Janela em um Microworld: Simple sistemas microfluídicos para estudar o transporte microbiana em Meios Porosos

Demonstramos que, por meio do uso de dispositivos de chip ecológico, as estruturas físicas e as cargas de pressão podem ser mantidas constantes ou variadas. Embora a influência das propriedades do fluido químico da superfície ou as características das partículas ou micróbios sejam investigadas sistematicamente por meio de experimentos de transporte usando uma proteína fluorescente verde não patogênica que expressa a cepa bacteriana VIO, ilustramos a importância da estrutura do habitat, condições de fluxo e tamanho do inóculo nos fenômenos fundamentais de transporte. Software microfluídico visão convincente de um mundo oculto.

Olá, nosso marcador Dimitri do Instituto Vanderbilt para Educação em Restauração Integrativa de Biossistemas da Universidade Vanderbilt. E eu sou David Schafer, um engenheiro de pesquisa e desenvolvimento aqui no Viro Laboratories. Olá, sou Leslie Sho, do Departamento de Materiais Químicos e Engenharia Biomolecular do Centro de Ciência e Engenharia Ambiental da Universidade de Connecticut, e adicionei Dicot também da Zebra.

Hoje vamos mostrar um procedimento para criar matrizes modulares de habitat microfluídico para pesquisa básica em ciência ambiental e engenharia. Usamos esse procedimento em nosso laboratório para investigar os efeitos de estruturas em escala micrométrica nas interações de transporte microbiano em meios florestais. Então vamos começar.

O primeiro passo na criação de um dispositivo microfluídico é desenhar um layout bidimensional do dispositivo em um desenho assistido por computador ou programa CAD. Usamos o AutoCAD, mas outros programas de desenho também estão disponíveis, como clue in ou coral draw. O software permite que o projetista replique fielmente estruturas físicas em um campo macroscópico, enquanto as características individuais são definidas com resolução inferior a cinco mícrons.

A partir do desenho CAD, é criada uma máscara fotográfica. Usamos uma máscara de cromo fabricada pela Advanced Reproductions Corporation, extremo norte de Massachusetts. As próximas etapas da produção de dispositivos microfluídicos ocorrem em uma sala limpa para criar um mestre.

Um wafer de silício limpo é revestido com fotorresistente em um codificador de rotação. Primeiro, o wafer é conectado à plataforma do codificador de rotação e alguns gramas de fotorresistente SU 8 20 25 são despejados no centro do wafer. Em seguida, o wafer é girado por um ciclo inicial de propagação de 15 segundos a 500 RPM, seguido por um ciclo de revestimento fino de 4.000 RPM por 35 segundos.

Após a centrifugação, o wafer é colocado em uma placa quente por 10 minutos a 95 graus Celsius para volatilizar o excesso de solvente. A última etapa na preparação do wafer é remover o cordão de borda. Isso é feito retornando o wafer ao codificador de rotação e aplicando um fluxo constante de removedor de velocidade de borda SUA na borda externa do wafer revestido.

O próximo passo é padronizar o fotorresistente por exposição seletiva à luz UV. Primeiro, o wafer revestido é colocado em uma superfície plana e a máscara cromada é colocada diretamente no topo. O filme de mascaramento vermelho rubi bloqueia a transferência de padrões para fora da área desejada.

Em seguida, uma dose quadrada de 300 mili JUUL por centímetro de luz UV é fornecida ao wafer revestido através da máscara usando um sistema de transporte local. Finalmente, o wafer é cozido por 15 minutos a 95 graus Celsius para reticular as regiões expostas à luz do fotorresistente, tornando-as insolúveis. A última etapa na criação do mestre é remover as regiões não reticuladas do fotorresistente, deixando para trás estruturas de relevo elevadas.

Primeiro, o wafer é devolvido mais uma vez ao codificador de rotação e é coberto com a solução do desenvolvedor. O revelador é deixado no wafer revestido por aproximadamente cinco minutos e depois é desmembrado, resultando em um padrão claramente evidente no wafer. Qualquer resíduo restante é lavado esguichando álcool isopropílico no wafer giratório.

Usamos uma velocidade de rotação de 2200 RPM para esta etapa por cerca de cinco a 10 segundos. Finalmente, o mestre acabado é seco usando um jato de gás nitrogênio e armazenado em um prato até que seja necessário para fundir um dispositivo. Fabricamos dispositivos microfluídicos usando o elastômero de silicone polimetil alano.

Primeiro, o material de base e o agente de cura são entregues em uma proporção de peso de 10 para um em um copo plástico. Em seguida, a mistura é misturada. Andy borbulhou usando um mixer de condicionamento AR 100 pensativo.

Quando o ciclo estiver concluído, o PDMS líquido é derramado uniformemente sobre o mestre. O prato contendo o mestre e o PDMS não curado é então colocado em uma câmara de vácuo para desgaseificar. As bolhas de polímero aparecem quase imediatamente.

A desgaseificação continua até que todas as bolhas desapareçam. O prato é colocado em um forno nivelado a 65 graus Celsius por pelo menos quatro horas para permitir totalmente a reticulação do polímero. Em seguida, o PDMS curado é cuidadosamente removido do mestre reutilizável.

As primeiras quatro bordas são cortadas bem fora da região padronizada usando um bisturi, o dispositivo é retirado do wafer padronizado usando uma pinça. As bordas do dispositivo podem ser cortadas com tesouras, se desejado. Uma subseção do dispositivo pode ser separada do restante do dispositivo PDMS moldado.

Em seguida, os orifícios de acesso são perfurados através do PDMS. Usamos punções de biópsia que estão disponíveis comercialmente em vários tamanhos diferentes montados em um pequeno mandril. Pressione os núcleos PDMS são removidos usando fórceps.

Finalmente, o dispositivo aparado e perfurado é limpo com álcool isopropílico e um cotonete de polipropileno com ponta de espuma. O dispositivo é seco com nitrogênio e colocado no forno para remover todos os vestígios de solvente. A última etapa na fabricação de um dispositivo microfluídico é unir o PDMS a um substrato de lâmina de vidro e, em seguida, encher com fluido primeiro.

O dispositivo PDMS e uma lâmina de vidro são colocados com a superfície de colagem espaçada em um limpador de plasma. Neste experimento, usamos um limpador de plasma herrick PDC 32 G. Uma vez estabelecido o vácuo e visível o plasma violeta azul, é definido um temporizador para 30 segundos.

O gerador de plasma está desligado. A câmara é repressurizada e o dispositivo e o controle deslizante retirados da câmara e das superfícies de ligação são colocados em contato. Ao remover os componentes ativados da câmara, é importante mover-se rapidamente para que as superfícies permaneçam ativadas.

A pressão suave ajuda a garantir uma boa ligação. A qualidade da ligação é verificada puxando um canto com uma pinça. O interior hidrofílico pode então ser facilmente preenchido com uma solução aquosa, como meio tampão ou deionizado.

O fluido de água é administrado em cada poço de fonte e através da célula de fluxo microporosa correspondente. Quando todas as câmaras estiverem cheias, uma fina camada de PDMS curado é colocada sobre todo o dispositivo para ajudar a retardar a evaporação e manter a esterilidade. Para calibrar o fluxo acionado por pressão no dispositivo, pré-carregue as células de fluxo microestruturadas com água deionizada, coloque um módulo de fluxo, que atua como uma interface de entrega de fluido e uma vedação estéril na parte superior do dispositivo.

Este módulo de fluxo pode ser usado sozinho ou conectado a um reservatório externo contendo fluido, como uma seringa de plástico. Conecte um reservatório contendo líquido, como uma seringa de plástico ou o módulo de fluxo, à entrada a montante. Bem manter a altura do fluido no reservatório acima da altura do jusante.

Bem, a diferença de altura entre o reservatório a montante e cada poço de saída a jusante define a força motriz do fluxo acionado por pressão para quantificar as taxas de fluxo através dos dispositivos. Uma agulha de calibre 25 de extremidade romba é usada para coletar amostras dos poços a jusante em intervalos regulares. Por exemplo, coletamos amostras a cada 15 a 20 minutos, observando cuidadosamente o tempo real decorrido entre as amostras.

O peso da seringa é registado antes e depois da amostragem numa balança analítica. O volume agregado versus o tempo agregado é mapeado com a inclinação igual à vazão mássica média. A grande seção transversal do reservatório de entrada versus os poços de saída ajuda a evitar que as taxas de fluxo mudem significativamente à medida que o fluido se move através dos dispositivos, plotando o volume amostrado no eixo Y versus o tempo de amostragem no eixo x.

Em um programa gráfico simples, como o Excel, para obter a inclinação da linha, a inclinação é usada para a vazão volumétrica média. Uma solução diluída de três esferas de látex fluorescentes micromolares com superfícies carboxi, YG e YG lisas é usada para visualizar o fluxo e estudar as interações da superfície. Primeiro, uma solução de grânulos é preparada em água deionizada a uma concentração de 0,01% de sólidos.

A solução é adicionada aos poços a montante e o módulo de fluxo é reconectado ao zu. O fluxo do cordão de fluxo é visualizado ao longo de uma hora e registrado aproximadamente a cada 10 minutos em um microscópio fluorescente Zeiss AIOt 25, equipado com uma câmera monocromática MITx BCEB 0 1 3 U. Os fotogramas individuais são captados em rápida sucessão e montados em filmes utilizando um programa de software como o Image J com iluminação de fluorescência e iluminação de luz transmitida.

As contas e estruturas são visíveis. Quando a luz transmitida é bloqueada, apenas as esferas fluorescentes brilhantes são visíveis. Contas estacionárias depositadas ao longo da superfície inferior ou presas aos coletores são evidentes em todo o dispositivo.

Para experimentos usando bactérias vivas, uma cultura como a espécie Vibrio, uma bactéria que expressa uma proteína fluorescente verde não patogênica é preparada. Primeiro, uma cultura de estoque é removida do armazenamento livre profundo. Inocula-se um balão com meio de cultura LB estéril com a cultura-mãe.

Utilizando uma alça de inoculação descartável, o balão é incubado durante a noite com agitação para resultar numa cultura em fase estacionária com uma concentração de cerca de 10 elevado à nona célula por mililitro. Dependendo da aplicação, a concentração inicial de bactérias pode ser quantificada com mais precisão. Um dispositivo microfluídico preenchido com tampão estéril é preparado.

Em seguida, o líquido estéril nos poços a montante é esvaziado e substituído por 20 microlitros da cultura de bactérias. Usando uma pipeta, as bactérias são semeadas no dispositivo usando sucção suave com uma seringa nos poços de saída Após a incubação, a quantidade de bactérias nos poços pode ser determinada quantificando a intensidade de fluorescência de cada poço após a colonização. O poço de entrada a montante é esvaziado como antes e substituído por tampão lavado com 25 partes por mil sais.

A pressão suave da água do mar artificial é aplicada aos poços a montante com uma seringa que lava as células de fluxo individuais com 20 a 40 microlitros da solução tampão. Isso é aproximadamente 100 a 200 vezes o volume pobre da porção microfluídica do solo da célula de fluxo após a descarga inicial. A perfusão a longo prazo de bactérias através do meio poroso é alcançada pelo uso do módulo de fluxo exatamente como mostrado anteriormente.

Imagens fluorescentes e de luz branca do crescimento e transporte bacteriano podem ser medidas ao longo do tempo. Neste experimento, as imagens são tiradas a cada 15 a 20 horas por um período de sete dias com uma câmera CCD resfriada a cores de cinco da tinta de imagem Q. Nossos dispositivos também podem ser usados para investigar os efeitos da estrutura física do habitat no fornecimento de refúgio bacteriano contra a predação por protozoários. Óbvio.

Aqui estão as bactérias em uma célula de fluxo microporosa com o protozoário ciliado muito maior eulo visível no dispositivo pastando em bactérias. Na análise do fluxo de fluido no dispositivo microfluídico, descobrimos que a vazão média é de 0,71 microlitros por minuto para uma carga de pressão de 40 milímetros. Ao aumentar a carga de pressão para 60 milímetros, a vazão aumentou proporcionalmente para 1,04 microlitros por minuto.

Ao usar grânulos com várias químicas de superfície no dispositivo, observamos um maior acúmulo de grânulos não carboxilados nas superfícies do dispositivo. Enquanto contas de seis a 10 milímetros de diâmetro eram muito mais propensas a serem arrastadas nas aberturas menores dos poros. Taxas de fluxo mais rápidas causadas por maior pressão hidrostática resultaram em diminuição da retenção e arrastamento do grânulo, como seria de se esperar para analisar o crescimento bacteriano no dispositivo microfluídico eco chipp.

Notamos as diferenças qualitativas na intensidade da imagem em diferentes setores do dispositivo. A intensidade da fluorescência pode ser quantificada como um proxy para a biomassa microbiana no canal. Em experimentos em andamento, observamos que as forças de cisalhamento contínuas de condições de baixo fluxo parecem causar agregação bacteriana e formação de bandos, como é evidente nessas imagens, Acabamos de mostrar como criar e usar dispositivos microfluídicos simples para medir a escala de partículas, transporte de colisão através de meios porosos ou investigar interações microbianas em habitats microestruturados.

Ao realizar estudos usando células de fluxo, é importante considerar a flutuabilidade dos grânulos e a química da superfície dos colóides e coletores. Ao reduzir para o regime microfluídico, os efeitos de superfície podem dominar os fenômenos observados. Praticamente qualquer estrutura física pode ser incorporada ao projeto de célula de fluxo microfluídico.

Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.