Fabricação de dispositivos microfluídicos tridimensional baseados em papel para imunoensaios

O objetivo geral deste protocolo é demonstrar nosso processo de fabricação de dispositivos tridimensionais baseados em papel, que utilizamos como uma plataforma para desenvolver imunodosagens na linha de cuidado. Este método fornece uma plataforma de microfluídica em papel com um processo de fabricação confiável, de modo que o tempo e esforço possam ser direcionados ao desenvolvimento de ensaios em vez do projeto de dispositivos. A principal vantagem de nossa técnica é que ela permite a preparação simultânea de diversos dispositivos em quantidade desejável para projetos acadêmicos de pesquisa.

Em geral, novos usuários terão dificuldades com este método porque existem muitas variáveis a considerar durante a fabricação de dispositivos, como o alinhamento adequado das camadas. Erros podem resultar em dispositivos com mau funcionamento. Uma demonstração visual deste método é essencial, pois a montagem pode ser difícil de imaginar usando apenas os detalhes fornecidos nos artigos científicos.

Primeiro, prepare camadas de papel-filtro qualitativo cortando uma folha padrão de papel em um tamanho de papel comum para facilitar a confecção de padrões usando uma impressora a cera. Carregue uma folha cortada na bandeja da impressora. Em seguida, imprima as camadas previamente projetadas.

Em seguida, corte uma folha padrão de membrana de náilon em tiras usando um cortador de papel de mesa, tomando muito cuidado ao manusear a membrana de náilon para manter sua integridade e protegê-la contra rasgos. Armazene qualquer material não utilizado em um armário dessecador, pois as membranas de náilon são sensíveis à umidade. Usando uma impressora a cera, imprima um padrão de camada de captura em uma folha de papel sulfite e fixe-a com fita adesiva em uma caixa de luz para servir como guia para o posicionamento da membrana de náilon.

Em seguida, coloque uma folha limpa de papel sulfite sobre a folha de papel sulfite previamente impressa. Fixe a folha limpa de papel na caixa de luz com fita, mas não una as duas folhas com fita. Agora, posicione uma folha cortada de membrana de náilon sobre a folha limpa de papel sulfite, certificando-se de que a membrana cubra a área impressa da camada inferior do papel sulfite.

Fixe com fita adesiva os quatro lados da membrana de náilon em uma folha limpa de papel sulfite. Coloque uma folha de membrana de náilon apoiada no papel sulfite a ela fixado na bandeja de alimentação manual da impressora. Em seguida, imprima uma folha de membrana de náilon por vez.

Fixe com fita as camadas impressas em uma moldura de acrílico para garantir aquecimento uniforme acima e abaixo da camada ao ser colocada em uma estufa com convecção gravitacional. Agora, coloque as camadas na estufa a 150 graus Celsius por 30 segundos, até que a cera derreta e impregne toda a espessura do papel. Após remover o papel da estufa, confirme que a cera permeou completamente a espessura do papel virando-o e verificando imperfeições no desenho.

Remova o papel e a membrana de náilon do quadro de acrílico. Em seguida, remova a membrana de náilon da folha de suporte de papel sulfite usando um cortador de papel. Recorte folhas duplas de filmes adesivos usando um plotter de faca robótica com arquivos de design previamente preparados.

Em seguida, fixe com fita uma camada de papel com o padrão, que precisa ser revestida com adesivo, sobre uma caixa de luz com o lado impresso voltado para baixo. Remova um lado da camada de proteção do adesivo do papel com o padrão. Pressione o papel com o adesivo e a camada de papel juntos.

Em seguida, coloque o dispositivo parcialmente montado em um invólucro protetor. Depois, passe a montagem resultante de duas camadas por um laminador automatizado para prensar completamente o adesivo e o papel, removendo quaisquer bolsas de ar das camadas unidas. Fixe uma camada de conjugado em uma moldura de acrílico de modo que a zona hidrofílica a ser tratada fique suspensa e sem contato com a moldura.

Adicione 2,5 microlitros de BSA e um X PBS à zona hidrofílica na camada de conjugado. Após deixar a amostra secar à temperatura ambiente por dois minutos, seque-a a 65 graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, adicione cinco microlitros de nanopartículas coloidais de ouro de cinco OD conjugadas ao anticorpo anti-beta hCG e repita o processo de secagem.

Fixe com fita uma camada de canal lateral em um quadro de acrílico de forma que a zona hidrofílica a ser tratada fique suspensa e sem contato com o quadro. Adicione 10 microlitros de agente bloqueador para tratar o canal lateral e, em seguida, repita o mesmo processo de secagem utilizado para a camada de conjugado. Em seguida, fixe com fita uma camada de captura em um quadro de acrílico de forma que a zona hidrofílica a ser tratada fique suspensa e sem contato com o quadro.

Trate a camada de captura com cinco microlitros de anticorpo anti-alfa hCG. Após deixar a amostra secar à temperatura ambiente por dois minutos, seque-a a 65 graus Celsius por oito minutos. Adicione dois microlitros de agente bloqueador, depois repita o mesmo processo de secagem utilizado para a camada de captura.

Fixe a camada de lavagem na caixa de luz com o lado impresso voltado para cima. Se forem utilizados furos de alinhamento, remova-os das camadas subsequentes usando uma furadeira manual. Remova o filme protetor da parte traseira da camada de captura para expor a cola.

Alinhe a camada de captura acima da camada de lavagem utilizando os orifícios de alinhamento como guia, em seguida pressione as duas camadas juntas e evite tocar nas zonas hidrofílicas para minimizar contaminação ou danos ao dispositivo. Após isso, remova o filme protetor na parte traseira da camada de incubação para expor a camada adesiva. Alinhe a camada de incubação acima da camada de captura e pressione-as juntas.

Continue adicionando camadas dessa maneira até que todas as camadas ativas sejam montadas. Agora, coloque o dispositivo parcialmente montado em um invólucro protetor e una firmemente as camadas utilizando um laminador. Remova o filme protetor na parte traseira da camada de lavagem e fixe a camada de blot na parte inferior do dispositivo.

Após a laminação para completar a montagem do dispositivo microfluídico tridimensional baseado em papel, recorte o número desejado de dispositivos das folhas de dispositivos totalmente montados usando tesoura. Adicione 20 microlitros de uma amostra de controle positivo de tampão hCG à zona hidrofílica na parte superior do dispositivo. Uma vez que a amostra tenha sido totalmente absorvida pelo dispositivo, adicione 15 microlitros de tampão de lavagem.

Após a primeira alíquota do tampão de lavagem ter penetrado completamente no dispositivo, adicione uma segunda alíquota de 15 microlitros de tampão de lavagem. Para revelar os resultados do ensaio, remova com pinça as três camadas superiores do dispositivo, expondo a camada de captura. O método de impressão em cera pode ser utilizado para formar barreiras hidrofóbicas em dispositivos microfluídicos baseados em papel e produz caminhos fluídicos com dimensões reprodutíveis, o que é essencial para ensaios com desempenhos e tempos de duração repetíveis.

O desempenho do imunossensa de hCG baseado em papel foi demonstrado realizando-se 35 testes positivos e 35 negativos em paralelo. O coeficiente de variação para cada conjunto de dados foi determinado como sendo 1% para testes realizados com amostras negativas e 3% para testes realizados com amostras positivas. Um desalinhamento entre as camadas que compõem o canal de incubação e a zona de captura pode causar o desenvolvimento de um padrão irregular no sinal positivo, o que pode resultar em uma interpretação incorreta do sinal qualitativo.

Se a cera não for impressa em quantidade suficiente ou não for deixada derreter completamente ao longo da espessura do papel, a integridade das barreiras hidrofóbicas resultantes poderá ser comprometida, levando a vazamentos no dispositivo. Ensaios que demorem mais do que o esperado para serem concluídos podem indicar um mau funcionamento na fabricação de um dispositivo. Dispositivos microfluídicos baseados em papel oferecem aos pesquisadores uma plataforma versátil para o desenvolvimento de testes analíticos de baixo custo e diagnóstico próximo ao local de atendimento.

Embora existam diversas aplicações, a abordagem que demonstramos aqui resulta em uma arquitetura geral de dispositivo para realizar imunoensaios, que são essenciais na área da saúde. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de verificar imperfeições durante o processo de fabricação e antes de tratar as camadas com reagentes bioquímicos caros. Uma vez dominado, este método, desde a impressão das camadas até a montagem das camadas tratadas, pode ser usado para preparar uma folha de imunoensaios funcionais em duas horas.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como fabricar dispositivos tridimensionais baseados em papel e estar suficientemente confortável para adaptar esta plataforma a outros tipos de ensaio de interesse.