Camada por camada de colágeno Deposição em microfluídicos para Microtissue Estabilização

O objetivo geral deste procedimento é depositar um fino conjunto de colágeno nas células em um dispositivo microfluídico. Isso é feito modificando primeiro o colágeno nativo acidificado por meio da metilação para criar moléculas líquidas de colágeno carregadas positivamente. O segundo passo é modificar o colágeno nativo acidificado por meio da ação para criar moléculas de colágeno carregadas negativamente.

Em seguida, os dispositivos microfluídicos são preparados e semeados com hepatócitos, que podem se fixar e se espalhar durante a noite. A etapa final é depositar o conjunto de colágeno expondo alternadamente as células às soluções de colágeno carregadas positiva e negativamente para criar 10 bicamadas de colágeno no topo da camada celular. Em última análise, microscopia de fase e imunofluorescência e ensaios de albumina e ureia são usados para mostrar o desenvolvimento e manutenção da polaridade celular e da função secretora.

As principais vantagens dessa técnica são que ela permite o cultivo de hepatócitos em microdispositivos usando técnicas semelhantes às aplicadas em culturas de placas há mais de 20 anos. Não requer projetos de dispositivos complexos e a matriz depositada é muito fina na ordem de 100 nanômetros. Tivemos a ideia desse método pela primeira vez durante um brainstorming sobre como traduzir as técnicas de cultura de células Capy de placas para dispositivos microfluídicos.

Os métodos sanduíche de colágeno funcionam em sistemas microscópicos abertos, mas os hidrogéis utilizados são incompatíveis com microdispositivos fechados com alturas de canal limitadas. Dilua 100 miligramas de uma solução de colágeno acidificado nativo a uma concentração de 0,5 miligramas por mililitro com gelo, água fria e estéril e coloque a solução no gelo para evitar a alação. Em seguida, ajuste o pH da solução de colágeno para entre nove e 10 com algumas gotas de um hidróxido de sódio normal e mexa suavemente a solução em temperatura ambiente por 30 minutos.

À medida que o colágeno precipita, a solução começará a ficar turva, gire para baixo a solução de colágeno precipitada que 3000 vezes G por 25 minutos. Depois, um precipitado transparente semelhante a gel deve ser visível no fundo dos tubos, aspirar o sarcástico e, em seguida, ressuspender o colágeno precipitado em 200 mililitros de metanol com ácido clorídrico normal 0,1 permitir que a reação de metilação ocorra enquanto agita à temperatura ambiente por quatro dias após a centrífuga de metilação, a solução a 3000 vezes G por 25 minutos para granular o colágeno metilado, Em seguida, aspirar e eliminar o supinato de metanol acidificado. Em seguida, dissolva o colágeno metilado em 25 mililitros de PBS estéril e filtre a solução através de um filtro de células de 60 mícrons.

Ajustar o pH da solução para 7,3 a 7,4 utilizando incrementos de 20 microlitros de um hidróxido de sódio normal. Avalie a concentração da solução de colágeno usando um kit comercial de colágeno de rato ELIZA ou um kit de ensaio de hidroxiprolina. Em seguida, dilua a solução para três miligramas por mililitro com PBS estéril.

Esterilize a solução de colágeno metilado transferindo-a para um frasco de vidro com tampa de rosca. Colocando cuidadosamente três mililitros de clorofórmio no fundo da garrafa e permitindo que a garrafa endureça durante a noite a quatro graus Celsius. Na manhã seguinte.

Assepicamente, remova a camada superior de colágeno metilado. Armazene o colágeno metilado a quatro graus Celsius e use-o dentro de um mês. Dilua mais 100 miligramas de solução de colágeno acidificado nativo a uma concentração de 0,5 miligramas por mililitro com gelo, água fria e estéril e coloque a solução no gelo para evitar a dação como mostrado anteriormente, ajuste o pH da solução de colágeno com hidróxido de sódio e agite a solução em temperatura ambiente para precipitar o colágeno.

Em seguida, dissolva 40 miligramas de seis anidrido cínico em 10 mililitros de acetona. Adicione lentamente esta mistura em incrementos de 0,5 mililitro à solução de colágeno enquanto mexe e monitora continuamente o pH da solução. Mantenha o pH acima de 9,0 adicionando uma ou duas gotas de um hidróxido de sódio normal à medida que o pH se aproxima de 9,0, mexendo continuamente à temperatura ambiente por 120 minutos.

Depois de adicionar todas as seis soluções cínicas e hidretadas, observe a mistura ficar clara à medida que o colágeno succinato se dissolve, continue a verificar periodicamente o pH para garantir que permaneça acima de 9,0. Quando todo o colágeno succinato estiver dissolvido, ajuste o pH da solução para 4,0 usando incrementos de 20 microlitros de um ácido clorídrico normal. Observe a solução, torne-se turva novamente à medida que o colágeno succinato precipita.

Em seguida, centrifugue a solução a 3000 vezes G durante 25 minutos. Para pellet o succinato de colágeno asbury e descartar o snat acidificado com anidrido snic não reativo, dissolva o succinato de colágeno com pipetagem repetida em 25 mililitros de PBS estéril, dando uma concentração final de aproximadamente três miligramas por mililitro. Em seguida, filtre a solução através de um filtro de células de 60 mícrons e, em seguida, ajuste o pH da solução para entre 7,3 e 7,4.

Usando incrementos de 20 microlitros de um hidróxido de sódio normal, avalie a concentração da solução usando um kit ELIZA de colágeno comercial de rato ou um kit de ensaio de hidroxiprolina. Em seguida, diluir a solução para três miligramas por mililitro. Usando PBS estéril, esterilize esta solução de colágeno adiado da mesma forma que a solução de colágeno metilado.

Comece fabricando um dispositivo microfluídico usando a técnica padrão que possui câmaras de cultura de células com canais de 100 mícrons de altura, 0,4 a 1,5 milímetros de largura e canais de um a 10 milímetros de comprimento para o crescimento celular. Use um limpador de plasma para oxidar as superfícies do dispositivo e uma lâmina de vidro. Em seguida, pressione os dois juntos para formar um vínculo.

Após esterilizar o dispositivo por exposição à luz ultravioleta por pelo menos 30 minutos. Encha a câmara com 15 microgramas por mililitro, fibronectina em PBS estéril e incube a 37 graus Celsius por 45 minutos. Em seguida, consulte o dispositivo com células, conforme descrito no protocolo de texto que acompanha.

Em uma capela de cultura de tecidos de fluxo laminar, prepare volumes suficientes de soluções de colágeno metilado e ado para 10 aplicações de cada solução por dispositivo, bem como alguns mililitros extremos de meio. Mantenha as soluções no gelo. Alterne a lavagem dos dispositivos com 20 microlitros de soluções de colágeno metilado e depois acondicionado.

Aguardando um minuto entre cada aplicação. Lave o dispositivo um total de 10 vezes por solução. Trabalhe rapidamente para minimizar a quantidade de tempo que as células ficam sem meio enquanto crescem as camadas de colágeno, é possível observar o colágeno se acumular lentamente na entrada e saída do dispositivo microfluídico.

Se a resistência ao fluxo de fluido aumentar, lave o dispositivo uma ou duas vezes com mídia e continue a estratificação. Depois de aplicar todas as camadas, enxágue o dispositivo duas vezes com meio novo e retorne à incubadora. A metilação e a ação alteram as características de carga das moléculas de colágeno.

A ação remove grupos carregados positivamente e os substitui por grupos carregados negativamente, e a metilação remove grupos carregados negativamente, criando moléculas carregadas positivamente, permitindo a deposição camada por camada das duas variantes de colágeno no topo de superfícies carregadas, como células. Os hepatócitos primários semeados em vidro revestido com fibronectina dentro de um dispositivo microfluídico podem ser revestidos com essa camada por camada. A montagem da matriz de colágeno, a deposição de 10 bicamadas nas células cria uma espessura de camada de colágeno de aproximadamente 140 nanômetros de hepatócitos sem um colágeno superior camada por camada.

A matriz perde seu fenótipo diferenciado, contrai e se levanta da superfície dos dispositivos microfluídicos ao longo do tempo. Em contraste, os hepatócitos recobertos por um conjunto de colágeno ultrafino mantêm sua morfologia diferenciada, uma viabilidade superior a 90% e polarização ao longo de 14 dias. Além da morfologia e polarização da viabilidade celular, a técnica de colágeno camada por camada também recupera e estabiliza a função dos hepatócitos primários, conforme indicado aqui, Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como metilar e succinar o colágeno para criar soluções líquidas de colágeno carregadas positiva e negativamente e como usá-las na deposição camada por camada para criar conjuntos finos de colágeno no topo das células em dispositivos microfluídicos.