Fabricação de dispositivos microfluídicos tridimensional baseados em papel para imunoensaios

O objetivo geral deste protocolo é demonstrar nosso processo de fabricação de dispositivos tridimensionais baseados em papel, que usamos como plataforma para desenvolver imunoensaios no local de atendimento. Este método fornece uma plataforma microfluídica baseada em papel com um processo de fabricação confiável, de modo que o tempo e o esforço possam ser direcionados para o desenvolvimento de ensaios em vez de projetar dispositivos. A principal vantagem de nossa técnica é que ela permite que muitos dispositivos sejam preparados em paralelo e na quantidade desejável para projetos de pesquisa acadêmica.

Geralmente, os novos usuários terão dificuldades com esse método porque há muitas variáveis a serem consideradas ao fabricar dispositivos, como o alinhamento adequado das camadas. Erros podem resultar em dispositivos com mau funcionamento. Uma demonstração visual desse método é fundamental porque a montagem pode ser difícil de imaginar usando apenas os detalhes fornecidos nos manuscritos.

Primeiro, prepare camadas de papel de filtro qualitativo cortando uma folha de papel em um tamanho de papel padrão para facilitar a padronização usando uma impressora de cera. Coloque uma folha de papel cortada na bandeja da impressora. Em seguida, imprima camadas projetadas anteriormente.

Em seguida, corte uma fileira de caldo de membrana de náilon em folhas usando um cortador de papel de mesa, tomando muito cuidado ao manusear a membrana de náilon para manter sua integridade e proteger contra rasgos. Armazene qualquer material não utilizado em um gabinete dessecador, pois as membranas de náilon são sensíveis à umidade. Usando uma impressora de cera, imprima um padrão de camada de captura em um pedaço de papel de cópia e cole-o em uma caixa de luz para servir como guia para o posicionamento da membrana de náilon.

Em seguida, coloque uma folha de papel de cópia em branco na folha de papel de cópia impressa anteriormente. Cole a folha de papel em branco na caixa de luz, mas não cole as duas folhas juntas. Agora, coloque uma folha cortada de membrana de náilon na folha limpa de papel de cópia, certificando-se de que a membrana cubra a área impressa da camada inferior de papel de cópia.

Cole todos os quatro lados da membrana de náilon na folha limpa de papel de cópia. Coloque uma folha de membrana de náilon suportada pelo papel de cópia afixado a ela na bandeja da impressora de alimentação manual. Em seguida, imprima uma folha de membrana de nylon de cada vez.

Cole as camadas impressas em uma moldura de acrílico para aquecimento uniforme acima e abaixo da camada quando colocada em um forno de convecção por gravidade. Agora, coloque as camadas no forno a 150 graus Celsius por 30 segundos até que a cera derreta na espessura do papel. Depois de retirar o papel do forno, confirme se a cera permeou a espessura do papel, virando-o e verificando se há imperfeições no desenho.

Remova o papel e a membrana de náilon da moldura de acrílico. Em seguida, remova a membrana de náilon da folha de suporte do papel de cópia usando um cortador de papel. Padronize folhas de dupla face de filmes adesivos usando um plotter de faca robótico com arquivos de design previamente preparados.

Em seguida, cole uma camada de papel padrão que precisa ser apoiada com adesivo em uma caixa de luz com o lado impresso voltado para baixo. Retire um lado do revestimento protetor da folha de padrão do adesivo. Pressione a folha de padrão de adesivo e a camada de papel juntas.

Em seguida, coloque o dispositivo parcialmente montado em uma tira protetora. Em seguida, passe o conjunto de duas camadas resultante por um laminador automatizado para pressionar completamente o adesivo e o papel, removendo quaisquer bolsas de ar das camadas adjacentes. Cole uma camada conjugada em uma moldura de acrílico de forma que a zona hidrofílica a ser tratada fique suspensa e não em contato com a moldura.

Adicione 2,5 microlitros de BSA e um X PBS à zona hidrofílica na camada conjugada. Depois de deixar a amostra secar em temperatura ambiente por dois minutos, seque-a a 65 graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, adicione cinco microlitros de cinco nanopartículas de ouro coloidal OD conjugadas ao anticorpo anti-beta hCG e repita o processo de secagem.

Cole uma camada de canal lateral em uma moldura de acrílico de forma que a zona hidrofílica a ser tratada fique suspensa e não entre em contato com a estrutura. Adicione 10 microlitros de agente bloqueador para tratar o canal lateral e, em seguida, repita o mesmo processo de secagem usado para a camada conjugada. Em seguida, cole uma camada de captura em uma moldura de acrílico de forma que a zona hidrofílica a ser tratada fique suspensa e não entre em contato com a moldura.

Trate a camada de captura com cinco microlitros de anticorpo anti-alfa hCG. Depois de deixar a amostra secar em temperatura ambiente por dois minutos, seque-a a 65 graus Celsius por oito minutos. Adicione dois microlitros de agente bloqueador e repita o mesmo processo de secagem usado para a camada de captura.

Cole a camada de lavagem na caixa de luz com o lado impresso voltado para cima. Se forem usados furos de alinhamento, remova-os das camadas subsequentes usando uma ferramenta de perfuração portátil. Remova a película protetora na parte de trás da camada de captura para expor o adesivo.

Alinhe a camada de captura acima da camada de lavagem usando os orifícios de alinhamento como guia, pressione as duas camadas juntas e evite tocar nas zonas hidrofílicas para minimizar a contaminação ou danos ao dispositivo. Em seguida, remova a película protetora na parte de trás da camada de incubação para expor o adesivo. Alinhe a camada de incubação acima da camada de captura e pressione-as juntas.

Continue adicionando camadas dessa maneira até que todas as camadas ativas sejam montadas. Agora, coloque o dispositivo parcialmente montado em uma tira protetora e fixe firmemente as camadas usando um laminador. Remova a película protetora na parte de trás da camada de lavagem e fixe a camada de borrão na parte inferior do dispositivo.

Após a laminação para concluir a montagem do dispositivo microfluídico tridimensional à base de papel, corte o número desejado de dispositivos de folhas de dispositivos totalmente montados usando uma tesoura. Adicione 20 microlitros de uma amostra de controle positivo de tampão hCG à zona hidrofílica na parte superior do dispositivo. Assim que a amostra for completamente absorvida pelo dispositivo, adicione 15 microlitros de tampão de lavagem.

Depois que a primeira alíquota do tampão de lavagem tiver penetrado completamente no dispositivo, adicione uma segunda alíquota de 15 microlitros de tampão de lavagem. Para revelar os resultados do ensaio, retire as três camadas superiores do dispositivo usando uma pinça para expor a camada de captura. O método de impressão em cera pode ser usado para formar barreiras hidrofóbicas dentro de dispositivos microfluídicos baseados em papel e produz vias fluídicas com dimensões reprodutíveis, o que é crítico para ensaios com desempenhos e tempos de duração repetíveis.

O desempenho do imunoensaio baseado em papel de hCG foi demonstrado pela realização de 35 ensaios positivos e 35 negativos em paralelo. O coeficiente de variação para cada conjunto de dados foi determinado em 1% para ensaios realizados com amostras negativas e 3% para ensaios realizados com amostras positivas. Um desalinhamento entre as camadas que compõem o canal de incubação e a zona de captura pode causar o desenvolvimento de um padrão irregular no sinal positivo, o que pode resultar em uma interpretação errônea do sinal qualitativo.

Se a cera não for impressa em quantidade suficiente ou não derreter completamente através da espessura do papel, a integridade das barreiras hidrofóbicas resultantes pode ser comprometida e levar a vazamentos dentro do dispositivo. Ensaios que demoram mais do que o esperado para serem concluídos podem indicar um mau funcionamento na fabricação de um dispositivo. Os dispositivos microfluídicos baseados em papel fornecem aos pesquisadores uma plataforma versátil para desenvolver testes analíticos de baixo custo no local de atendimento.

Embora existam várias aplicações, a abordagem que demonstramos aqui resulta em uma arquitetura geral de dispositivos para realizar imunoensaios, que são críticos na área da saúde. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de verificar se há imperfeições durante o processo de fabricação e antes de tratar as camadas com reagentes bioquímicos caros. Uma vez dominado, esse método, desde a impressão de camadas até a montagem de camadas tratadas, pode ser usado para preparar uma folha de imunoensaios funcionais em duas horas.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como fabricar dispositivos tridimensionais baseados em papel e se sentir confortável o suficiente para adaptar esta plataforma a outros tipos de ensaio de interesse.