Camada por camada de colágeno Deposição em microfluídicos para Microtissue Estabilização
29 de setembro de 2015
A criação de microtecidos funcionais dentro de dispositivos microfluídicos requer a estabilização dos fenótipos celulares, adaptando as técnicas tradicionais de cultura celular às dimensões espaciais limitadas em microdispositivos. A modificação do colágeno permite a deposição camada por camada de conjuntos de colágeno ultrafinos que podem estabilizar células primárias, como hepatócitos, como modelos de tecido microfluídico.
O objetivo geral deste procedimento é depositar uma fina camada de colágeno sobre células em um dispositivo microfluídico. Isso é realizado primeiramente modificando o colágeno nativo acidificado por meio de metilação, para criar moléculas de colágeno com carga líquida positiva. O segundo passo consiste em modificar o colágeno nativo acidificado por meio de acetilação, para criar moléculas de colágeno com carga líquida negativa.
Em seguida, os dispositivos microfluídicos são preparados e semeados com hepatócitos, que são deixados aderirem e espalharem-se durante a noite. O passo final consiste em depositar a montagem de colágeno expondo alternadamente as células às soluções de colágeno com carga positiva e negativa, para criar 10 bicamadas de colágeno sobre a camada celular. Por fim, microscopia de contraste de fase e imunofluorescência, bem como ensaios de albumina e ureia, são utilizadas para demonstrar o desenvolvimento e a manutenção da polaridade celular e da função secretória.
As principais vantagens desta técnica são que ela permite o cultivo de hepatócitos em dispositivos microfluídicos utilizando métodos semelhantes aos aplicados em cultivos em placas há mais de 20 anos. Ela não exige designs complexos de dispositivos e a matriz depositada é muito fina, na ordem de 100 nanômetros. Tivemos pela primeira vez a ideia deste método durante uma sessão de brainstorming sobre como traduzir técnicas de cultivo de células do tipo Capy de placas para dispositivos microfluídicos.
O método do sanduíche de colágeno funciona em sistemas microscópicos com topo aberto, mas os hidrogéis utilizados são incompatíveis com dispositivos microfluídicos fechados que possuem alturas de canal limitadas. Dilua 100 miligramas de uma solução nativa de colágeno acidificada até uma concentração de 0,5 miligrama por mililitro com água estéril gelada, e coloque a solução em gelo para prevenir a alação. Em seguida, ajuste o pH da solução de colágeno entre nove e 10 com algumas gotas de hidróxido de sódio 1 normal e agite suavemente a solução à temperatura ambiente por 30 minutos.
À medida que o colágeno precipita, a solução começará a ficar turva; centrifugue a solução de colágeno precipitado a 3000 vezes G durante 25 minutos. Após esse tempo, um precipitado claro, semelhante a um gel, deverá ser visível no fundo dos tubos; aspire o sobrenadante e, em seguida, ressuspenda o colágeno precipitado em 200 mililitros de metanol com ácido clorídrico 0,1 normal. Deixe a reação de metilação ocorrer sob agitação à temperatura ambiente por quatro dias. Após a metilação, centrifugue a solução a 3000 vezes G durante 25 minutos para obter o colágeno metilado em pellet; então aspire e descarte o sobrenadante de metanol acidificado. Em seguida, dissolva o colágeno metilado em 25 mililitros de PBS estéril e filtre a solução através de um filtro de células de 60 mícrons.
Ajuste o pH da solução para 7,3 a 7,4 usando incrementos de 20 microlitros de hidróxido de sódio 1 N. Avalie a concentração da solução de colágeno utilizando um kit comercial de ELISA para colágeno de rato ou um kit de ensaio de hidroxiprolina. Em seguida, dilua a solução até três miligramas por mililitro com PBS estéril.
Esterilize a solução de colágeno metilado transferindo-a para um frasco de vidro com tampa rosqueável. Adicione cuidadosamente três mililitros de clorofórmio no fundo do frasco e deixe o frasco em repouso durante a noite a quatro graus Celsius. Na manhã seguinte.
Separe, assepticamente, a camada superior de colágeno metilado. Armazene o colágeno metilado a quatro graus Celsius e utilize-o dentro de um mês. Dilua outros 100 miligramas de solução nativa de colágeno acidificado até uma concentração de 0,5 miligrama por mililitro com água fria, gelada e estéril, e coloque a solução no gelo para evitar desnaturação; conforme mostrado anteriormente, ajuste o pH da solução de colágeno com hidróxido de sódio e agite a solução à temperatura ambiente para precipitar o colágeno.
Em seguida, dissolva 40 miligramas de anidrido hexaftálico em 10 mililitros de acetona. Adicione lentamente esta mistura à solução de colágeno em incrementos de 0,5 mililitro, sob agitação e monitoramento contínuo do pH da solução. Mantenha o pH acima de 9,0 adicionando uma ou duas gotas de hidróxido de sódio 1 N sempre que o pH se aproximar de 9,0, com agitação contínua à temperatura ambiente por 120 minutos.
Após adicionar todas as seis soluções de cianeto e hidreto, observe a mistura tornar-se límpida à medida que o colágeno succinato se dissolve; continue verificando periodicamente o pH para garantir que permaneça acima de 9,0. Quando todo o colágeno succinato tiver se dissolvido, ajuste o pH da solução para 4,0 usando incrementos de 20 microlitros de ácido clorídrico 1 normal. Observe a solução turvar novamente à medida que o colágeno succinato precipita.
Em seguida, centrifugue a solução a 3000 vezes G por 25 minutos. Para obter o precipitado de colágeno succinato asbury e descartar o sobrenadante acidificado com anidrido snic inativo, dissolva o colágeno succinato com pipetagem repetida em 25 mililitros de PBS estéril, obtendo uma concentração final de aproximadamente três miligramas por mililitro. Em seguida, filtre a solução através de um filtro celular de 60 mícrons e, então, ajuste o pH da solução entre 7,3 e 7,4.
Usando incrementos de 20 microlitros de hidróxido de sódio normal, avalie a concentração da solução utilizando um kit comercial de ELIZA de colágeno de rato ou um kit de ensaio de hidroxiprolina. Em seguida, dilua a solução até três miligramas por mililitro. Utilizando PBS estéril, esterilize esta solução de colágeno da mesma forma que a solução de colágeno metilado.
Inicie fabricando um dispositivo microfluídico utilizando técnica padrão que possua câmaras de cultura celular com canais de 100 micrômetros de altura, 0,4 a 1,5 milímetros de largura e um a 10 milímetros de comprimento para o crescimento celular. Utilize um limpador de plasma para oxidar as superfícies do dispositivo e de uma lâmina de vidro. Em seguida, pressione os dois juntos para formar uma ligação.
Após esterilizar o dispositivo mediante exposição à luz UV por pelo menos 30 minutos, preencha a câmara com 15 microgramas por mililitro de fibronectina em PBS estéril e incube a 37 graus Celsius por 45 minutos. Em seguida, semeie o dispositivo com células conforme descrito no protocolo textual complementar.
No interior de uma cabine de fluxo laminar, prepare volumes suficientes das soluções de colágeno metilado e desmetilado para 10 aplicações de cada solução por dispositivo, bem como alguns mililitros extras de meio. Mantenha as soluções em gelo. Alterne a lavagem dos dispositivos com 20 microlitros da solução de colágeno metilado e, em seguida, da solução de colágeno desmetilado.
Aguarde um minuto entre cada aplicação. Lave o dispositivo um total de 10 vezes por solução. Trabalhe rapidamente para minimizar o tempo em que as células ficam sem meio durante o crescimento das camadas de colágeno; é possível observar lentamente o acúmulo de colágeno na entrada e na saída do dispositivo microfluídico.
Se a resistência ao fluxo de fluido aumentar, lave o dispositivo uma ou duas vezes com meio e, em seguida, continue a aplicação das camadas. Após aplicar todas as camadas, enxágue o dispositivo duas vezes com meio fresco e retorne-o ao incubador. A metilação e a acetilação alteram as características de carga das moléculas de colágeno.
A ação remove grupos carregados positivamente e os substitui por grupos carregados negativamente, enquanto a metilação remove grupos carregados negativamente, criando moléculas com carga líquida positiva, permitindo a deposição camada por camada das duas variantes de colágeno sobre superfícies carregadas, como as células. Hepatócitos primários semeados sobre vidro recoberto com fibronectina dentro de um dispositivo microfluídico podem ser revestidos com esse sistema camada por camada. A montagem da matriz de colágeno, com a deposição de 10 bicamadas sobre as células, cria uma espessura da camada de colágeno de aproximadamente 140 nanômetros; hepatócitos sem uma camada superior de colágeno camada por camada.
As matrizes perdem seu fenótipo diferenciado, contraem e destacam-se da superfície de dispositivos microfluídicos ao longo do tempo. Em contraste, hepatócitos revestidos com uma montagem de colágeno ultrafina mantêm sua morfologia diferenciada, uma viabilidade superior a 90% e polarização por mais de 14 dias. Além da viabilidade celular, morfologia e polarização, a técnica de camadas sucessivas de colágeno também recupera e estabiliza a função de hepatócitos primários, conforme indicado aqui. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como metilar e succinilar o colágeno para criar soluções de colágeno com carga líquida positiva e negativa, respectivamente, e como utilizá-las na deposição em camadas para criar montagens finas de colágeno sobre células em dispositivos microfluídicos.
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Visão Geral
Este estudo concentra-se na deposição de uma fina camada de colágeno sobre células dentro de um dispositivo microfluídico para estabilizar os fenótipos celulares. O método envolve a modificação do colágeno para criar moléculas com cargas positivas e negativas, que são depositadas alternadamente para formar uma estrutura multilamelar.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Microfluídica
- Cultura celular
- Engenharia de tecidos
Contexto
- Os microtecidos são essenciais para imitar as funções dos órgãos.
- A estabilização dos fenótipos celulares é crucial em aplicações microfluídicas.
- O colágeno é um componente fundamental na engenharia de tecidos.
- Técnicas de deposição camada por camada aprimoram a funcionalidade celular.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método para deposição de montagem de colágeno em dispositivos microfluídicos.
- Estabilizar células primárias, como hepatócitos, para modelagem de tecidos.
- Avaliar a polaridade celular e as funções secretoras após a deposição.
Métodos Utilizados
- Modificação do colágeno nativo por meio de metilação e ação.
- Preparação de dispositivos microfluídicos e semeadura com hepatócitos.
- Deposição em camadas de colágeno mediante exposição alternada das células a soluções carregadas.
- Uso de microscopia de fase e imunofluorescência, juntamente com ensaios de albumina e ureia.
Resultados Principais
- Deposição bem-sucedida de 10 bicamadas de colágeno sobre hepatócitos.
- Comprovação da manutenção da polaridade celular.
- Confirmação da função secretora dos hepatócitos por meio de ensaios.
- Visualização da integridade estrutural utilizando técnicas de microscopia.
Conclusões
- O método estabiliza efetivamente os fenótipos celulares em microdispositivos.
- A deposição de colágeno camada por camada melhora a funcionalidade do modelo tecidual.
- Essa abordagem pode ser aplicada a outros tipos celulares para diversas aplicações.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Estabilizar a morfologia e a função de hepatócitos primários em dispositivos microfluídicos continua sendo um desafio crítico para a modelagem de tecidos hepáticos e estudos de metabolismo de fármacos. Essa técnica de deposição colágena em camadas permite o cultivo de microtecidos em longo prazo ao criar matrizes ultrfinas e biocompatíveis que recapitulam aspectos-chave da matriz extracelular nativa. Ao sustentar fenótipos diferenciados por mais de 14 dias, o método melhora a confiabilidade preditiva dos ensaios pré-clínicos baseados em hepatócitos, reduzindo a variabilidade biológica que pode comprometer a identificação de compostos promissores e os resultados dos testes de segurança.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de vias específicas de hepatócitos ao manter a morfologia polarizada e a função secretora essenciais para a validação de alvos em modelos de doenças hepáticas.
- Valor Operacional: Reduz a deriva fenotípica durante o cultivo, aumentando a reprodutibilidade de leituras funcionais utilizadas para reduzir riscos em hipóteses mecanicistas.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Produz plataformas microfluídicas padronizadas revestidas com colágeno que suportam ensaios quantitativos de albumina e ureia para triagem consistente de compostos.
- Valor Operacional: Compatível com fluxos de trabalho existentes de fabricação microfluídica, permitindo integração escalável em sistemas automatizados de triagem sem necessidade de reprojeto complexo do dispositivo.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Mantém a diferenciação e a função dos hepatócitos por mais de duas semanas, apoiando a continuidade pré-clínica desde estudos de descoberta até estudos de toxicologia.
- Valor Operacional: Amplia a janela útil para avaliação longitudinal de biomarcadores de lesão hepática induzida por fármacos (DILI) em modelos de tecidos microfluídicos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta ao permitir culturas estáveis de hepatócitos que apoiam o desenvolvimento inicial de ensaios e a validação pré-clínica de terapêuticas direcionadas ao fígado.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses ao preservar a polaridade e a função dos hepatócitos, aspectos essenciais para avaliar o engajamento do alvo em vias metabólicas.
- Triagem: Fornece leituras quantitativas reprodutíveis por meio da secreção de albumina e ureia, facilitando a avaliação confiável de compostos em formatos de microtecidos.
- Análises: Gera parâmetros funcionais que permitem comparação entre diferentes condições da saúde hepática e da atividade metabólica dos hepatócitos.
- Pesquisa Translacional: Conecta as fases de descoberta e pré-clínica ao estabilizar fenótipos necessários para modelagem relevante a doenças.
- Reutilização Empresarial: Representa uma técnica adaptável de modificação de superfície aplicável em diversas plataformas microfluídicas e tipos celulares.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva por meio da manutenção do fenótipo e função de hepatócitos diferenciados durante períodos prolongados de cultivo.
- Valor Operacional: Padronização e reprodutibilidade por meio de camadas ultradelgadas de colágeno depositadas com precisão, que minimizam a variabilidade entre lotes.
- Valor Estratégico: Melhoria nas decisões de prosseguimento ou interrupção com base na redução de falsos negativos provenientes de células desdiferenciadas em triagens de toxicidade hepática.
- Impacto sobre o Portfólio: Priorização ajustada ao risco de candidatos com base em leituras funcionais estáveis e de longo prazo provenientes de modelos hepáticos microfluídicos.
Considerações de Implementação
- É necessária experiência em química do colágeno e preparação de dispositivos microfluídicos para as etapas de metilação e succinação.
- É necessário ter acesso a infraestrutura de centrifugação, controle de pH e filtração estéril para a modificação do colágeno.
- A padronização entre equipes depende do tempo consistente de camadas e do manuseio das soluções para garantir um depósito uniforme de filme fino.
- O ajuste para outros tipos celulares requer a validação da compatibilidade do colágeno e do impacto na estabilidade do fenótipo.
- As limitações práticas incluem a incompatibilidade dos hidrogéis com dispositivos microfluídicos fechados que possuem alturas de canal limitadas, conforme observado na fonte.
