônico. Uma campanha de exames de feixe de elétrons sobre a amostra. Contraste é obtido a partir de electrões dispersos. As nanopartículas de ouro (AuNPs) são imobilizadas no interior do líquido na membrana de SiN, mas também se pode mover nalíquido. (B) seção transversal esquemática vista lateral da pilha de dois microchips com o-rings. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54943/54943fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Microscópio de luz binocular</td><td>Leica</td><td>M60 CMO</td><td></td></tr><tr><td>Mircoscópio eletrônico de transmissão de varredura com corretor de aberração esférica</td><td>JEOL</td><td>ARM200F</td><td></td></tr><tr><td>Porta-amostras TEM de fluxo líquido</td><td>DENS Solutions</td><td>Ocean</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de seringa microfluídica</td><td>Harvard Scientific</td><td>PicoPlus</td><td></td></tr><tr><td>Limpador de plasma</td><td>Gatan</td><td>Solarus950</td><td></td></tr><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetona, Rotisolv&nbsp; Plus para HPLC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7328.2</td><td></td></tr><tr><td>Água, chromasolv Plus para HPLC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34877-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, Rotisolv HPLC grau</td><td>Carl Roth</td><td>P076.2</td><td></td></tr><tr><td>Citrato coloidal de ouro estabilizado, diâmetro 30 nm</td><td>British-Biocell</td><td>EM. GC20</td><td></td></tr><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Base microchips de silício com membranas de nitreto de silício de 50 nm de espessura e dimensões de 20 &micro; m x 0,40 mm</td><td>DENS Soluções</td><td>para sistema</td><td></td>oceânico</tr><tr><td>Microchips de silício espaçadores com membranas de nitreto de silício de 50 nm de espessura, dimensões de 20 &micro; m x 0,40 mm, e espessura do espaçador de 200 nm</td><td>Soluções DENS</td><td>para sistema</td><td></td>oceânico</tr><tr><td>Tubulação de peek microfluídica</td><td>Upchurch Scientific</td><td>1570</td><td></td></tr><tr><td>Pinças de plástico</td><td></td><td></td><td></td> substituíveis</tr> <tr><td>(corpo de aço inoxidável antimagnético antiácido com pontas ESD PVDF (SV))</td> <td>ideal-tek</td><td>2ASVR.SA</td><td></td></tr><tr><td>pinças de aço dobradas revestidas de Teflon (EMS SA com "PTFE" Revestimento)</td><td>Ciências de Microscopia Eletrônica</td><td>78322-7Te</td><td></td></tr><tr><td>Pinças de aço de bico largo revestidas com Teflon (Revestimento EMS 2A "PTFE")</td><td>Ciências de Microscopia Eletrônica</td><td>78322-2ATe</td><td></td></tr><tr><td>Seringa Hamilton, 1 mL, estanque a gás (Modelo 1001 TLLX SYR)</td><td>Hamilton</td><td>81323</td><td></td></tr><tr><td>Tecido de sala limpa Sontara Micropure AP (224 x 224mm)</td><td>DuPont</td><td>Sontara MicroPure</td><td></td></tr></tbody></table>

estudar processos dinâmicos de nano porte objects no líquido utilizando a transmissão microscopia eletrônica de varredura

Studying Dynamic Processes of Nano-sized Objects in Liquid using Scanning Transmission Electron Microscopy

Amostras totalmente incorporado no líquido pode ser estudado em uma resolução espacial em nanoescala com Digitalização em Microscopia Eletrônica de Transmissão (STEM), utilizando uma câmara microfluídicos montados no suporte do espécime para a Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) e STEM. O sistema microfluídico é composto por dois microchips de silício de apoio janelas de membrana fina de nitreto de silício (SiN). Este artigo descreve os passos básicos de carregamento de amostras e aquisição de dados. O mais importante de tudo é o de assegurar que o compartimento de líquido é correctamente montado, proporcionando assim uma camada de líquido fino e um selo de vácuo. Este protocolo também inclui uma série de testes necessários para realizar durante o carregamento da amostra, a fim de garantir a montagem correta. Uma vez que a amostra é colocado no microscópio eletrônico, a espessura líquido precisa ser medido. A montagem incorrecta pode resultar em um líquido demasiado espesso, enquanto um líquido muito fina pode indicar a ausência de líquido, tal como quando uma bolha é formada. Finalmente, o protocoloexplica como as imagens são tomadas e como os processos de dinâmica pode ser estudada. Uma amostra contendo ambas AuNPs é fotografada em água pura e em solução salina.

O titular TEM fluxo líquido foi usado para estudar o comportamento de AuNPs em líquido. AuNPs foram imobilizados de forma estável na membrana pecado em água pura e foram fotografadas com a resolução nanoescala usando STEM em fase líquida (Figura 6). Excelente contraste foi obtido sobre o ouro fortemente de dispersão. A densidade de corrente na tela de fósforo medida para uma amostra seca foi de 20 pA / cm², enquanto se elevava a 8 pA / cm² com o titular TEM fluxo do líquido inserido. Utilizando a Equação 1, t = água de 2,4 ± 0,5 um, muito maior do que o que se esperava com base na espessura do espaçador de 200 nm. No entanto, a espessura não é demasiado grande para a imagem dos AuNPs com resolução espacial nanométrica. A espessura líquido era mais espessa do que a 200 nm, definido pelo separador devido ao abaulamento da SiN membranas, não-planicidade das micropastilhas, e detritos que residem no microchip. 16, embora os produtos da radiólise reactivos (e - aq, H •, H +, OH •) proveniente da interacção do feixe de electrões com água pode oxidar individuais átomos de ouro, levando a uma mudança da forma da AuNPs 15. No entanto, quando o sistema de escoamento do líquido foi usado para introduzir iões cloreto numa segunda experiência, a estabilidade dos AuNPs alterado. Os iões de cloro são capazes de estabilizar átomos de ouro oxidados sob a forma de tetrachloroaureat, AuCl 4 -. A Figura 7 mostra que as AuNPs lentamente dissolvidos durante uma série de lapso de tempo de imagem STEM, semelhante aos resultados relatados anteriormente 16. Para a taxa de dose de elétrons usado, levou ~ 300 s para dissolver os 30 AuNPs tamanho nm-. Os movimentos de AuNPs em wate R foram estudados numa terceira experiência (Figura 8). Antes do experimento, o suporte TEM fluxo do líquido foi limpa de modo a remover quaisquer vestígios de sal. Que difere do primeiro experimento, uma abordagem alternativa a preparação da amostra foi utilizado para alcançar uma fixação mais fraca das AuNPs para a membrana 14 SiN. Nesta experiência, a solução foi colocada AUNP na micropastilha de silício e montada no suporte TEM fluxo do líquido sem deixar que a solução seque. Desta forma, os AuNPs facilmente separado da membrana pecado sobre imagiologia à taxa de dose utilizada. Alguns dos AuNPs afastou-se do campo de visão para as soluções a granel, enquanto os AuNPs restantes mantiveram-se dentro do campo de visão em estreita proximidade com a janela do pecado. Foram observados movimentos destes AuNPs, e eventualmente eles aglomeradas. Depois de um tempo, esses aglomerados também separado da membrana SiN e mudou-se para fora do campo de visão e na solução. ntent "fo: manter-together.within-page =" 1 "&gt; <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/54943/54943fig6.jpg"> Figura 6: A digitalização Microscopia Eletrônica de Transmissão (STEM) Micrografia da AuNPs 30 nm de diâmetro no topo de uma camada de água pura. A imagem mostrada é uma área selecionada da imagem original. O tamanho da imagem foi de 1.024 x 1.024 pixels, o tempo de permanência do pixel foi de 19 mS, o tamanho do pixel foi de 0,73 nm e, a ampliação foi 400,000X. A dose de electrões se assim 7,1 x 10 4-E - / nm². A densidade de corrente medida na tela de fósforo foi de 8 pA / cm 2, de modo que a espessura do líquido foi calculada a ascender a 2,4 uM. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54943/54943fig6large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/54943/54943fig7.jpg"> Figura 7: Série Time-lapsede micrografias caule de AuNPs em Saline. (AD) Imagens extraído da série time-lapse de imagens STEM no s intervalos de 30. Os AuNPs gradualmente se dissolvem em líquidos, como uma consequência da presença de iões cloreto. O tempo de permanência do pixel foi de 2 mS, o tempo fotograma da série lapso de tempo foi de 1,75 s, o tamanho do pixel foi de 0,44 nm e, a ampliação foi 500,000 ciclos. A dose de elétrons por imagem foi de 1,2 x 10 4 e - / nm². A espessura de líquido foi de 2,4 uM. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54943/54943fig7large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/54943/54943fig8.jpg"> Figura 8: STEM Micrografia da AuNPs em movimento na água pura. (A) da membrana pecado com AuNPs, dos quais vários são selecionados com setas. (B) faixas de movimentodos AuNPs selecionados (ver A). Alguns AuNPs afastar-se do campo de visão durante o tempo de imagiologia. Os AuNPs restantes mover-se lateralmente ao longo da membrana pecado e começar a aglomerar. Ao atingir um tamanho crítico aglomerado, que é entregue a partir da membrana e afastar-se do campo de pixel de view.The tempo de permanência foi de 1 mS, o tempo de estrutura foi de 0,52 s, o tamanho do pixel foi de 1,8 nM, e a ampliação foi 120,000X. A dose de elétrons por imagem foi de 3,5 x 10 2 e - / nm² ea espessura líquida foi de 2,4 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54943/54943fig8large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Este protocolo descreve o funcionamento de um suporte de amostra de fluxo de líquido para microscopia electrónica de varrimento de transmissão de AuNPs em água, tal como utilizado para a observação de processos dinâmicos em nano-escala.

Estudar processos dinâmicos de Nano porte Objects no líquido utilizando a Transmissão Microscopia Eletrônica de Varredura

Samples fully embedded in liquid can be studied at a nanoscale spatial resolution with Scanning Transmission Electron Microscopy (STEM) using a ...

O objetivo geral da microscopia eletrônica de transmissão de varredura em fase líquida é observar estruturas e fenômenos de nanomateriais em amostras biológicas totalmente embutidas em uma camada líquida de até vários micrômetros de espessura. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da Ciência dos Materiais, como o comportamento de nanomateriais em líquido e o estudo de amostras biológicas no ambiente líquido natural. A principal vantagem desta técnica é que ela fornece informações morfológicas em nanoescala sobre espécimes em líquido.Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque o carregamento do suporte da amostra e a aquisição da imagem não são tão simples quanto os feitos pela primeira vez com a microscopia eletrônica. Para iniciar o procedimento, em uma capela de fluxo laminar limpa, limpe uma lâmina de vidro de microscopia de luz com um tecido livre de fibras e etanol puro. Coloque a lâmina em um lenço de papel em uma placa de Petri com tampa.Para manipular os microchips de SiN, usando uma pinça revestida de carbono, segure o microchip firme, mas com cuidado nos lados longos, mantendo a membrana de SiN voltada para cima o tempo todo. Usando esta técnica, coloque cinco microchips sem espaçador e cinco microchips com espaçador de 200 nanômetros na lâmina de vidro. Feche a placa de Petri e leve os microchips a uma hotte.Colocar as micropastilhas num copo de acetona para HPLC com a membrana voltada para cima. Gire suavemente o béquer por dois minutos para remover a camada protetora, tomando cuidado para não virar os microchips. Em seguida, transfira rapidamente os microchips para um copo de etanol puro.Cubra o copo com papel alumínio. Agitar suavemente o copo durante dois minutos para terminar de remover o revestimento e trazê-lo numa placa de Petri fechada para a capela de fluxo laminar. Coloque os microchips em um lenço de papel fresco da sala limpa, tomando cuidado para não virar os microchips à medida que são liberados da pinça.Deixe os microchips secarem por alguns minutos. Em seguida, coloque os microchips na lâmina de vidro na placa de Petri. Feche a placa de Petri e leve os microchips para um limpador de plasma.Coloque a lâmina de vidro e os microchips no limpador de plasma e execute um programa de limpeza de cinco minutos para remover os hidrocarbonetos da membrana de SiN. Usando um microscópio de luz, inspecione os microchips em busca de membranas rompidas ou partículas de sujeira. Descarte microchips danificados ou sujos.Na capela de fluxo laminar, imobilize os microchips em uma caixa de transporte limpa com uma superfície interna pegajosa. Aplique uma gota de um microlitro de uma solução de nanopartículas de ouro aquoso estabilizada com citrato de três molares na membrana de SiN de cada microchip sem espaçador e deixe a solução secar. Em seguida, aplique um microlitro de água deionizada na membrana para remover o sal e os surfactantes.Após 30 segundos, use papel de filtro para enxugar cuidadosamente a água e deixar os microchips secarem. Coloque a ponta do suporte MET de fluxo de líquido sob um microscópio óptico binocular. Remova a tampa de titânio da ponta do suporte e coloque-a sobre uma folha de papel alumínio.Configure uma bomba de seringa microfluídica com uma seringa de vidro de um mililitro contendo 0,5 mililitros de água de grau HPLC. Conecte a seringa ao sistema de fluxo e ligue a bomba. À medida que a água é liberada pelo sistema, verifique se há vazamentos ou constrições de fluxo nas linhas.Quando o bombeamento estiver concluído, remova o enxágue do compartimento de células líquidas e seque a ponta do suporte com papel de filtro. Inspecione a ponta do suporte com o microscópio óptico. Seque a ponta com um lenço de papel na sala limpa e remova a poeira ou as fibras com uma pinça limpa revestida com PTFE.Inspecione a tampa da ponta do suporte, o O-ring e os parafusos e remova poeira ou fibras com pinças revestidas com PTFE. Coloque o O-ring nos grupos de suporte. Coloque o primeiro parafuso e gire-o algumas vezes para que ele fique.Com pinças curvas limpas, coloque o microchip de amostra no bolso da ponta do suporte com a membrana de SiN voltada para cima. Use o microscópio óptico binocular para verificar se o microchip está encaixado corretamente. Coloque uma gota de 0,3 microlitro de água filtrada pura no microchip de amostra.Segurando o microchip no lugar com uma pinça. Em seguida, pegue um microchip espaçador com pinças curvas de cabeça para baixo. Gire cuidadosamente a pinça para que a membrana do microchip fique voltada para baixo.Coloque o microchip espaçador no microchip de amostra. Coloque o material refletor de luz sob a ponta do suporte e verifique o alinhamento do microchip sob o microscópio de luz binocular. Use uma pinça para ajustar cuidadosamente os microchips se as janelas SiN estiverem desalinhadas.Em seguida, pegue a tampa da câmara da amostra com uma pinça. Vire a tampa de cabeça para baixo e, sem tocar nos microchips, apoie a parte traseira da tampa na ponta do suporte. Coloque o parafuso restante usando uma pinça e aperte os dois parafusos de forma iterativa.Aperte com cuidado até que encontrem resistência. As janelas podem quebrar facilmente se o aperto for muito forte. Inicie um fluxo de líquido de quatro microlitros por minuto através do sistema e verifique se há vazamentos na ponta do suporte.Em seguida, leve o suporte a uma estação de bombeamento de vácuo e faça uma verificação de vazamento. Certifique-se de que a pressão atinja pelo menos 10 elevado ao quinto mbar negativo em cinco minutos. Coloque o suporte em seu gabinete.E leve o suporte ao microscópio eletrônico. Configure o microscópio no modo STEM. Meça a densidade de corrente do feixe de elétrons com uma fina película de carbono revestida com nanopartículas de ouro como amostra de referência sem água.Inicie o fluxo de água pura a uma taxa não superior a dois microlitros por minuto. Insira o suporte MET de fluxo de líquido na trava de carga a vácuo e inicie a evacuação. Certifique-se de que a pressão diminui normalmente.Em seguida, insira o suporte TEM totalmente no microscópio. Quando a pressão estiver suficientemente baixa, abra a válvula de feixe e insira o detector ADF. Defina o microscópio para o modo de aquisição contínua e traduza o estágio da amostra nas direções X e Y para encontrar a janela SiN.Ajuste o contraste e o brilho para que as bordas da janela fiquem claramente visíveis. Traduza o palco nas direções X e Y para que um canto da janela fique no centro do campo de visão. Em seguida, reinicie a lente objetiva.Ajuste a posição vertical do estágio de amostra para focar grosseiramente o canto. Incline o palco em cinco graus para frente e para trás para verificar se a amostra está na altura eucêntrica. Centralize o canto da janela no campo de visão e armazene a posição do palco no software.Traduza o estágio nas direções X e Y até que as nanopartículas de ouro sejam visíveis. E então foque a lente objetiva. Observe a densidade da corrente e calcule a espessura da célula líquida.Traduzir o estágio nas direções X e Y para localizar uma área com pelo menos 20 nanopartículas de ouro. Defina os parâmetros e adquira uma imagem. Nanopartículas de ouro que são imobilizadas em uma membrana de nitreto de silício e fotografadas com STEM em fase líquida.Na água pura, as nanopartículas de ouro mantiveram sua forma durante a imagem. Os produtos de radiólise da água podem oxidar átomos de ouro individuais, o que pode eventualmente alterar a forma das nanopartículas. Em outro experimento, os íons cloreto são introduzidos na fase líquida.As nanopartículas de ouro se dissolveram lentamente durante o experimento à medida que os átomos de ouro oxidados formavam tetracloroaureata solúvel. Para investigar os movimentos das nanopartículas de ouro na água, no experimento subsequente, as nanopartículas não foram totalmente imobilizadas na membrana da amostra. As nanopartículas de ouro se aglomeraram e, ao atingir um tamanho crítico de aglomerado, saíram do campo de visão.Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em duas horas se for executada corretamente. Serão necessárias várias semanas de treinamento. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de trabalhar com calma e verificar a estanqueidade ao vácuo e a espessura do líquido.Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores em Ciência dos Materiais, Química e Biologia explorarem o crescimento e o movimento de nanopartículas em líquidos, a estrutura de materiais em nanoescala em ambientes líquidos e a funcionalidade de proteínas em células de mamíferos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar a microscopia eletrônica de transmissão de varredura de nanopartículas de ouro embutidas em uma camada de água, incluindo o carregamento correto do suporte da amostra e o ajuste do microscópio. Não se esqueça de que trabalhar com líquido no microscópio eletrônico pode causar danos se o suporte da amostra não for carregado corretamente.Portanto, é importante verificar se há vazamento de vácuo antes do carregamento.

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