Provocando estresse celular e morte utilizando convencional UV laser microscopia confocal
3 de fevereiro de 2017
Manipulações direcionadas para causar estresse direcionado ou morte em células individuais têm sido relativamente difíceis de realizar. Aqui, uma abordagem de ablação com resolução de célula única para estressar e matar seletivamente células individuais em cultura de células e animais vivos é descrita com base em um laser UV confocal padrão.
O objetivo geral dessa abordagem de ablação celular é estressar ou matar seletivamente células individuais em cultura de células ou em animais vivos. Este método permite que os pesquisadores estudem o destino de uma única célula moribunda e a resposta das células, como micróglias e astrócitos, ao local de ablação circundante. A principal vantagem dessa técnica é o direcionamento preciso de células individuais, e isso pode ser alcançado com um microscópio confocal comum equipado com um laser de 405 nanômetros.
Usamos o peixe-zebra como um sistema modelo para estudar doenças neurodegenerativas, como doença do neurônio motor ou demência frontotemporal. Visualizar a morte de um neurônio motor e as consequências subsequentes oferece uma excelente oportunidade para entender melhor os processos dinâmicos envolvidos na doença. Nossa abordagem para infligir estresse celular de maneira dependente da dose permite a caracterização detalhada das interações celulares.
Por exemplo, depuração da microglia após morte nueronal. Embora esse método forneça informações sobre os mecanismos da doença de um organismo vivo, ele também pode ser aplicado de forma semelhante em células isoladas em cultura. Depois de configurar linhagens transgênicas masculinas e femininas para acasalamento de acordo com o protocolo de texto, use um filtro de chá de plástico para coletar embriões após a desova bem-sucedida, coando a água do tanque.
Em seguida, use água com ovo para enxaguar os ovos e transferi-los para a água com ovo em uma placa de Petri. Examine os embriões sob um microscópio de luz para determinar a fertilização. Em seguida, incube os ovos fertilizados a 28 graus Celsius.
Quando os embriões atingirem dois a cinco dias após a fertilização ou DPF, coloque-os sob um microscópio composto de fluorescência e faça a triagem dos embriões quanto à expressão apropriada de fluoróforo. Em seguida, separe os peixes com rótulos brilhantes em um prato fresco com água de ovo para posterior incorporação. Para incorporar o peixe-zebra na agarose, prepare uma solução anestésica adicionando quatro gramas por litro de MS 222 gota a gota a uma placa de Petri contendo água de ovo.
Prepare um caldo de agarose e água de ovo de baixo ponto de fusão e coloque-o em tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Coloque uma alíquota em um bloco de calor a 38 a 40 graus Celsius e deixe equilibrar. Para tempos de imagem superiores a quatro horas, pipete aproximadamente 300 microlitros de agarose ao longo do círculo interno de um prato com fundo de vidro para preparar um círculo em forma de rosquinha com uma pequena abertura no centro.
Para montar o peixe-zebra em agarose para microscopia, após anestesiar o peixe de acordo com o protocolo de texto, use uma pipeta ajustável para puxar uma larva e deixe-a afundar até o fundo da ponta. Coloque a larva em um volume mínimo de líquido na agarose pré-aquecida. Em seguida, retire o peixe com agarose e distribua-o rapidamente em um prato de 35 milímetros com fundo de vidro previamente preparado.
Sob um microscópio de dissecação, use um pincel padrão para posicionar o animal ou vários animais dentro da agarose de lado para que o corpo e a cauda fiquem planos. Deixe o peixe embutido descansar por 10 a 15 minutos até que a agarose esteja firmemente firme. Em seguida, use aproximadamente dois mililitros de água de ovo com tricaína para completar cuidadosamente a placa de Petri de 35 milímetros.
Coloque a placa de Petri com uma larva embutida no estágio do microscópio confocal e, usando iluminação de campo brilhante e ampliação de 40x, concentre-se no lado dorsal da medula espinhal do animal. Mude para uma configuração de fluorescência apropriada e visualize a estrutura de interesse para confirmar se todos os parâmetros de imagem são necessários para a ablação subsequente. Para determinar a espessura da estrutura para ablação a laser UV, use a unidade Z para verificar a parte superior e inferior da estrutura de interesse focando manualmente para cima e para baixo.
Registre manualmente o plano Z que será ablacionado. Por exemplo, o centro da célula. Para realizar a ablação a laser, inicie o Assistente FRAP clicando no menu suspenso na parte superior do menu do software.
Na nova janela, determine os parâmetros de imagem para a abordagem de ablação selecionando o formato, a velocidade de digitalização e a média. Se o plano Z para ablação ainda não tiver sido selecionado, pressione o botão Ao vivo e foque através da amostra até que a estrutura fluorescente ou o plano Z desejado a ser ablacionado esteja em foco. Depois que os parâmetros gerais da imagem forem definidos, acesse a etapa Bleach para controlar os componentes de ablação específicos.
Em seguida, acione o laser de 405 nanômetros ativando-o para o procedimento de branqueamento. Em seguida, use a opção Aumentar zoom para maximizar a intensidade do branqueamento no ROI selecionado, reduzindo o campo de varredura, maximizando assim o tempo de permanência. Selecione uma ou várias ROIs para a ablação usando qualquer uma das ferramentas de desenho na janela Aquisição de imagem.
Mire no outeiro do axônio, por exemplo, com a ferramenta de desenho circular de aproximadamente quatro a oito micrômetros. Depois de estabelecer o ROI, selecione o botão Time Course e confirme o número de ciclos em que os ROIs serão verificados e ablacionados. Escolha as molduras Pré-branqueamento e Pós-Branqueamento conforme desejado para permitir uma visão geral de toda a imagem imediatamente antes e imediatamente após o processo de branqueamento.
Essas configurações permitem aos pesquisadores várias camadas de refinamento. Através do ajuste da potência do laser, velocidade de varredura, média da linha, tamanho da região de interesse e repetições, essa técnica oferece um alto grau de liberdade para causar estresse ou morte em células individuais. Depois de estabelecer todos os parâmetros de ablação necessários, pressione Executar experimento e monitore a eficiência da ablação.
Consulte o protocolo de texto para obter detalhes adicionais. Neste experimento, a ablação a laser UV foi realizada em neurônios motores que expressam GFP na medula espinhal de peixe-zebra transgênico. A expressão de GFP impulsionada por promotores de neurônios motores, como 3 MINX one, IO one ou MET, permite a visualização de alta resolução dos corpos celulares, dos axônios principais e dos ramos periféricos que se estendem aos músculos.
A ablação bem-sucedida de neurônios na medula espinhal foi alcançada quando a fluorescência desaparece imediatamente após a ablação e nunca é retomada. A especificidade dessa abordagem é confirmada como mostrado aqui, onde um único neurônio alvo foi convertido usando o fotofluro fotoconversível Kaede que muda sua emissão de verde para vermelho após a exposição à luz ultravioleta. Para atingir células com diferentes intensidades, várias camadas de ajuste fino estão disponíveis ajustando a potência do laser, a velocidade de varredura, a média da linha, o tamanho da ROI a ser ablação e as repetições.
Como mostrado aqui, os neurônios motores com longas projeções axonais que foram ablacionados no soma com intensidades de laser UV mais baixas revelaram bolhas características que continuaram do soma ao longo do axônio ao longo do tempo. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que cada configuração confocal é única e que a potência do laser para cada instrumento é específica e pode ser diferente. Após o procedimento, características da morte celular apoptótica podem ser observadas nos neurônios ablacionados.
Marcadores apoptóticos, como XN 5, ou alterações morfológicas, como degeneração somal ou bolhas externas, podem ser detectados de forma reprodutível. Testes adicionais podem ser realizados para responder a outras perguntas, como como o desempenho da natação é afetado pela ablação de um ou vários neurônios na medula espinhal. Ao cruzar diferentes linhagens de peixe-zebra transgênico, os pesquisadores podem investigar a resposta de outras células à destruição celular induzida por laser.
Esses métodos fornecem uma plataforma experimental única para entender os mecanismos moleculares precisos de uma doença como a MND in vivo. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar o peixe-zebra para microscopia confocal e como realizar a ablação a laser UV de célula única.
Visão Geral
Este artigo descreve uma nova técnica de ablação com resolução em nível de célula única que permite aos pesquisadores estressar ou matar seletivamente células individuais em cultivo celular e em animais vivos. Utilizando um laser confocal UV padrão, este método fornece informações sobre as respostas e interações celulares após a morte celular direcionada.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Pesquisa em Doenças Neurodegenerativas
Antecedentes
- A manipulação direcionada de células individuais tem sido desafiadora.
- Compreender as respostas celulares ao estresse é crucial nas doenças neurodegenerativas.
- Microglia e astrócitos desempenham papéis significativos na resposta à morte neuronal.
- O peixe-zebra serve como um modelo eficaz para estudar esses processos.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método preciso para induzir estresse ou morte em células individuais.
- Estudar o destino das células em degeneração e as respostas celulares ao redor.
- Aprimorar a compreensão dos mecanismos das doenças neurodegenerativas.
Métodos Utilizados
- Uso de um microscópio confocal equipado com laser de 405 nm para ablação.
- Aplicação de uma abordagem dependente da dose para induzir estresse celular.
- Embutimento de larvas de peixe-zebra em agarose para imagem e ablação.
- Monitoramento das respostas celulares pós-ablação utilizando microscopia de fluorescência.
Resultados Principais
- Ablação bem-sucedida de neurônios motores em peixes-zebra transgênicos.
- O desaparecimento imediato da fluorescência após a ablação indica um direcionamento eficaz.
- Caracterização da eliminação por micróglias após a morte neuronal.
- Informações sobre os processos dinâmicos envolvidos em doenças neurodegenerativas.
Conclusões
- A técnica desenvolvida permite alta precisão no estudo das respostas individuais das células.
- Este método pode ser aplicado tanto em condições in vivo quanto in vitro.
- Pesquisas futuras podem aproveitar esta abordagem para explorar mecanismos de doenças.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este método permite a ablação precisa de células únicas dependente da dose, utilizando microscopia confocal convencional, oferecendo uma abordagem escalável para estudar respostas ao estresse celular e sinalização intercelular em modelos de doenças neurodegenerativas. Ao permitir a visualização em tempo real das reações de micróglias e astrócitos frente a lesões neuronais direcionadas, ele auxilia na redução de riscos mecanicistas durante a validação inicial de alvos e nos fluxos de trabalho de triagem fenotípica. A técnica aumenta a confiabilidade preditiva na identificação de compostos líderes, fornecendo leituras quantitativas e reprodutíveis da cinética de morte celular e da ativação glial em sistemas fisiologicamente relevantes.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas mediante a indução controlada de estresse celular em neurônios individuais dentro de tecido intacto.
- Valor Operacional: Oferece uma plataforma reprodutível para validação funcional de alvos, utilizando parâmetros de ablação dependentes de dose e tempo.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao vincular os resultados da morte celular única às respostas gliais downstream relevantes para vias neuroinflamatórias.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera leituras quantitativas baseadas em fluorescência da degeneração axonal e fragmentação celular para padronização de ensaios.
- Valor Operacional: Facilita a preparação para triagem de alto conteúdo por meio de parâmetros ajustáveis do laser (potência, velocidade de varredura, tamanho da região de interesse) para indução consistente de estresse.
- Escalabilidade: Permite a reutilização da plataforma em modelos de cultura celular e em peixes-zebra in vivo, sem necessidade de equipamentos especializados além de um sistema confocal equipado com laser de 405 nm.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Conecta observações da fase de descoberta com ablação de células isoladas à validação pré-clínica de mecanismos neurodegenerativos em peixe-zebra.
- Alinhamento de Biomarcadores: Apoia a avaliação da ativação de micróglias e da degeneração axonal como biomarcadores transponíveis de lesão neuronal.
- Avanço Ajustado ao Risco: Permite a redução de riscos mecanicistas ao caracterizar fenótipos de morte celular dependentes da dose e as respostas celulares ao redor antes dos testes com compostos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra aos fluxos de trabalho de descoberta inicial ao permitir estudos de ablação orientados por hipóteses que informam a confiança no alvo e a clarificação da via antes da otimização do composto líder.
- Biologia da Descoberta: Apoia a desmistificação mecanicista por meio da indução precisa e reprodutível de estresse celular para esclarecer as vias de morte celular e a dinâmica de ativação glial.
- Triagem: Fornece saídas quantitativas e resolvidas no tempo (por exemplo, perda de fluorescência, formação de bolhas, degeneração axonal) adequadas para análise automatizada baseada em imagens em triagens de compostos.
- Análises: Fornece dados de resposta à dose e de curso temporal que permitem comparação estatística de condições de ablacionamento e respostas celulares entre grupos experimentais.
- Pesquisa Translacional: Mantém a continuidade desde lesão em única célula em peixe-zebra até modelos fenotípicos de doenças neurodegenerativas, apoiando a validação de alvos alinhada a biomarcadores.
- Reutilização Corporativa: Funciona como uma capacidade reutilizável entre equipes de descoberta em neurociência, adaptável a diversos tipos celulares e modelos de doenças utilizando infraestrutura padrão de microscopia confocal.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a ambiguidade nos mecanismos de morte celular específicos e nas respostas gliais.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade e a padronização por meio do controle de parâmetros a laser e da compatibilidade com microscópios confocais convencionais.
- Valor Estratégico: Aprimora a tomada de decisões de seguir ou não seguir ao permitir a avaliação precoce do engajamento do alvo por meio de leituras fenotípicas de morte neuronal e neuroinflamação.
- Impacto na Carteira: Apoia a priorização ajustada ao risco ao gerar dados mecanísticos sobre morte celular dependente da dose e interações celulares downstream.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em microscopia confocal, manipulação de peixes-zebra e otimização de parâmetros de ablação baseada em fluorescência.
- Depende do acesso a um microscópio confocal equipado com laser de 405 nm e conjuntos de filtros apropriados para excitação no UV e detecção de emissão.
- Necessita padronização de potência do laser, velocidade de varredura, tamanho da região de interesse (ROI) e contagens de repetição entre usuários e sessões para obter resultados de ablação reprodutíveis.
- Requer adaptação dos protocolos de inclusão e de imagem ao aplicar o método em diferentes sistemas modelo (por exemplo, cultivo celular versus organismos intactos).
- As limitações práticas incluem a possível fototoxicidade além da região de interesse alvo e a variabilidade na saída do laser entre diferentes sistemas confocais, exigindo calibração específica para cada instrumento.
