Análise ambiental de Aeromonas hydrophilae Mycobacterium spp. tomentosa Pseudocapillaria em sistemas de Zebrafish

O objetivo geral desta técnica de amostragem é reduzir o número de peixes usados para monitoramento de saúde e otimizar a rotatividade, o custo e a sensibilidade da detecção de patógenos, inclusive ao rastrear importações em quarentena. Essa técnica ajuda a definir os estatutos sanitários das colônias de refúgio. Este método é uma ferramenta útil ao ler ou avaliar a eficiência do tratamento.

Uma das principais vantagens dessa técnica é a triagem e triagem de importações em quarentena. Fortalece o plano de biossegurança da instalação aquática. Para iniciar o protocolo, coloque um tanque limpo de oito litros em um sistema de recirculação.

Encha o tanque com cerca de oito litros de água proveniente de reservatórios. Adicione duas esferas de cerâmica ou cubos de esponja de biomídia dos sistemas à tela. Em seguida, adicione um para fazer Danio rerio por litro, usando peixes selvagens do tipo de fundo genético dominante na instalação, por exemplo, AB. Selecione pelo menos seis peixes.

Alimente os peixes uma vez por dia. Varie as dietas para garantir que as sentinelas sejam expostas a todas as dietas usadas nas instalações de peixe-zebra. Para realizar a troca de água, transfira as sentinelas em biomídia para um tanque temporário.

Esvazie completamente o tanque sentinela e limpe-o. Reabasteça o tanque sentinela apenas com água do reservatório e coloque as sentinelas e a biomídia de volta. Depois de expor as sentinelas à água do reservatório por quatro meses, eutanasiar os peixes por um método aprovado, como imersão em uma solução de overdose de 2-fenoxietanol.

Para confirmar a morte, aguarde dez minutos após a cessação do movimento do opérculo. Pegue o cadáver com uma pinça e congele-o inteiramente a 80 graus Celsius negativos em um recipiente identificado. Prepare um cotonete seco estéril com uma haste de plástico e use luvas.

Localize a superfície para esfregar. Escolha uma superfície de reservatório com baixo fluxo, a parede do reservatório na superfície da água e remova qualquer item que impeça o fácil acesso à superfície. Em seguida, desembainhe o cotonete removendo a embalagem externa e exponha a ponta de algodão estéril ao ar.

Esfregue a parede do reservatório por mais de cinco a 10 centímetros para absorver a água e o biofilme no nível da superfície da água do reservatório. Em seguida, embainhe o cotonete ou quebre a ponta em um tubo de centrífuga estéril. Rotule a amostra e envie-a para teste de PCR ou congele a 80 graus Celsius negativos.

Para realizar a análise de lodo por microscopia, use uma seringa de 60 mililitros para aspirar o lodo no fundo de um reservatório. Divida a amostra em tubos de 15 mililitros. Aparafuse as tampas e etiquete os tubos.

Centrifugue os tubos de 15 mililitros a 175 a 250 vezes a gravidade por dez minutos em uma centrífuga com baldes giratórios. Transvase os tubos. Após a decantação, guarde os sedimentos.

Em seguida, prepare a solução saturada de açúcar misturando 227 gramas de açúcar granulado e 177 mililitros de água quente com um agitador magnético. Encha os tubos até a metade com a solução saturada de açúcar. Aparafuse as tampas e misture bem o sedimento com a solução.

Coloque os tubos nos baldes giratórios da centrífuga e encha-os até o topo com solução saturada de açúcar. Coloque uma lamínula suavemente em cima de cada tubo para que fique em contato com a solução saturada de açúcar. Observe que os quatro tubos para cada amostra de 60 mililitros são para o caso de alguma lamínula cair e quebrar durante a centrifugação.

Quando a centrifugação terminar, levante a lamínula e coloque-a em uma lâmina de vidro e, em seguida, rotule a lâmina com um lápis ou caneta marcadora. Caso ocorram muitas quebras na lamínula, encha a maior parte do tubo com a solução saturada de açúcar e centrifugue o tubo. Encha até o topo com a solução saturada de açúcar, coloque suavemente a tampa da lamínula e aguarde 30 minutos.

Procure os ovos de pseudocapillaria tomentosa com o microscópio. Identifique os plugues bipolares com ampliação de 400X. Para rastrear animais importados em quarentena para ovos de P.tomentosa, coloque Danio rerio macho e fêmea em um tanque e adicione a bandeja de desova no tanque, mas use-a aqui para coletar fezes.

Após uma semana, remova o dispositivo de reprodução e colha o lodo coletado no dispositivo de reprodução, conforme descrito anteriormente. Aspirar as lamas do fundo de uma cuba ou de uma cuba com uma seringa de 60 ml e transferir a amostra para um tubo de 60 ml. Feche o tubo com a tampa de rosca e etiquete o tubo.

Descarte a seringa. Agite o tubo de 60 mililitros e transfira 15 mililitros para um tubo de 15 mililitros. Feche o tubo com a tampa de rosca e etiquete o tubo.

Centrifugue o tubo de 15 mililitros a 175 a 250 vezes a gravidade por dez minutos em uma centrífuga com baldes giratórios. Decantar os tubos e manter o sedimento no tubo. Desembainhe o cotonete removendo a embalagem externa e exponha a ponta de algodão estéril ao ar.

Limpe o sedimento no tubo por 15 segundos. Embainhe o cotonete ou quebre a ponta em um tubo de centrífuga estéril. Rotule a amostra.

Congele a 80 graus Celsius negativos e envie para o teste de PCR. Utilizando o método de swab de reservatório de 115 peixes testados, Mycobaterium chelonae foi detectado em cinco por cento e Mycobaterium haemophilum foi detectado em três por cento das amostras e foram as únicas espécies patogênicas identificadas. Dos mesmos sistemas, 49 swabs de reservatório revelaram a presença de cinco espécies de Mycobaterial.

As razões de chances mostram que a técnica de swab de reservatório de superfície é uma alternativa valiosa ao uso exclusivo de sentinelas para rastrear a Mycobacterium nas instalações de peixe-zebra. As amostras ambientais também foram usadas para rastrear Aeromonas hydrophila, que foram detectadas em amostras de peixes, lodo e superfície, apoiando a capacidade das técnicas propostas de rastrear o biótopo de peixes. Mycobacterium chelonae e Mycobacterium fortuitum são detectados com mais frequência por PCR nos swabs de depósito de superfície do que na amostra de peixe.

Uma vez dominada, a amostragem leva apenas alguns minutos e a detecção de ovos de pseudocapillaria tomentosa pode ser feita em uma hora. Essa técnica torna a triagem ambiental uma parte fundamental do programa de monitoramento de saúde de rotina. Esses métodos podem ajudar a responder a questões-chave no campo da patologia dos peixes, como a relação entre biofilme bacteriano e infecção bacteriana.