Name: Análise ambiental de Aeromonas hydrophilae Mycobacterium spp. tomentosa Pseudocapillaria em sistemas de Zebrafish (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Aprenda a detectar patógenos em sistemas de zebrafish usando swabs de sumps e análise de lodo, reduzindo o uso de peixes sentinelas. Este método otimiza custos e sensibilidade na detecção de Mycobacterium spp. e Aeromonas hydrophila.

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Os autores gostaria de agradecer a equipe da BRF esportes aquáticos do Instituto Francis Crick, pela ajuda técnica e crítica entrada. Este trabalho foi financiado pelo Instituto Francis Crick, que recebe o seu núcleo de financiamento da Cancer Research UK (FC001999), o Conselho de pesquisa médica do Reino Unido (FC001999) e o Wellcome Trust (FC001999).

1. exposição de pre-filtração sentinelas de um sistema de recirculação
<ol><li>
Defina um tanque 8L limpo fora de um sistema de recirculação. Encha com água proveniente de poços. Adicionar 2 grânulos cerâmicos ou esponja cubos de bio-media dos sistemas para tela (Figura 1). Adicione 1-2 d.rerio/l (ou seja, 12 peixes). Use o peixe tipo selvagem do fundo genético dominante na instalação, por exemplo, AB.
	<ol>
<li>Selecione pelo menos 6 peixes da seguinte maneira: pelo menos uma fêmea e um macho abaixo de 6 meses de idade, uma fêmea e um macho entre 6 e 18 meses e uma fêmea e um macho acima de 18 meses de idade.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Alimentar uma vez por dia. Varia a dieta (por exemplo, dieta seca, artémia) para certificar-se de que as sentinelas estão expostas a todas as dietas usadas na instalação de zebrafish. Mudar a água na segunda, quarta e sexta-feira, ou seja, três vezes por semana durante 4 meses.
	<ol>
<li>Para realizar a troca de água, transferir sentinelas e bio-media para um depósito temporário. Esvazie completamente o depósito de sentinela e limpá-lo. Encha o tanque de sentinela com a água do reservatório. Devolva os sentinelas e bio-media.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Expor as sentinelas por 4 meses a água do reservatório. Eutanásia o peixe por um método aprovado como a imersão em uma solução de sobredosagem de 2-fenoxietanol (3 mL/L).</li>
	<li>
Para confirmar a morte, aguardar 10 min após a cessação do movimento opercula.
	<ol>
<li>Pegue o cadáver com fórceps e congelá-lo inteiramente a-80 ° C em um recipiente identificado. Isto será usado para PCR12,15.</li>
		<li>Alternativamente, cortar o tailat o pedúnculo, nick a parede abdominal e definir em formol a 4%. Cuidado: Use luvas e fumos armário para histopatologia. Rotule o recipiente da amostra.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. depósito cotonetes
<ol><li>Use um cotonete estéril e seco com um eixo de plástico. Use luvas. Localize a superfície a zaragatoa (parede do depósito na superfície da água) e remova qualquer item impedindo o acesso fácil à superfície. Escolha uma superfície do reservatório com baixa vazão.</li>
	<li>
Desembainhe a zaragatoa, removendo a embalagem exterior e expor a ponta de algodão estéril para o ar. Evite a contaminação cruzada das esfregaço por tomando cuidado para não tocar em superfícies não testadas.
	<ol>
<li>Esfregue na parede do depósito mais 5-10 cm para absorver a água e biofilme a nível de superfície de água do reservatório.</li>
		<li>Bainha a zaragatoa volta ou invadir a ponta de um tubo de centrífuga estéril. Rotular a amostra e enviar para o teste de PCR ou congelar a-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. detecção de ovos de p. tomentosa no fundo de um tanque
<ol><li>
Análise de sedimentos por microscopia
	<ol>
<li>Use uma seringa de 60 mL9 para aspirar o lodo no fundo de um poço ou qualquer tanque segurando peixe incluindo sentinelas. Divida a amostra em tubos de 15 mL. Fechar os tubos com as blusas de parafuso e rotular os tubos.</li>
		<li>Preparar a solução saturada de açúcar (gravidade específica = 1.27), misturando 227 g de açúcar granulado em 177 mL de água quente com um agitador magnético14.</li>
		<li>Centrifuga os tubos de 15 mL em 175-250 x g durante 10 minutos em uma centrífuga com baldes de balanço. Decantar os tubos e manter o sedimento em seu tubo.</li>
		<li>Encha os tubos no meio do caminho com a solução saturada de açúcar. Fechar os tubos com sua parte superior do parafuso e misturar cuidadosamente o sedimento com a solução.</li>
		<li>Coloque os tubos em baldes de balanço o centrifugador e encha-os com solução saturada de açúcar no topo. Defina um vidro de tampa suavemente em cima de cada tubo e em contacto com a solução saturada de açúcar.</li>
		<li>Centrifugar a 175-250 x g por 10 min. nota que um vidro de tampa pode cair e quebrar durante a centrifugação, portanto, lá são 4 tubos para cada 60 mL de amostra. Levante o tampa de vidro e defini-lo sobre uma lâmina de vidro. Rotule o slide com uma caneta, lápis ou marcador.<ol>
<li>No caso de ocorrer de muitas rupturas de vidro de tampa, preencher a maior parte do tubo com a solução saturada de açúcar, centrifugar 175-250 x g por 10 min, encher até o topo com a solução saturada de açúcar, em seguida, defina suavemente o tampa de vidro. Aguarde 30 min.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Procure os ovos de p. tomentosa com o microscópio13 (Figura 2 e vídeo 1). Identifica os plugues bipolares na ampliação 400 X6. Nota: O tamanho dos ovos é 57-78 µm de comprimento e 27-39 µm de diâmetro16,17. Observe que um slide positivo é suficiente para a amostra de 60 mL ser declarado positivo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Triagem importado animais em quarentena por ovos de p. tomentosa
	<ol>
<li>Conjunto masculino e feminino d. rerio em um tanque. Adicione ao tanque um dispositivo normalmente usado para colher e preservar ovos gerados mas usá-lo aqui para recolher fezes (Figura 3). Nota: por exemplo, um tanque de reprodução 1 L completo (tanque exterior e tanque interno com fundo ralado) é completamente submersa em um tanque de 13 L, permitindo o acesso gratuito para os peixes que entram e saem o dispositivo de reprodução.</li>
		<li>Retire o dispositivo de reprodução depois de uma semana e colher o lodo coletado no dispositivo de reprodução, conforme descrito no passo 3.1 "lodo análise pela microscopia."</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. PCR em sedimentos de lodo
<ol><li>Aspirar o lodo no fundo de um tanque ou reservatório com uma seringa de 60 mL9 e transferir a amostra para um tubo de 60 mL. Fechar o tubo com a parte superior do parafuso e rotular o tubo. Descarte a seringa.</li>
	<li>Agitar o tubo de 60 mL e transfira 15 mL para um tubo de 15 mL. Fechar o tubo com a parte superior do parafuso e rotular o tubo.</li>
	<li>Centrifugar o tubo de 15 mL em 175-250 x g durante 10 minutos em uma centrífuga com baldes de balanço. Decantar os tubos e manter o sedimento no tubo.</li>
	<li>
Empunhem um cotonete, removendo a embalagem exterior e expor a ponta de algodão estéril para o ar. Evite a contaminação cruzada das esfregaço por tomando cuidado para não tocar em superfícies não testadas.
	<ol>
<li>Um esfregaço do sedimento no tubo de 15 s.</li>
		<li>Bainha a zaragatoa volta ou invadir a ponta de um tubo de centrífuga estéril. Rotular a amostra, congelar a-80 ° C e enviar para o teste de PCR. Nota: 45 mL permanecem no tubo de 60 mL. Isto pode ser mantido para a deteção de ovos de p. tomentosa por análise de lodo por microscopia conforme descrito na etapa 3.1, por exemplo, para confirmar o resultado do PCR. O PCR na lama pode ser tentado para a seleção de animais importados passo 3.2 a seguir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Peterson, T. S., Ferguson, J. A., Watral, V. G., Mutoji, K. N., Ennis, D. G., Kent, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paramecium+caudatum+enhances+transmission+and+infectivity+of+Mycobacterium+marinum+and+M.+chelonae+in+zebrafish+Danio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Aquat+Organ%22%5BJournal%5D)">Paramecium caudatum enhances transmission and infectivity of Mycobacterium marinum and M. chelonae in zebrafish Danio rerio.</a> Dis Aquat Organ. 106 (3), 229-239 (2013).</li>
<li>Watts, S. A., Lawrence, C., Powell, M., D'Abramo, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Vital+Relationship+Between+Nutrition+and+Health+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">The Vital Relationship Between Nutrition and Health in Zebrafish.</a> Zebrafish. 13, Suppl 1. 72-76 (2016).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Limitações das técnicas, passos críticos e solução de problemas:
A idade, gênero, tensão e comprimento de exposição de sentinelas não são padronizadas. Isso é mostrado na tabela 1. Há muito pouco de rastreio de peixes abaixo de 6 meses de idade, ou de peixe envelhecido. Pode haver alguns patógenos que afetam os peixes jovens, como existem alguns patógenos que são mais prevalentes na mais antiga população10,18,19,20. Da mesma forma, o sexo não é considerado na seleção de alguns grupos de sentinela, apesar de algum relatório que há um viés de gênero para alguns patógenos21. A técnica proposta tenta resolver esses problemas, embora a escolha da cepa pode ser feita de acordo com um patógeno específico para monitorar. Por exemplo, TU poderia ajudar com a detecção de Mycobacterium spp.12,22, mas há um risco de que as sentinelas então agiria como um reservatório ou exibir sinais clínicos. Sobre o comprimento de exposição, a abordagem do Centro Internacional de recursos Zebrafish10 aumenta as chances de detectar agentes patogénicos que poderiam ser perdidos com um período de contaminação inadequada. A necessidade de exposição prolongada implica que os sentinelas não estão prontamente disponíveis. A adição das amostras ambientais permite alguma flexibilidade e a multiplicação de eventos o rastreio. Por exemplo, amostragem pode ocorrer em dois meses com um intervalo de 4 meses entre cada método de exame. Isto pode reduzir o lapso de tempo antes que um patógeno recém-introduzidos é detectado.
As técnicas de análise ambiental contam com a detecção de patógenos no ambiente. Os patógenos são derramados pelo peixe e, por conseguinte, diluídos em água do sistema. A possibilidade de capturar os patógenos por filtração de água23 não foi explorada. Os métodos que descrevemos são eficazes apenas se patógenos são dado tempo suficiente para multiplicar em peixe e biofilme para atingir um limiar de contaminação, permitindo a deteção. Essa limitação das técnicas é minimizada por uma seleção crítica de sites a amostragem: o lodo no tanque é amostrado em vez do lodo do reservatório, e a água e biofilme são amostrados na superfície da fossa, em vez de um tanque ou pós-filtração. No entanto, todas as amostras do mesmo sistema são susceptíveis de dar os mesmos resultados. Resultados positivos para a p. tomentosa podem ser confirmados por meio de um outro ensaio (histopatologia, PCR ou análise de lodo). Resultados positivos de micobactérias do PCR podem ser confirmados por cultura ou por um outro laboratório de diagnóstico. No entanto, ao estabelecer um estado de saúde, ainda mais, amostras são recomendadas para confirmar os resultados negativos de qualquer técnica de análise ambiental.
Importância da técnica no que diz respeito a métodos existentes/alternativa:
Mycobacterium spp. são comuns no ambiente e sua presença do cárter não prever sua patogenicidade12. Mocho9 mostrou que as taxas de mortalidade de monitoramento é chave para analisar a evolução das questões de saúde. O uso de amostras de animais continua a ser essencial para qualquer investigação veterinária. Monitoramento de integridade implica a deteção de todos os agentes patogénicos prevalentes em uma facilidade e isto não pode ser alcançado com a utilização exclusiva de técnicas de análise ambiental. No entanto, a falta de sensibilidade das ferramentas de diagnóstico pode atrasar ou impedir uma descrição exata do estado de saúde. Enquanto o uso de sentinelas reduz o número de peixes necessários para detectar um micróbio prevalente na população, a falta de sensibilidade adiciona peso usando uma combinação de métodos, incluindo análise ambiental5,23. Na verdade o status livre de patógeno específico geralmente é definido como a ausência de uma espécie de instalação tal que as amostras ambientais e animais devem testar negativo24,25.
Os resultados de cotonete de depósito para identificar Mycobacterium spp. mostram que depender de amostras podem levar a um status falso negativas para a saúde de peixes. As 6 espécies de micobactérias testadas são descritas como patogênicas ou potencial patogénico em zebrafish15 e alguns não seria eliminado por desinfecção de superfície de ovo com cloro26 como rotineiramente realizada em quarentena. Portanto, o falso negativo pode ter algumas consequências para colaboradores que importar linhas. Por exemplo, M. fortuitum estava perdida por PCR na amostra de peixes, mas mais da metade das esfregaço do depósito PCR detectou. Considerando que estas micobactérias são mais resistentes ao cloro do que os outros e sua capacidade de crescer na água sistemas27, é um risco para a facilidade de importação não-contaminada. Para permitir a importação de linhas, os gerentes precisam confiar e compare os relatórios de saúde do centro de exportador com a deles. O programa de avaliação de desempenho ICLAS28 é a chave para esse processo em roedores. A rede RESAMA relata a detecção de M. gordonae e M. mucogenicum em francês d. rerio11. Estas micobactérias não são propostas nos painéis dos laboratórios comerciais que usamos. Seria útil para estender o programa ICLAS e harmonizar os ensaios de diagnósticos, bem como a lista de espécies patogénicas29.
A. hydrophila também é um patógeno que tem potencial para ser introduzida durante a importação de animais, embora sua susceptibilidade ao cloro30 faz sua eliminação mais provável durante a desinfecção de superfície de rotina do ovo. O cárter, cotonete e lodo resultados mostram que a análise ambiental pode ser usado para detectar este patógeno. Outras bactérias como o Mycobacterium spp. foram detectadas na lama por PCR23. Este tipo de amostra é particularmente relevante, uma vez que permite a detecção de agentes patogénicos de galpão. Por exemplo, outro novo aplicativo é a análise de lodo para a tela peixes importados em quarentena para p. tomentosa. O parasita é uma ameaça ao animal saúde13 e neoplasia modelos16. Além disso, as concentrações de cloro usadas na desinfecção superficial de rotina zebrafish ovo não são eficientes31. Portanto, a capacidade dos animais importados com um volume de negócios de uma semana e sem qualquer peixe eutanásia de tela parece muito atraente. Esta técnica pode influenciar as regras de quarentena e biossegurança, permitindo uma triagem das importações. Destina-se então um processo de tomada de decisão de acordo com os patógenos prevalentes na instalação de exportadores, os patógenos detectados nas amostras de peixe importado e o risco de comprometer o estado de saúde do importador instalação10.
Futuras aplicações ou direções depois de dominar estas técnicas:
Mesmo se o tratamento de rotina de quarentena é a opção escolhida, a eficácia de tais medicamentos32,33,34,35,36 pode ser avaliada com a análise de lodo do dispositivo de reprodução. Mais geralmente, a análise ambiental pode ser usado para testar compostos contra bactérias e parasitas erradicação, incluindo o biótopo de peixe. Outra aplicação de nicho da análise ambiental é para monitorar a população do patógeno no live feed37,38. Embora a principal aplicação destas técnicas é como uma adição valiosa à caixa de ferramentas de diagnóstico para a saúde de monitoramento em instalações de zebrafish. Graças a um mais precisos, custo e tempo eficiente definição do estado de saúde, cotonetes do reservatório e análise de lodo são complementares a vigilância sentinela e a prática rotineira de quarentena. Na verdade, o futuro dessas técnicas é para ser uma parte rotineira de qualquer relatório de saúde laboratório aquático.

Para proteger a investigação e o bem-estar dos animais1,2, a presença de agentes patogénicos é monitorada dentro de instalações de animais. No caso de zebrafish,3,4,5,6,7,8,9,10,11 de monitoração de integridade muitas vezes se baseia em animais analisados post-mortem por histopatologia, cultura de bacteriologia ou métodos moleculares. Só colônia de animais não é o método recomendado devido ao número de peixes e despesas relacionadas que seria necessário para detectar os agentes patogénicos de baixa prevalência. Portanto, o método preferido é expor um pequeno grupo de animais a uma maior carga de contaminantes. Estes peixes são chamados de pre-filtração sentinelas. Esta exposição dura meses e envolve um aumento na carga de trabalho do cuidador animal e/ou alguma solução de engenharia purpose-built. Outro desafio é a seleção de linhas importadas em quarentena, onde os animais férteis devem ser mantidos vivos e isso não é compatível com os ensaios de rotina em carcaças.
Descrevemos aqui alguns métodos para detectar certos patógenos zebrafish (a. hydrophila, Mycobacterium spp. e p. tomentosa) selecionando o ambiente do sistema aquático. O objetivo é reduzir o número de peixes utilizados para monitoramento de saúde e para otimizar o volume de negócios, custo e sensibilidade da detecção. Tais métodos são uma alternativa ao uso de animais e algumas técnicas podem ser aplicadas às importações de triagem em quarentena. Por exemplo, Mocho9 foi capaz de identificar mais espécies de micobactérias patogênicas através da realização de PCR em cotonetes do reservatório, em vez de zebrafish (incluindo sentinelas), e isto foi obtido com poucas amostras. Nesse mesmo estudo, ovos de p. tomentosa foram detectados com mais sensibilidade, selecionando o lodo do tanque usando microscopia e flotação em vez de testar o peixe por PCR e histopatologia.
A tabela 1 resume as várias características de sentinela programas3,4,5,6,7,8,9,10 usado por um número de instalações de zebrafish. Pós-filtração sentinelas recebem água da mesma forma como qualquer peixe de colônia Considerando que sentinelas de pre-filtração recebem água, uma vez que tem circulado através de tanques de peixes colônia primeiro. Por exemplo, sentinelas de pre-filtração podem ser configurar no sistema de recirculação por receber continuamente a água do reservatório. Isto não pode ser uma opção quando existem muitos sistemas independentes em um quarto. Neste caso, um tanque de pre-filtração sentinelas pode ser usado para a tela toda a sala. As sentinelas estão em um tanque de estático, fora do sistema de recirculação, e sua água é alterada regularmente, usando apenas pre-filtração de água ou seja, água do reservatório de todos os sistemas na sala. Esta técnica é descrita abaixo como uma linha de base para comparação com a eficácia da análise ambiental. O set-up proposto é projetado para controlar problemas de qualidade de água como uma diminuição do pH ou uma poluição de nitrogênio.
O conceito da análise ambiental bacteriana baseia-se na hipótese de bactérias são detectáveis no biofilme como a encontrada na parede do depósito na superfície da água ou na lama no fundo de um tanque. O cárter parece um ponto de amostragem ideal em um sistema de recirculação da aquicultura desde que recolhe resíduos (água, fezes, alimentos e outros materiais orgânicos) de todos os tanques pre-filtração. A superfície da fossa é muitas vezes facilmente acessível, a limpeza é rápida e pode ser realizada em condições assépticas para evitar a contaminação da amostra (luvas por exemplo). O conceito é usado para identificar prevalente spp. Mycobacterium patogénicos no zebrafish sistemas9,12. A técnica é descrita abaixo, e nós também estão relatando a detecção da . hydrophila no zebrafish cotonetes de superfície do reservatório e lodo.
A análise ambiental para os ovos do parasita é baseado na detecção de Murray et al . 13 e a técnica de flotação é usada rotineiramente para parasitologia e triagem microscópica dos ovos do parasita nas fezes de14. Mocho9 propôs uma alternativa ao processo de amostragem e mostrou que a técnica pode ser usada para detectar outras espécies o biótopo de peixe. Infectados d. rerio passar p. tomentosa ovos com as fezes e os ovos do parasita permanecem no fundo do tanque, na lama. Eles podem ser coletados lá devido à sua densidade ser maior do que a água. A densidade dos ovos é usada para processar a amostra ambiental também. Uma primeira flotação com centrifugação separa água e detritos leves de matéria mais pesada. Uma segunda centrifugação depende de solução saturada de açúcar (com uma densidade maior do que a densidade de ovos de p. tomentosa ) para permitir os ovos do parasita a emergir na superfície do tubo.
A triagem para bactérias do biofilme e p. tomentosa , do fundo do tanque pode ser combinada através da realização de PCR para todos esses patógenos sobre o sedimento de amostra de lodo obtido após a centrifugação de primeira. Isso otimiza o tempo de amostragem. O método é descrito abaixo. Propomos também usar essas técnicas em um contexto de quarentena. Para tela importado zebrafish adulto que precisa ser mantido vivo, um dispositivo de reprodução é inserido para o aquário de quarentena. Depois de uma semana, fezes e outros resíduos no dispositivo de reprodução são recolhidos e examinados por microscopia ou PCR. A técnica é descrita abaixo e alguns ovos de p. tomentosa foram detectados por microscopia neste contexto.

<table><tbody><tr><td>Aqua-Sed 250 mL</td><td>Vetark</td><td></td><td>2-fenoxietanol</td></tr><tr><td>Tubed Sterile Dryswab Tip</td><td>mwe</td><td>MW100</td><td>Sump surface</td></tr><tr><td>BD Plastipak Seringa Descartável 50mL Excêntrico</td><td>Becton Dickinson</td><td>300866</td><td>Eles são realmente graduados para 60 ml</td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga 15 mL Corning</td><td>Corning</td><td>430766</td><td></td></tr><tr><td>Centauro 2 centrífuga de bancada com 4 x 200 mL Swing&ndash; Rotor de saída (não selado)</td> <td>Sanyo</td><td>MSB020. CX1.5</td><td></td></tr><tr><td>Vidro de Cobertura 22 mm x22 mm</td><td>Menzel-Glaser</td><td>MNJ-350-020H</td><td></td></tr><tr><td>Cotonete Simples Aplicador de Plástico Estéril Tampa Branca com Ponta de Rayon</td><td>Sterilin Ltd Thermo Fisher Scientific</td><td>F155CA</td><td>Cotonete sedimento de lodo 50</td></tr><tr><td>mL Tubo de Centrífuga Autoportante CentriStar Cap</td><td>Corning</td><td>430921</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de Bandeja de Desova no Tanque</td><td>MBK Installations Ltd</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

análise ambiental de aeromonas hydrophilae mycobacterium spp. tomentosa pseudocapillaria em sistemas de zebrafish

Environmental Screening of Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp., and Pseudocapillaria tomentosa in Zebrafish Systems

Sistemas de monitoramento de saúde são desenvolvidos e usados em instalações de investigação de zebrafish porque patógenos de Danio rerio como Aeromonas hydrophilae Mycobacterium spp. tomentosa Pseudocapillaria têm o potencial de prejudicar a pesquisa e o bem-estar dos animal. Os peixes são normalmente analisados post-mortem para detectar micróbios. O uso de sentinelas é um caminho sugerido para melhorar a sensibilidade da vigilância e reduzir o número de animais a amostra. A configuração de um tanque de pre-filtração sentinela fora de um sistema de recirculação é descrita. A técnica é desenvolvida para evitar a poluição da água e para representar a população de peixes por uma cuidadosa seleção de cepas, gênero e idade. Para utilizar o número mínimo de animais, técnicas para a tela do ambiente também são detalhadas. Reação em cadeia de polimerase (PCR) em cotonetes de superfície do depósito é usado para melhorar significativamente a detecção de algumas espécies de micobactérias prevalentes e patogênicos como Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium haemophilume Mycobacterium chelonae. Outro método ambiental consiste em processar o lodo no fundo de um tanque ou depósito para procurar ovos de p. tomentosa . Esta é uma técnica rápida e barata que pode ser aplicada em quarentena onde um dispositivo de reprodução está submersa no tanque de exploração de animais importados. Finalmente, PCR é aplicado para a amostra de lodo e a. hydrophila é detectado no fundo do poço e superfície. Geralmente, essas técnicas de análise ambiental aplicadas a esses patógenos específicos têm levado a um aumento da sensibilidade em comparação com o teste de pre-filtração sentinelas.

Os benefícios dos swabs de depósito para identificar prevalente Mycobacterium spp, em comparação com amostras de peixes são suportados pelos resultados na Figura 4. De 115 peixes testados, M. chelonae e M. haemophilum foram detectados em 5% e 3% das amostras, respectivamente. Outras espécies de micobactérias não patogênicos foi identificado. Dos mesmos sistemas, 49 cotonetes do depósito revelaram a presença de 5 espécies de micobactérias. Razão de chances são calculados com a hipótese de que M. chelonae e M. fortuitum são detectados mais frequentemente por PCR nos swabs de superfície do reservatório do que na amostra de peixes. Isto é estatisticamente significativo com relação as respectivas probabilidades de 11 (95% CI: 4 a 29; p < 0,0001) e 306 (95% CI: 18 para 5208; p = 0,0001). Os resultados mostram que a técnica de swab de superfície do reservatório é uma alternativa valiosa para o uso exclusivo de sentinelas à tela da instalação do zebrafish para Mycobacterium spp. As amostras ambientais também foram utilizadas para triagem da . hydrophila. Estas bactérias foram detectadas em peixes, sedimentos e amostras de superfície (Figura 4). Isto também suporta a capacidade das propostas técnicas para a tela o biótopo de peixe.
Sobre a análise de lodo para detectar ovos p. tomentosa , Mocho9 detectado o parasita em 27% das amostras de peixes por PCR e histopatologia, Considerando que os ovos foram detectados em 93% de sedimento analisado a partir do mesmo sistema. Aqui, a técnica foi desafiada para reproduzir o rastreio de quarentena. Neste contexto, não podem ser amostrados animais importados, e avaliar o seu estado de saúde de forma oportuna ajuda com a gestão de biossegurança. Peixes do estado de saúde desconhecido de uma instalação de positivo p. tomentosa foram definidos em 8 tanques com dispositivos de reprodução: máximo de 16 tanque de peixes/13 L, 7 transgênicos e linha 1 tipo selvagem, misturado com sexo, com idades entre 4-24 meses. O lodo foi colhido a partir dos dispositivos depois de uma semana e analisado por microscopia. Ovos de p. tomentosa foram vistos em 7 amostras (88%). Finalmente, a detecção de PCR de parasita foi testada em swabs de depósito e sedimentos de lodo. 4 das 6 amostras de lodo foram PCR positivo e todos os resultados foram negativos para as amostras de superfície. Isto não é surpreendente, uma vez que o rastreio de lodo baseia-se na capacidade dos ovos a cair para o fundo do tanque. Isso mostra que as técnicas de análise de lodo podem ser usadas para a tela d. rerio aquários para p. tomentosa infestação e que os métodos podem ser adaptados para o rastreio de animais importados.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55306/55306fig1.jpg"> Figura 1: tanque de pre-filtração sentinela fora do sistema de recirculação. Um tanque de 8 L é preenchido com água e bio-meios dos depósitos dos sistemas para tela. Os dois grânulos de bio-mídia de cerâmica branca sente-se no fundo do tanque (no meio da foto). 12 peixes são selecionados de acordo com sua idade, estirpe e gênero, e eles são adicionados ao tanque de sentinela. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55306/55306fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55306/55306fig2.jpg"> Figura 2: p. tomentosa ovo detectado durante a análise de sedimentos por microscopia. Ampliação usada era 400 X. As setas indicam os plugues bipolares. Barra de escala = 50 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55306/55306fig2large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55306/55306fig3.jpg"> Figura 3: dispositivo de reprodução submersa em um tanque de exploração de peixe para coletar lodo para análise. Este tanque é definido em um banco com a finalidade da foto; situa-se no sistema de recirculação. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55306/55306fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55306/55306fig4.jpg"> Figura 4: Porcentagem de identificação de Mycobacterium spp., a. hydrophilae p. tomentosa por PCR em peixes, superfície swabs do depósito e lodo de fossa. Percentual é obtido dividindo o número de resultados positivos para cada espécie de patógeno pelo número de amostras analisadas. A porcentagem de resultados positivos é dada pelo tipo de amostra, como peixes, superfície ou lodo e indicada após o nome da bactéria. 49 zaragatoas de superfície do reservatório e 115 peixes foram testadas por PCR para identificação de Mycobacterium spp. Os dados são compilados com resultados de9 do Mocho, uma vez que é uma extensão deste estudo. Os peixes são principalmente de pre-filtração sentinelas conforme protocolo seção 1. Raramente, quando sentinelas não estavam disponíveis, fugitivos e antiga colônia de peixe (> 18 meses) foram amostradas. Todos os sistemas testados para Mycobacterium spp. foram testados em amostras de peixes e do depósito. Razão de chances são calculados com a hipótese de que M. chelonae e M. fortuitum são detectados mais frequentemente por PCR nos swabs de superfície do reservatório do que na amostra de peixes. Isto é estatisticamente significativo com relação as respectivas probabilidades de 11 (95% CI: 4 a 29; p < 0,0001) e 306 (95% CI: 18 para 5208; p = 0,0001). Mycobacterium marinum PCR negativo para todas as amostras e é, portanto, considera-se ausente destas facilidades e não incluído na análise. 12 peixes, 14 amostras de superfície do reservatório e lodo do reservatório 6 foram testadas por PCR, a presença da . hydrophila. 6 poços foram testados para a presença de p. tomentosa na superfície e na lama. PCR = reação em cadeia da polimerase. CI = intervalo de confiança. * e * * indicam significância estatística; outras comparações não foram estatisticamente significativas. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55306/55306fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Video 1" src="/files/ftp_upload/55306/55306vid1.jpg"> Video 1: varredura para um ovo de P. tomentosa com o microscópio. O slide é obtido a partir da análise de lodo conforme descrito na etapa 3.1. O campo é examinado para detectar um ovo de p. tomentosa. Uma vez que uma estrutura é reconhecida, é ampliada para confirmar a identificação em maior resolução. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55306/video_scan_for_egg.avi" target="_blank">Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Autores</td>
			<td>Idade no início da exposição</td>
			<td>Comprimento de exposição</td>
			<td>Idade de amostragem</td>
			<td>Pré ou pós filtração</td>
			<td>Sexo</td>
			<td>Estirpe de</td>
		</tr>
<tr>
<td>Barton et al . 3
</td>
			<td>4 meses</td>
			<td>6 meses</td>
			<td>10 meses</td>
			<td>Pré-filtragem</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
<tr>
<td>Borges et al . 4
</td>
			<td>6 meses</td>
			<td>6 meses</td>
			<td>12 meses</td>
			<td>Pré-filtragem</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Tipo AB</td>
		</tr>
<tr>
<td>Collymore et al 5
</td>
			<td>Tão jovem quanto possível</td>
			<td>3 meses</td>
			<td>< 6 meses</td>
			<td>Pré-filtragem</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
<tr>
<td>Geisler et al 6
</td>
			<td>4 meses</td>
			<td>4 meses</td>
			<td>8 meses</td>
			<td>Pré e pós filtração</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Tipo AB</td>
		</tr>
<tr>
<td>Liu et al . 7
</td>
			<td>3 meses</td>
			<td>1-6 meses</td>
			<td>4-9 meses</td>
			<td>Pré e pós filtração</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Tipo selvagem</td>
		</tr>
<tr>
<td>Martins et al . 8
</td>
			<td>3 meses</td>
			<td>3 meses</td>
			<td>6 meses</td>
			<td>Pré-filtragem</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Tipo selvagem</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mocho9
</td>
			<td>< 6 meses, 6 - 12 meses, > 18 meses</td>
			<td>4 meses</td>
			<td>7 - 24 meses</td>
			<td>Pré-filtragem</td>
			<td>1 fêmea e 1 macho de cada grupo de idade</td>
			<td>Tipo AB</td>
		</tr>
<tr>
<td>Murray et al . 10
</td>
			<td>3-4 meses</td>
			<td>3 meses, 6 meses, 1 ano</td>
			<td>7, 10 e 16 meses</td>
			<td>Pré e pós filtração</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Tipo AB</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: comparação de configurações de sentinela em instalações de zebrafish. O peixe de sentinela pode ser seleccionado de acordo com sua idade, sexo ou estirpe. Eles são expostos por um período definido e que recebem água do sistema de pré ou pós-filtração. Os dados são compilados a partir da edição especial de 2016 sobre saúde do Zebrafish journal3,4,5,6,7,8,9, 10.

Este protocolo descreve o uso de cotonetes do reservatório e análise de lodos de sistemas de zebrafish, que leva à detecção de aumentada em comparação com o uso exclusivo de sentinelas para detectar agentes patogénicos como Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp. e Tomentosa de Pseudocapillaria. Propõe-se também um sistema para monitorar os ovos p. tomentosa em quarentena.

Análise ambiental de Aeromonas hydrophilae Mycobacterium spp. tomentosa Pseudocapillaria em sistemas de Zebrafish

Health monitoring systems are developed and used in zebrafish research facilities because pathogens of Danio rerio such as Aeromonas hydrophila, ...

O objetivo geral dessa técnica de amostragem é reduzir o número de peixes utilizados para monitoramento da saúde e otimizar o tempo de análise, o custo e a sensibilidade na detecção de patógenos, inclusive durante a triagem de importações em quarentena. Esta técnica auxilia na definição dos estatutos sanitários das colônias de refúgio. Este método é uma ferramenta útil ao ler ou avaliar a eficiência do tratamento.Uma das principais vantagens desta técnica é o screening e a triagem de importações em quarentena. Isso fortalece o plano de biossegurança da instalação aquática. Para iniciar o protocolo, prepare um tanque limpo de oito litros fora de um sistema de recirculação.Encha o tanque com cerca de oito litros de água proveniente de sifões. Adicione duas contas cerâmicas ou cubos de esponja de biomídia provenientes dos sistemas para peneirar. Em seguida, adicione um a dois Danio rerio por litro, utilizando peixes selvagens do fundo genético dominante da instalação, por exemplo AB. Selecione pelo menos seis peixes.Alimente os peixes uma vez ao dia. Varie as dietas para garantir que os peixes sentinelas sejam expostos a todas as dietas utilizadas no viveiro de peixes-zebra. Para realizar a troca de água, transfira os peixes sentinelas em biomídia para um tanque temporário.Esvazie completamente o tanque de sentinelas e limpe-o. Reabasteça o tanque de sentinelas apenas com água do sumidouro e recoloque as sentinelas e o biomaterial. Após expor as sentinelas à água do sumidouro por quatro meses, eutanazie os peixes por um método aprovado, como imersão em uma solução com sobredosagem de 2-fenoxietanol.Para confirmar a morte, aguarde dez minutos após a cessação do movimento do opérculo. Pegue o cadáver com pinça e congele-o inteiramente a menos 80 graus Celsius em um recipiente identificado. Prepare um swab seco estéril com haste de plástico e use luvas.Localize a superfície a ser swabada. Escolha uma superfície de sumidouro com fluxo baixo, a parede do sumidouro na superfície da água, e remova qualquer objeto que impeça o acesso fácil à superfície. Em seguida, retire o swab da bainha removendo a embalagem externa e exponha a ponta estéril de algodão ao ar.Passar o swab na parede do poço por cinco a 10 centímetros para absorver a água e o biofilme no nível da superfície da água. Em seguida, recolher o swab ou quebrar a ponta em um tubo cônico estéril. Rotular a amostra e enviá-la para teste de PCR ou congelá-la a menos 80 graus Celsius.Para realizar a análise de lodo por microscopia, utilize uma seringa de 60 mililitros para aspirar o lodo no fundo de um sumidouro. Divida a amostra em tubos de 15 mililitros. Parafuse as tampas e rotule os tubos.Centrifugue os tubos de 15 mililitros a 175 a 250 vezes a gravidade durante dez minutos em uma centrífuga com rotor de balde. Decante os tubos. Após a decantação, mantenha os sedimentos.Em seguida, prepare a solução saturada de açúcar misturando 227 gramas de açúcar granulado e 177 mililitros de água quente com um agitador magnético. Encha os tubos até a metade com a solução saturada de açúcar. Parafuse as tampas e misture bem o sedimento com a solução.Coloque os tubos nos baldes oscilantes da centrífuga e preencha-os até o topo com solução saturada de açúcar. Coloque suavemente um lamínula sobre cada tubo, de modo que entre em contato com a solução saturada de açúcar. Observe que os quatro tubos para cada amostra de 60 mililitros são necessários caso algum lamínula caia e quebre durante a centrifugação.Após a conclusão da centrifugação, levante o lamínula e coloque-o sobre uma lâmina de vidro, depois identifique a lâmina com lápis ou caneta marcadora. Caso ocorram quebras frequentes de lamínulas, preencha a maior parte do tubo com a solução saturada de açúcar e centrifugue o tubo. Complete até o topo com a solução saturada de açúcar, coloque suavemente o lamínula e aguarde 30 minutos.Procure os ovos de Pseudocapillaria tomentosa com o microscópio. Identifique as tampas bipolares em aumento de 400X. Para triagem de animais importados em quarentena para ovos de P. tomentosa, coloque machos e fêmeas de Danio rerio em um tanque e acrescente a bandeja de desova no tanque, mas utilize-a aqui para coletar fezes.Após uma semana, remova o dispositivo de criação e colete o lodo acumulado no dispositivo de criação conforme descrito anteriormente. Aspire o lodo no fundo de um tanque ou sumidouro com uma seringa de 60 mililitros e transfira a amostra para um tubo de 60 mililitros. Feche o tubo com sua tampa rosqueável e rotule o tubo.Descarte a seringa. Agite o tubo de 60 mililitros e transfira 15 mililitros para um tubo de 15 mililitros. Feche o tubo com sua tampa rosqueada e rotule o tubo.Centrifugue o tubo de 15 mililitros a 175 a 250 vezes a gravidade durante dez minutos em uma centrífuga com rotor de balde. Decante os tubos e mantenha o sedimento no tubo. Retire o swab da embalagem externa e exponha a ponta estéril de algodão ao ar.Agite o sedimento no tubo por 15 segundos. Reencapsule o swab ou quebre a ponta em um tubo de centrífuga estéril. Rotule a amostra.Congele a menos 80 graus Celsius e envie para teste de PCR. Utilizando o método de swab do sump, em 115 peixes testados, Mycobacterium chelonae foi detectado em cinco por cento e Mycobacterium haemophilum foi detectado em três por cento das amostras, sendo as únicas espécies patogênicas identificadas. A partir dos mesmos sistemas, 49 swabs do sump revelaram a presença de cinco espécies de Mycobacterium.As razões de chances mostram que a técnica de swab do sump superficial é uma alternativa valiosa ao uso exclusivo de animais sentinela para triagem da instalação de peixes-zebra para Mycobacterium. As amostras ambientais também foram utilizadas para triagem de Aeromonas hydrophila, que foi detectada em peixes, lodo e amostras superficiais, reforçando a capacidade das técnicas propostas em monitorar o biótopo dos peixes. Mycobacterium chelonae e Mycobacterium fortuitum são detectados com maior frequência por PCR nos swabs do sump superficial do que nas amostras de peixe.Uma vez dominada, a coleta de amostras leva apenas alguns minutos e a detecção de ovos de Pseudocapillaria tomentosa pode ser realizada em uma hora. Esta técnica torna o monitoramento ambiental uma parte essencial do programa rotineiro de monitoramento da saúde. Esses métodos podem ajudar a responder perguntas fundamentais na área de patologia de peixes, como a relação entre biofilme bacteriano e infecção bacteriana.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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Embriões de peixe-zebra opticamente transparentes são amplamente utilizados para estudar e visualizar em tempo real as interações entre microrganismos patogênicos e as células imunes inatas. A microinjeção de Mycobacterium abscessus, combinada com imagens de fluorescência, é usada para examinar características patogênicas essenciais, como a formação de cordão em embriões de peixe-zebra.

Decifrar e Imagem Patogênese e Cording de<em&gt; Mycobacterium abscessus</em&gt; Em embriões Zebrafish

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