Sistemas HeLa celular Com base livre expressão para a expressão de Plasmodium Rhoptry Proteínas

O objetivo geral do experimento a seguir é traduzir proteínas de plasmódio usando sistemas de expressão livre de células baseados em hela e purificar as proteínas de microvolumes de produto traduzido. Isso é conseguido através da clonagem de genes de plasmódio para preparar plasmídeos recombinantes para tradução in vitro de duas etapas e uma etapa, expressão livre de células de proteínas da árvore RT recombinante da malária. Para traduzir as proteínas recombinantes, o plasmídeo preparado é incubado com mistura de transcrição.

Ao usar o sistema de expressão de duas etapas, que transcreve o mRNA, o mRNA resultante é então adicionado à mistura de tradução para tradução de proteínas. Ao usar o sistema de expressão de uma etapa, o plasmídeo recombinante é incubado com lisado de células hela para transcrição e tradução de proteínas recombinantes. As proteínas recombinantes são então purificadas a partir de microvolumes de produto de tradução.

Os resultados mostram expressão e purificação bem-sucedidas com base na análise de western blotting. A principal vantagem dessa técnica sobre outras, como o sistema de expressão de gérmen de trigo e o sistema de lisado de reticulócitos de coelho, é que esse sistema pode expressar proteínas em três horas. Nenhuma otimização de codificação é necessária.

É acessível e fácil de usar. Vários antígenos podem ser rastreados em microarrays, tornando possível a detecção de antígenos para terapia e diagnóstico. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque é a expressão livre de células, que expressa proteínas em microvolumes, tornando a purificação de proteínas extremamente difícil.

Primeiro tivemos a ideia de usar esse sistema, pois não podíamos explorar proteínas expressas usando E coli e descobrimos que outros sistemas de expressão eram muito caros e demorados. Decidimos explorar o sistema de expressão livre de células baseado em hela como um sistema alternativo. Preparar 20 microlitros de mistura de transcrição contendo DNA vetorial de plasmídeo recombinante, conforme descrito no protocolo de texto para expressão de proteínas in vitro humanas em duas etapas.

Usando modelos de DNA. Misture os componentes em um tubo de microcentrífuga e incube por 75 minutos a 30 graus Celsius em banho-maria. Em seguida, pegue dois microlitros da mistura de transcrição e adicione-os a 23 microlitros de mistura de tradução contendo lisado de células hela.

Incube a mistura resultante a 30 graus Celsius por 90 minutos. Armazene os produtos traduzidos a menos 20 graus Celsius. Em seguida, prepare 25 microlitros da mistura de transcrição e tradução contendo o vetor plasmídeo recombinante, DNA e um lisado conforme descrito no protocolo de texto para uma etapa de expressão de proteína de tradução in vitro acoplada ao ser humano para modelos de DNA.

Incubar esta mistura de reação durante 90 minutos a seis horas a 30 graus Celsius e armazenar os produtos de tradução a menos 20 graus Celsius. Para purificar as proteínas recombinantes expressas, adicione 75 microlitros de um tampão de purificação X a 25 microlitros de produto de tradução para fazer 100 microlitros de mistura de purificação. Lave a resina de níquel duas vezes adicionando 300 microlitros de água destilada e 300 microlitros do tampão de ligação.

Ressuspender a resina e centrifugar a 14 000 Gs durante um minuto para remover o excesso de etanol. Em seguida, adicione 100 microlitros da solução de purificação preparada a 100 microlitros de resina quelante de níquel e incube a mistura em uma extremidade. Agitador final por 60 minutos em temperatura ambiente.

Centrifugue a mistura a 14.000 Gs por um minuto e colete o supernat em um novo tubo rotulado como fluxo. Lave a resina com 100 microlitros de um tampão de lavagem, centrifugue a 14.000 GS por um minuto e colete o super nomeado em um tubo novo rotulado como lavagem. Repita esta etapa duas vezes após a lavagem.

Adicione 100 microlitros de um tampão de eluição x à resina e incube em um agitador de extremidade por 15 minutos. Em seguida, centrifugue a 14 000 Gs durante um minuto. Execute o passo Elluciano duas vezes de cada vez.

Recolha o sobrenadante num novo tubo de microcentrífuga e rotule como eluído após eluciano. Lave a resina duas vezes como antes e guarde-a a quatro graus Celsius. Armazene o fluxo através de lavagens e amostras de eluição a menos 20 graus Celsius ou menos para realizar o western blotting.

Primeiro, prepare tubos separados de extratos schon de P falsy parum e coli, proteínas R três recombinantes expressas, as proteínas recombinantes preparadas e os produtos proteicos purificados usando o método de afinidade. Em seguida, adicione tampão de amostra de eletroforese contendo mercaptoetanol a cada tubo para um volume final de 20 microlitros. Para fazer amostras de proteína solubilizadas, ferva os tubos por dois minutos.

Carregue as amostras de proteína solubilizada em géis de página 10% SDS para separar as proteínas após a execução dos géis. Transferir as proteínas separadas dos géis de página SDS para papel nitrocelulósico por eletroforese a 35 miliamperes de corrente por gel em uma câmara de western blotting semi-seca por duas horas após a transferência e bloqueio do papel nitrocelulósico com 2% de leite desnatado. Incubar o papel de nitrocelulose com os anticorpos policlonais enumerados no protocolo de texto para os controlos negativos.

Também incube papel de nitrocelulose em um a 100 soro normal diluído de camundongo e coelho e cultura gasta super nomeada a partir de SB duas células de mieloma. Após a incubação do papel de nitrocelulose a quatro graus Celsius durante a noite, lave quatro vezes com tampão blot e incube com anticorpos secundários específicos da espécie, conjugados à peroxidase de rabanete, diluídos de um a 1000 em leite a 2%. Em seguida, lave o papel de nitrocelulose novamente quatro vezes com tampão de borrão.

Finalmente, incubar o papel de nitrocelulose lavado com uma solução de desenvolvimento de cor, A mais B por 30 minutos no escuro, a expressão bem-sucedida de proteínas plasmodium usando sistemas de expressão livre de células humanas in vitro foi confirmada por RT tree specific rabbit antier, como mostrado anteriormente, proteínas recombinantes expressas não foram reconhecidas por anti-soros contra parasitose proteínas vae de p FALs parem e P Yoi Lee, demonstrando a especificidade do anti-soro de coelho 6 76 contra as proteínas expressas. O soro normal de coelho não reagiu com proteínas recombinantes. Traduzido usando o sistema de expressão livre de células humanas in vitro de duas etapas e o sistema de tradução in vitro acoplado em uma etapa.

A purificação bem-sucedida de proteínas traduzidas de 25 microlitros de produtos proteicos traduzidos é mostrada aqui. A purificação especificamente bem-sucedida da proteína transmembrana da fenda de mara é mostrada. A purificação bem-sucedida de uma proteína hipotética de genes codificadores de proteínas da árvore de plasmódio RT também é mostrada.

Finalmente, a purificação bem-sucedida de repetições de tatu contendo a proteína da árvore plasmodium RT é mostrada. O rendimento da proteína após a purificação é de 3,5 microgramas por 25 microlitros Após o seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores da área de parasitologia para caracterização de proteínas em parasitas, interações proteína-proteína, estudos inibitórios de anticorpos e desenvolvimento de vacinas na área de parasitologia.

Depois de assistir a este vídeo, você deve entender como usar o sistema de expressão celular baseado em células curandeiras para expressar proteínas plasmodium em três horas. Você também terá uma compreensão de como purificar as proteínas de micro volumes de produto traduzido.