Estudar processos dinâmicos de Nano porte Objects no líquido utilizando a Transmissão Microscopia Eletrônica de Varredura

O objetivo geral da microscopia eletrônica de transmissão de varredura em fase líquida é observar estruturas e fenômenos de nanomateriais em amostras biológicas totalmente embutidas em uma camada líquida de até vários micrômetros de espessura. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da Ciência dos Materiais, como o comportamento de nanomateriais em líquido e o estudo de amostras biológicas no ambiente líquido natural. A principal vantagem desta técnica é que ela fornece informações morfológicas em nanoescala sobre espécimes em líquido.

Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque o carregamento do suporte da amostra e a aquisição da imagem não são tão simples quanto os feitos pela primeira vez com a microscopia eletrônica. Para iniciar o procedimento, em uma capela de fluxo laminar limpa, limpe uma lâmina de vidro de microscopia de luz com um tecido livre de fibras e etanol puro. Coloque a lâmina em um lenço de papel em uma placa de Petri com tampa.

Para manipular os microchips de SiN, usando uma pinça revestida de carbono, segure o microchip firme, mas com cuidado nos lados longos, mantendo a membrana de SiN voltada para cima o tempo todo. Usando esta técnica, coloque cinco microchips sem espaçador e cinco microchips com espaçador de 200 nanômetros na lâmina de vidro. Feche a placa de Petri e leve os microchips a uma hotte.

Colocar as micropastilhas num copo de acetona para HPLC com a membrana voltada para cima. Gire suavemente o béquer por dois minutos para remover a camada protetora, tomando cuidado para não virar os microchips. Em seguida, transfira rapidamente os microchips para um copo de etanol puro.

Cubra o copo com papel alumínio. Agitar suavemente o copo durante dois minutos para terminar de remover o revestimento e trazê-lo numa placa de Petri fechada para a capela de fluxo laminar. Coloque os microchips em um lenço de papel fresco da sala limpa, tomando cuidado para não virar os microchips à medida que são liberados da pinça.

Deixe os microchips secarem por alguns minutos. Em seguida, coloque os microchips na lâmina de vidro na placa de Petri. Feche a placa de Petri e leve os microchips para um limpador de plasma.

Coloque a lâmina de vidro e os microchips no limpador de plasma e execute um programa de limpeza de cinco minutos para remover os hidrocarbonetos da membrana de SiN. Usando um microscópio de luz, inspecione os microchips em busca de membranas rompidas ou partículas de sujeira. Descarte microchips danificados ou sujos.

Na capela de fluxo laminar, imobilize os microchips em uma caixa de transporte limpa com uma superfície interna pegajosa. Aplique uma gota de um microlitro de uma solução de nanopartículas de ouro aquoso estabilizada com citrato de três molares na membrana de SiN de cada microchip sem espaçador e deixe a solução secar. Em seguida, aplique um microlitro de água deionizada na membrana para remover o sal e os surfactantes.

Após 30 segundos, use papel de filtro para enxugar cuidadosamente a água e deixar os microchips secarem. Coloque a ponta do suporte MET de fluxo de líquido sob um microscópio óptico binocular. Remova a tampa de titânio da ponta do suporte e coloque-a sobre uma folha de papel alumínio.

Configure uma bomba de seringa microfluídica com uma seringa de vidro de um mililitro contendo 0,5 mililitros de água de grau HPLC. Conecte a seringa ao sistema de fluxo e ligue a bomba. À medida que a água é liberada pelo sistema, verifique se há vazamentos ou constrições de fluxo nas linhas.

Quando o bombeamento estiver concluído, remova o enxágue do compartimento de células líquidas e seque a ponta do suporte com papel de filtro. Inspecione a ponta do suporte com o microscópio óptico. Seque a ponta com um lenço de papel na sala limpa e remova a poeira ou as fibras com uma pinça limpa revestida com PTFE.

Inspecione a tampa da ponta do suporte, o O-ring e os parafusos e remova poeira ou fibras com pinças revestidas com PTFE. Coloque o O-ring nos grupos de suporte. Coloque o primeiro parafuso e gire-o algumas vezes para que ele fique.

Com pinças curvas limpas, coloque o microchip de amostra no bolso da ponta do suporte com a membrana de SiN voltada para cima. Use o microscópio óptico binocular para verificar se o microchip está encaixado corretamente. Coloque uma gota de 0,3 microlitro de água filtrada pura no microchip de amostra.

Segurando o microchip no lugar com uma pinça. Em seguida, pegue um microchip espaçador com pinças curvas de cabeça para baixo. Gire cuidadosamente a pinça para que a membrana do microchip fique voltada para baixo.

Coloque o microchip espaçador no microchip de amostra. Coloque o material refletor de luz sob a ponta do suporte e verifique o alinhamento do microchip sob o microscópio de luz binocular. Use uma pinça para ajustar cuidadosamente os microchips se as janelas SiN estiverem desalinhadas.

Em seguida, pegue a tampa da câmara da amostra com uma pinça. Vire a tampa de cabeça para baixo e, sem tocar nos microchips, apoie a parte traseira da tampa na ponta do suporte. Coloque o parafuso restante usando uma pinça e aperte os dois parafusos de forma iterativa.

Aperte com cuidado até que encontrem resistência. As janelas podem quebrar facilmente se o aperto for muito forte. Inicie um fluxo de líquido de quatro microlitros por minuto através do sistema e verifique se há vazamentos na ponta do suporte.

Em seguida, leve o suporte a uma estação de bombeamento de vácuo e faça uma verificação de vazamento. Certifique-se de que a pressão atinja pelo menos 10 elevado ao quinto mbar negativo em cinco minutos. Coloque o suporte em seu gabinete.

E leve o suporte ao microscópio eletrônico. Configure o microscópio no modo STEM. Meça a densidade de corrente do feixe de elétrons com uma fina película de carbono revestida com nanopartículas de ouro como amostra de referência sem água.

Inicie o fluxo de água pura a uma taxa não superior a dois microlitros por minuto. Insira o suporte MET de fluxo de líquido na trava de carga a vácuo e inicie a evacuação. Certifique-se de que a pressão diminui normalmente.

Em seguida, insira o suporte TEM totalmente no microscópio. Quando a pressão estiver suficientemente baixa, abra a válvula de feixe e insira o detector ADF. Defina o microscópio para o modo de aquisição contínua e traduza o estágio da amostra nas direções X e Y para encontrar a janela SiN.

Ajuste o contraste e o brilho para que as bordas da janela fiquem claramente visíveis. Traduza o palco nas direções X e Y para que um canto da janela fique no centro do campo de visão. Em seguida, reinicie a lente objetiva.

Ajuste a posição vertical do estágio de amostra para focar grosseiramente o canto. Incline o palco em cinco graus para frente e para trás para verificar se a amostra está na altura eucêntrica. Centralize o canto da janela no campo de visão e armazene a posição do palco no software.

Traduza o estágio nas direções X e Y até que as nanopartículas de ouro sejam visíveis. E então foque a lente objetiva. Observe a densidade da corrente e calcule a espessura da célula líquida.

Traduzir o estágio nas direções X e Y para localizar uma área com pelo menos 20 nanopartículas de ouro. Defina os parâmetros e adquira uma imagem. Nanopartículas de ouro que são imobilizadas em uma membrana de nitreto de silício e fotografadas com STEM em fase líquida.

Na água pura, as nanopartículas de ouro mantiveram sua forma durante a imagem. Os produtos de radiólise da água podem oxidar átomos de ouro individuais, o que pode eventualmente alterar a forma das nanopartículas. Em outro experimento, os íons cloreto são introduzidos na fase líquida.

As nanopartículas de ouro se dissolveram lentamente durante o experimento à medida que os átomos de ouro oxidados formavam tetracloroaureata solúvel. Para investigar os movimentos das nanopartículas de ouro na água, no experimento subsequente, as nanopartículas não foram totalmente imobilizadas na membrana da amostra. As nanopartículas de ouro se aglomeraram e, ao atingir um tamanho crítico de aglomerado, saíram do campo de visão.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em duas horas se for executada corretamente. Serão necessárias várias semanas de treinamento. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de trabalhar com calma e verificar a estanqueidade ao vácuo e a espessura do líquido.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores em Ciência dos Materiais, Química e Biologia explorarem o crescimento e o movimento de nanopartículas em líquidos, a estrutura de materiais em nanoescala em ambientes líquidos e a funcionalidade de proteínas em células de mamíferos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar a microscopia eletrônica de transmissão de varredura de nanopartículas de ouro embutidas em uma camada de água, incluindo o carregamento correto do suporte da amostra e o ajuste do microscópio. Não se esqueça de que trabalhar com líquido no microscópio eletrônico pode causar danos se o suporte da amostra não for carregado corretamente.

Portanto, é importante verificar se há vazamento de vácuo antes do carregamento.