Janela em um Microworld: Simple sistemas microfluídicos para estudar o transporte microbiana em Meios Porosos

Demonstramos que, por meio do uso de dispositivos de chip ecológico, as estruturas físicas e as cargas de pressão podem ser mantidas constantes ou variadas. Enquanto a influência da química superficial, das propriedades do fluido ou das características das partículas ou microrganismos é investigada de forma sistemática por meio de experimentos de transporte utilizando uma linhagem bacteriana não patogênica de VIO que expressa proteína verde fluorescente, ilustramos a importância da estrutura do habitat, das condições de fluxo e do tamanho do inóculo sobre fenômenos fundamentais de transporte. Software microfluídico oferece uma visão envolvente de um mundo oculto.

Olá, sou Dimitri Marker do Instituto Vanderbilt para Educação em Restauração de Biossistemas Integrativos da Universidade Vanderbilt. E eu sou David Schafer, engenheiro de pesquisa e desenvolvimento aqui nos Laboratórios Viro. Olá, sou Leslie Sho do Departamento de Engenharia de Materiais Químicos e Biomoleculares no Centro de Ciências e Engenharia Ambiental da Universidade de Connecticut, e eu sou Aded Dicot, também da Zebra.

Hoje vamos mostrar um procedimento para criar matrizes modulares de habitats microfluídicos para pesquisas básicas em ciências ambientais e engenharia. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para investigar os efeitos de estruturas em escala micrométrica sobre interações microbianas de transporte em meios florestais. Então, vamos começar.

O primeiro passo na criação de um dispositivo microfluídico é desenhar um layout bidimensional do dispositivo em um programa de desenho assistido por computador ou programa CAD. Utilizamos o AutoCAD, mas outros programas de desenho também estão disponíveis, como o Clue in ou o CorelDRAW. O software permite ao projetista replicar fielmente estruturas físicas em toda uma área macroscópica, enquanto características individuais são definidas com resolução inferior a cinco mícrons.

A partir do desenho CAD, cria-se uma máscara fotográfica. Utilizamos uma máscara de cromo fabricada pela Advanced Reproductions Corporation, no extremo norte de Massachusetts. Os próximos passos da produção do dispositivo microfluídico ocorrem em uma sala limpa para a criação de um molde-mestre.

Uma lâmina de silício limpa é revestida com resistência fotográfica em um spin coater. Primeiro, a lâmina é fixada na plataforma do spin coater e alguns gramas de resistência fotográfica SU 8 20 25 são despejados no centro da lâmina. Em seguida, a lâmina é girada por um ciclo inicial de espalhamento de 15 segundos a 500 RPM, seguido por um ciclo de revestimento fino a 4.000 RPM por 35 segundos.

Após a centrifugação, a pastilha é colocada em uma placa aquecedora por 10 minutos a 95 graus Celsius para volatilizar o solvente em excesso. O último passo no preparo da pastilha é a remoção do anel de borda. Isso é feito retornando a pastilha ao centrífugo e aplicando um fluxo contínuo de removedor de borda SUA à borda externa da pastilha revestida.

O próximo passo é padronizar a fotoresina por meio de exposição seletiva à luz UV. Primeiro, a pastilha revestida é colocada sobre uma superfície plana e a máscara de cromo é posicionada diretamente sobre ela. O filme vermelho de máscara Rubylith bloqueia a transferência de padrões fora da área desejada.

Em seguida, uma dose de luz UV de 300 milijoules por centímetro quadrado é aplicada na pastilha revestida através de uma máscara, utilizando um sistema de exposição pontual. Por fim, a pastilha é aquecida por 15 minutos a 95 graus Celsius para promover a reticulação nas regiões do fotoresiste expostas à luz, tornando-as insolúveis. O último passo na criação do molde é remover as regiões não reticuladas do fotoresiste, deixando estruturas em relevo elevadas.

Primeiro, a pastilha é retornada mais uma vez ao spin coater e é coberta com a solução reveladora. O revelador permanece na pastilha revestida por aproximadamente cinco minutos e, em seguida, é removido por centrifugação, resultando em um padrão claramente visível na pastilha. Qualquer resíduo remanescente é removido lavando com álcool isopropílico borrifado sobre a pastilha em rotação.

Utilizamos uma velocidade de rotação de 2200 RPM nesta etapa por cerca de cinco a 10 segundos. Por fim, o molde acabado é seco usando um fluxo de gás nitrogênio e armazenado em um recipiente até ser necessário para a confecção de um dispositivo. Fabricamos dispositivos microfluídicos utilizando o elastômero de silicone polimetil alano.

Primeiro, o material base e o agente de cura são adicionados em uma proporção de peso de 10 para 1 em um copo plástico. Em seguida, a mistura é homogeneizada. Andy removeu as bolhas usando um misturador condicionador Thinky AR 100.

Após a conclusão do ciclo, o PDMS líquido é despejado uniformemente sobre o molde. O recipiente contendo o molde e o PDMS não curado é então colocado em uma câmara de vácuo para desgaseificação. As bolhas no polímero aparecem quase imediatamente.

A dessgaseificação continua até que todas as bolhas desapareçam. O recipiente é colocado em um forno nivelado a 65 graus Celsius por pelo menos quatro horas para permitir completamente a reticulação do polímero. Em seguida, o PDMS curado é cuidadosamente removido do molde reutilizável.

Primeiramente, quatro bordas são cortadas bem fora da região padronizada usando um bisturi, e o dispositivo é destacado da pastilha padronizada usando pinças. As bordas do dispositivo podem ser aparadas com tesoura, se desejado. Uma subseção do dispositivo pode ser separada do restante do dispositivo de PDMS moldado.

Em seguida, são feitos orifícios de acesso através do PDMS. Utilizamos punções de biópsia disponíveis comercialmente em diversos tamanhos, montadas em um pequeno eixo. Os cilindros de PDMS são removidos com pinça.

Por fim, o dispositivo aparado e perfurado é limpo utilizando álcool isopropílico e um cotonete de espuma de polipropileno. O dispositivo é seco com nitrogênio e então colocado em estufa para remover todos os vestígios de solvente. O último passo na fabricação de um dispositivo microfluídico é a ligação do PDMS a um substrato de lâmina de vidro, seguido imediatamente pelo preenchimento com fluido.

O dispositivo de PDMS e uma lâmina de vidro são colocados com as superfícies de ligação voltadas para cima em um limpador de plasma. Neste experimento, utilizamos um limpador de plasma Herrick PDC-32G. Uma vez que o vácuo é estabelecido e o plasma azul-violeta se torna visível, um temporizador é ajustado para 30 segundos.

O gerador de plasma é desligado. A câmara é repressurizada, e o dispositivo e o cursor são retirados da câmara, com as superfícies de ligação colocadas em contato. Ao remover os componentes ativados da câmara, é importante agir rapidamente para que as superfícies permaneçam ativadas.

Uma pressão suave ajuda a garantir uma boa adesão. A qualidade da adesão é verificada puxando um canto com uma pinça. O interior hidrofílico pode então ser facilmente preenchido com uma solução aquosa, como meio tampão ou água desionizada.

O fluido aquoso é administrado em cada poço de origem e através da respectiva célula de fluxo microporosa. Uma vez que todas as câmaras estejam cheias, uma camada fina de PDMS curado é colocada sobre todo o dispositivo para ajudar a retardar a evaporação e manter a esterilidade. Para calibrar o fluxo impulsionado por pressão no dispositivo, pré-carregue as células de fluxo microestruturadas com água desionizada, coloque um módulo de fluxo, que atua como uma interface de entrega de fluido e selo estéril na parte superior do dispositivo.

Este módulo de fluxo pode ser usado isoladamente ou conectado a um reservatório externo contendo fluido, como uma seringa de plástico. Conecte um reservatório contendo líquido, como uma seringa de plástico ou o módulo de fluxo, à entrada a montante. Mantenha bem a altura do fluido no reservatório acima da altura do ponto a jusante.

Bem, a diferença de altura entre o reservatório a montante e cada poço de saída a jusante define a força motriz para o fluxo impulsionado por pressão, permitindo quantificar as taxas de fluxo através dos dispositivos. Uma agulha de ponta romba com calibre 25 é utilizada para coletar amostras dos poços a jusante em intervalos regulares. Por exemplo, coletamos amostras a cada 15 a 20 minutos, anotando cuidadosamente o tempo real decorrido entre as amostras.

O peso da seringa é registrado antes e depois da coleta de amostra em uma balança analítica. O volume acumulado versus o tempo acumulado é representado graficamente, sendo a inclinação igual à taxa média de fluxo de massa. A grande seção transversal do reservatório de entrada em comparação com os poços de saída ajuda a evitar mudanças significativas nas taxas de fluxo à medida que o fluido se move através dos dispositivos; plote o volume amostrado no eixo Y versus o tempo de amostragem no eixo X.

Em um programa simples de gráficos, como o Excel, para obter a inclinação da reta, a inclinação é utilizada para determinar a taxa média de fluxo volumétrico. Uma solução diluída de esferas de látex fluorescentes de três micromolares com superfícies carboxi, YG e YG comum é usada para visualizar o fluxo e estudar as interações superficiais. Primeiro, uma solução de esferas é preparada em água desionizada numa concentração de 0,01% de sólidos.

A solução é adicionada aos poços superiores e o módulo de fluxo é recolocado em zu. O fluxo de microesferas é visualizado ao longo de uma hora e registrado aproximadamente a cada 10 minutos em um microscópio fluorescente Zeiss AIOt 25, equipado com uma câmera monochrome MITx BCEB 0 1 3 U. Quadros individuais são capturados em rápida sucessão e montados em vídeos utilizando um programa de software como o Image J, com iluminação de fluorescência e iluminação de luz transmitida.

As esferas e as estruturas são ambas visíveis. Quando a luz transmitida é bloqueada, apenas as esferas fluorescentes brilhantes são visíveis. Esferas estacionárias depositadas ao longo da superfície inferior ou ligadas aos coletores são evidentes em todo o dispositivo.

Para experimentos com bactérias vivas, prepara-se um cultivo como Vibrio species, uma bactéria não patogênica que expressa proteína verde fluorescente. Primeiro, um cultivo estoque é retirado do congelamento profundo. Um frasco com meio de crescimento LB estéril é inoculado com o cultivo estoque.

Utilizando um alça de inoculação descartável, o frasco é incubado durante a noite com agitação para resultar em uma cultura na fase estacionária com uma concentração de aproximadamente 10 elevado à nona células por mililitro. Dependendo da aplicação, a concentração inicial de bactérias pode ser quantificada com maior precisão. Um dispositivo microfluídico preenchido com tampão estéril é preparado.

Em seguida, o líquido estéril nos poços a montante é esvaziado e substituído por 20 microlitros da cultura bacteriana. Utilizando uma pipeta, as bactérias são semeadas no dispositivo por meio de sucção suave com uma seringa nos poços de saída. Após a incubação, a quantidade de bactérias nos poços pode ser determinada pela quantificação da intensidade de fluorescência de cada poço após a colonização. O poço de entrada a montante é esvaziado como anteriormente e substituído por tampão lavado com 25 partes por mil de sais.

Aplica-se uma pressão suave de água do mar artificial às poças superiores com uma seringa, lavando individualmente as células de fluxo com 20 a 40 microlitros da solução tampão. Isso corresponde aproximadamente a 100 a 200 vezes o volume reduzido da porção de solo microfluídica da célula de fluxo após a lavagem inicial. A perfusão prolongada de bactérias através do meio poroso é obtida mediante o uso do módulo de fluxo exatamente como mostrado anteriormente.

Imagens fluorescentes e de luz branca do crescimento e transporte bacteriano podem ser medidas ao longo do tempo. Neste experimento, as imagens são capturadas a cada 15 a 20 horas durante um período de sete dias com uma câmera CCD refrigerada de cinco cores da Q imaging ink. Nossos dispositivos também podem ser utilizados para investigar os efeitos da estrutura física do habitat em fornecer refúgio às bactérias contra a predação por protozoários.Seen.

Aqui estão bactérias em uma câmara de fluxo com microporos, com os protozoários ciliados muito maiores, Eulo, visíveis no dispositivo se alimentando das bactérias. Na análise do fluxo de fluido no dispositivo microfluídico, verificamos que a taxa média de fluxo é de 0,71 microlitros por minuto para uma carga de pressão de 40 milímetros. Ao aumentar a carga de pressão para 60 milímetros, a taxa de fluxo aumentou proporcionalmente para 1,04 microlitros por minuto.

Ao utilizar esferas com diversas químicas de superfície no dispositivo, observamos uma maior acumulação de esferas não carboxiladas nas superfícies do dispositivo. Enquanto isso, esferas com diâmetro entre seis e 10 milímetros tinham muito mais probabilidade de ficar retidas nas aberturas de poros menores. Taxas de fluxo mais rápidas, causadas por maior pressão hidrostática, resultaram em diminuição da retenção e aprisionamento de esferas, como seria esperado ao analisar o crescimento bacteriano no dispositivo microfluídico eco chipp.

Observamos as diferenças qualitativas na intensidade da imagem em diferentes setores do dispositivo. A intensidade da fluorescência pode ser quantificada como um indicador da biomassa microbiana no canal. Em experimentos em andamento, observamos que as forças contínuas de cisalhamento em condições de baixo fluxo parecem causar agregação bacteriana e formação de flocos, como é evidente nessas imagens. Acabamos de mostrar como criar e utilizar dispositivos microfluídicos simples para medir a escala de partículas, o transporte por colisão em meios porosos, ou para investigar interações microbianas em habitats com microestrutura.

Ao realizar estudos utilizando células de fluxo, é importante considerar a flutuabilidade das esferas e a química de superfície dos coloides e coletadores. Ao reduzir a escala para o regime microfluídico, os efeitos de superfície podem dominar os fenômenos observados. Praticamente qualquer estrutura física pode ser incorporada ao design de células de fluxo microfluídicas.

É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.