Geração de variantes de fuga de neutralizar os anticorpos monoclonais de vírus da gripe

O objetivo geral deste método é fornecer um protocolo funcional sobre como elucidar o epítopo de um anticorpo monoclonal neutralizante. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave nas áreas de imunologia e virologia que contribuem para definir as interações entre hospedeiro e vírus, desenvolver terapêuticas e ferramentas diagnósticas, tudo o que pode auxiliar no desenvolvimento de vacinas. A principal vantagem desta técnica é que ela pode ser realizada com técnicas básicas de cultura de tecidos e biologia molecular, sem a necessidade de instrumentos ou equipamentos especiais.

Quem demonstrará o procedimento será Mark Bailey, estudante de medicina e doutorado do laboratório de Peter Palese. Inicie este procedimento com a caracterização dos anticorpos com base na inibição da hemaglutinação, ou IH, e nas atividades de neutralização, conforme descrito no protocolo textual. Os anticorpos neutralizantes que apresentam atividade de IH são analisados posteriormente, preparando-se primeiro quatro diluições do anticorpo de interesse em concentrações crescentes em PBS uma vez, em um volume de 100 microlitros por diluição.

Em seguida, prepare um estoque viral de um milhão de unidades formadoras de placa por mililitro em PBS uma vez, em um volume de 400 microlitros. Depois, misture 100 microlitros de um milhão de unidades formadoras de placa por mililitro de vírus com 100 microlitros de cada diluição de anticorpo ou 100 microlitros de PBS uma vez. Incube as amostras por uma hora em um incubador a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.

Após agitar brevemente em vórtex, injete 200 microlitros de cada mistura em ovos de galinha embrionados livres de patógenos específicos. Em seguida, incube os ovos a 37 graus Celsius, sem dióxido de carbono, por 40 a 44 horas. Após a incubação, sacrifique os ovos embrionados infectados com o vírus colocando-os a quatro graus Celsius por um mínimo de seis horas.

Em seguida, colete o fluido alantoico dos ovos conforme descrito anteriormente. Por fim, confirme as variantes de escape realizando o ensaio de inibição da hemaglutinação (HI) conforme descrito no protocolo do texto. Para gerar variantes de escape contra anticorpos neutralizantes que não possuem atividade HI, o vírus deve ser passado na presença de quantidades crescentes de anticorpo.

Plaque as células MDCK em uma placa de seis poços com uma densidade de um milhão de células por poço. Incube as células por um mínimo de quatro horas em um incubador a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Enquanto isso, dilua o estoque viral para um milhão de unidades formadoras de placa por mililitro.

Prepare uma diluição única de anticorpo a 0,02 miligramas por mililitro em MEM 1x com tripsina tratada com TPCK em um volume de 250 microlitros. Utilize concentrações mais altas de anticorpo para todos os seguintes cultivos. Misture 250 microlitros de vírus diluído com 250 microlitros de anticorpo diluído, ou 250 microlitros de MEM 1x como controle sem anticorpo.

Incube a mistura de vírus e anticorpo por 30 minutos em um incubador a 37 °C com 5% de dióxido de carbono. Após a incubação das células, aspire o meio utilizando uma pipeta de Pasteur de vidro e lave a monocamada de células com um mililitro de PBS 1x. Adicione 500 microlitros das misturas aos poços antes de incubar em um incubador a 37 °C com 5% de dióxido de carbono por uma hora.

Após uma hora, complemente os poços com dois mililitros de MEM uma vez com tripsina tratada com TPCK. Verifique as células após 48 horas pós-infecção quanto a sinais do efeito citopático, ou CPE, ao microscópio, ou realize um ensaio de hemaglutinação para detectar o crescimento viral. Se houver crescimento com CPE na cultura suplementada com anticorpo, colete o sobrenadante em múltiplos criotubos.

Rotule os tubos com o número de passagem e armazene-os a menos 80 graus Celsius. Guarde 100 microlitros do sobrenadante para infectar uma nova monocamada de MDCKs com dois mililitros de MEM um vezes suplementado com tripsina TPCK e anticorpo. Lembre-se de incluir um controle sem anticorpo para cada passagem.

Aumente a concentração do anticorpo em cada passagem sucessiva até que o crescimento do vírus ainda seja viável, mesmo com a concentração final de 0,6 miligramas por mililitro de anticorpo. Congele múltiplos frascos do sobrenadante de cada passagem e armazene a menos 80 graus Celsius. Prossiga para o isolamento e as análises das variantes escapadas conforme detalhado no protocolo do texto.

Anticorpos induzidos por vacina, isolados de indivíduos vacinados com a vacina candidata contra influenza A H7N9, foram utilizados para gerar variantes mutantes de escape. O mapeamento dos mutantes de escape revelou que muitos dos anticorpos reconhecem resíduos críticos em locais distintos na HA viral. Cada resíduo, indicado em vermelho, representa a localização de aminoácidos críticos necessários para a ligação eficiente de um anticorpo monoclonal, enquanto a maioria dos anticorpos positivos para inibição de hemaglutinação (HI) apresentou resíduos mutantes de escape próximos aos sítios antigênicos previamente descritos na H7HA. Os anticorpos negativos para HI geraram mutantes de escape com mutações pontuais na região do estipe.

Uma vez dominada, esta técnica pode ser aplicada para elucidar os determinantes estruturais de proteção contra outros patógenos. Esta técnica não se limita apenas à geração de variantes de escape de anticorpos monoclonais, mas também contra compostos antivirais. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como elucidar o epítopo de ligação de anticorpos monoclonais por meio da geração de variantes de escape in vitro.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de ter cautela ao trabalhar com vírus e utilizar equipamentos de proteção pessoal apropriados.