Semiautomated Longitudinal baseados em Microcomputed tomografia computadorizada quantitativa análise estrutural de um modelo de fratura Vertebral relacionadas com osteoporose rato Nude

O objetivo geral deste modelo cirúrgico e método de análise de imagem é observar o efeito do seu tratamento em um modelo pré-clínico de fratura por compressão vertebral relacionada à osteoporose. Este método pode ajudar a responder a questões-chave neste campo da medicina regenerativa glial, como o que poderia ser um tratamento eficaz para fraturas por compressão vertebral relacionadas à osteoporose e como esse tratamento ajudaria na regeneração óssea? A principal vantagem dessa técnica é que ela envolve ratos nus para que novos tratamentos possam ser testados in vivo sem preocupações com rejeição imunológica.

Além disso, a regeneração óssea subjacente a este método aqui apresentado é semiautomatizado, por isso é mais preciso e menos dependente do usuário do que o publicado anteriormente. Demonstrando o procedimento estará o Dr. Wafa Tawackoli, um cientista pesquisador de nosso laboratório. Primeiro induza a anestesia em um rato osteoporótico usando 5% de isoflurano em 100% de oxigênio e, em seguida, transfira para um cone nasal de dois a 3% de isoflurano para manutenção.

Depile a área abdominal usando um barbeador elétrico. Esfregue com anti-séptico à base de iodo em gluconato de clorexidina a 0,5% seguido de etanol a 70%. Use pomada veterinária nos olhos para evitar o ressecamento durante a anestesia.

Aplique um estímulo de pinça do dedo do pé para garantir um plano adequado de anestesia. Se nenhuma resposta for anotada, inicie o procedimento. Coloque o rato anestesiado em decúbito dorsal em uma almofada de aquecimento ajustada para 37 graus Celsius e estique os membros usando um sistema de retração do fixador magnético.

Injete carprofeno no rato por via subcutânea antes de iniciar o procedimento cirúrgico. Depois de fazer uma incisão de cinco a oito centímetros na pele começando um centímetro abaixo do apêndice xifóide e através da linha média, use uma tesoura cirúrgica para fazer uma incisão da aponeurose através da linha alba para acessar a cavidade abdominal. Exponha a cavidade abdominal usando afastadores.

Desvie os intestinos para a direita do rato para expor a aorta abdominal e o rim esquerdo. Para evitar a desidratação, use gazes embebidas estéreis para envolver os órgãos internos. Use afastadores adicionais conforme necessário para expor a aorta.

Palpe a coluna lombar e prossiga para expô-la. Use o termocautério para expor o aspecto anterior dos corpos vertebrais lombares L quatro a cinco e isolá-los do tecido conjuntivo e dos músculos circundantes. Use um cotonete para remover sangue e tecido residual das quatro vértebras L.

Em seguida, use uma broca estéril de dois centímetros de diâmetro para perfurar um defeito ósseo de cinco milímetros de profundidade no centro do aspecto anterior exposto do corpo vertebral. Aplique pressão mínima para perfurar apenas o córtex ventral e o osso trabecular subjacente. Evite perfurar o córtex dorsal.

Em seguida, perfure as cinco vértebras L da mesma maneira para criar dois defeitos por rato. Quando a perfuração estiver concluída, retorne os intestinos à cavidade abdominal e remova os afastadores. Em seguida, use a sutura cirúrgica absorvível sintética vicryl em um padrão contínuo para suturar a aponeurose.

Feche a pele usando uma sutura inabsorvível de nylon monofilamentar 4-0 em um padrão simples interrompido. Em seguida, aplique 100 microlitros de adesivo tópico para a pele em cima e entre as suturas da pele para garantir o fechamento completo da pele. Depois de injetar no rato a solução de Ringer com lactato a 37 graus Celsius para prevenir hipotermia e desidratação e buprenorfina para alívio da dor pós-operatória, permita que o animal se recupere da anestesia na almofada de aquecimento.

No dia seguinte ao procedimento cirúrgico, induzir anestesia com isoflurano como antes. Escaneie o rato usando um scanner de micro-CT in vivo. Após a varredura e a recuperação da anestesia, retorne o rato à gaiola de casa.

Para separar os dados das vértebras para análise, clique no programa de avaliação de micro-CT e selecione a amostra no menu. Em seguida, use o mouse para contornar vértebras individuais em uma fatia. Use a barra Z para ir para a próxima fatia e contorne as vértebras individuais da mesma maneira.

Salve a vértebra contornada como um arquivo separado clicando no arquivo, salve GOBJ a cada duas fatias. Em seguida, depois de definir a vértebra de referência, importe-a para um ambiente de micro-CT. Aplique o VOI definido para a vértebra de referência à vértebra alvo registrada clicando no programa de avaliação micro-CT, arquive, carregue GOBJ e selecionando o GOBJ criado anteriormente.

Por fim, envie o VOI para avaliação usando um programa de avaliação de micro-CT. Esta imagem 3D frontal mostra uma imagem representativa do defeito vertebral um dia após a geração do defeito. A formação óssea no vazio é indicada em vermelho.

Esta é uma imagem 2D sagital da mesma área e, finalmente, uma imagem 2D axial. Como visto aqui, a formação óssea ocorre ao longo do tempo e é detectada com imagens longitudinais. A densidade do volume ósseo e a densidade aparente foram calculadas e comparadas usando uma ANOVA de duas vias de medidas repetidas com correção de Bonferroni para comparações múltiplas.

Como visto aqui, a densidade do volume ósseo e a densidade aparente aumentam significativamente a partir de duas semanas após a criação do defeito vertebral. Após este procedimento, outros métodos, como histologia e imuno-histoquímica, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como quais células estão presentes e quais proteínas são expressas no defeito. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como criar vários defeitos vertebrais em ratos nus e analisar a regeneração óssea ao longo do tempo nesses defeitos.