Geração de variantes de fuga de neutralizar os anticorpos monoclonais de vírus da gripe

O objetivo geral deste método é fornecer um protocolo de trabalho sobre como elucidar o epítopo de um anticorpo monoclonal neutralizante. Este método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos da imunologia e virologia que podem ajudar a definir as interações do vírus do hospedeiro, desenvolver terapêuticas e ferramentas de diagnóstico, todas as quais podem ajudar no projeto de vacinas. A principal vantagem desta técnica é que ela pode ser realizada com técnicas básicas de cultura de tecidos e biologia molecular sem instrumentos ou equipamentos especiais.

Demonstrando o procedimento estará Mark Bailey, um MD, estudante de doutorado do laboratório de Peter Palese. Comece este procedimento com a caracterização de anticorpos com base na inibição da hemoaglutinação, ou HI, e nas atividades de neutralização, conforme descrito no protocolo de texto. Os anticorpos neutralizantes que possuem atividade HI são analisados pela preparação inicial de quatro diluições do anticorpo de interesse em concentrações crescentes em um PBS de uma vez em um volume de 100 microlitros por diluição.

Em seguida, prepare um estoque de vírus de um milhão de unidades formadoras de placa por mililitro em um PBS de uma vez em um volume de 400 microlitros. Em seguida, misture 100 microlitros de um milhão de unidades formadoras de placas por mililitro de vírus com 100 microlitros de cada diluição de anticorpos ou 100 microlitros de uma vez PBS. Incube as amostras por uma hora em uma incubadora a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.

Após o vórtice brevemente, injete 200 microlitros de cada mistura em ovos de galinha embrionados específicos livres de patógenos. Em seguida, incube os ovos a 37 graus Celsius sem dióxido de carbono por 40 a 44 horas. Após a incubação, sacrifique os ovos embrionados infectados pelo vírus, colocando-os a quatro graus Celsius por um período mínimo de seis horas.

Em seguida, colha o fluido alantóide dos ovos conforme descrito anteriormente. Por fim, confirme as variantes de escape realizando o ensaio HI conforme descrito no protocolo de texto. Para gerar variantes de escape contra anticorpos neutralizantes que não possuem atividade HI, o vírus deve ser transmitido na presença de quantidades crescentes de anticorpos.

Colocar células MDCK em uma placa de seis poços com uma densidade de um milhão de células por poço. Incube as células por no mínimo quatro horas em uma incubadora de 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Enquanto isso, dilua o estoque de vírus para um milhão de unidades formadoras de placa por mililitro.

Prepare uma única diluição de anticorpo a 0,02 miligramas por mililitro em um MEM de uma vez com tripsina tratada com TPCK em um volume de 250 microlitros. Use concentrações mais altas de anticorpos para todas as passagens seguintes. Misture 250 microlitros de vírus diluído com 250 microlitros de anticorpo diluído, ou 250 microlitros de um vezes MEM como controle sem anticorpos.

Incube a mistura de anticorpos do vírus por 30 minutos em uma incubadora a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Após a incubação das células, aspirar o meio com uma pipeta de vidro Pasteur e lavar a monocamada de células com um mililitro de uma vez PBS. Adicione 500 microlitros das misturas nos poços antes de incubar em uma incubadora de 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por uma hora.

Após uma hora, suplementar os alvéolos com dois mililitros de um vezes MEM com tripsina tratada com TPCK. Verifique as células 48 horas após a infecção em busca de sinais do efeito citopático, ou CPE, no microscópio, ou realize um ensaio de hemoaglutinação para detectar um crescimento viral. Se houver CPE de crescimento na cultura suplementada com anticorpos, colher o sobrenadante em vários criotubos.

Rotule os tubos com o número da passagem e armazene-os a menos 80 graus Celsius. Economize 100 microlitros do sobrenadante para infectar uma nova monocamada de MDCKs com dois mililitros de um vezes MEM suplementado com tripsina TPCK e anticorpo. Lembre-se de incluir um controle sem anticorpos para cada passagem.

Aumente a concentração do anticorpo em cada passagem sucessiva até que o crescimento do vírus ainda seja viável, mesmo com a concentração final de 0,6 miligramas por mililitro de anticorpo. Congele os vários frascos de sobrenadante de cada passagem e armazene a 80 graus Celsius negativos. Continue para o isolamento e análises das variantes de escape, conforme detalhado no protocolo de texto.

Anticorpos induzidos por vacina isolados de indivíduos vacinados com a vacina candidata contra influenza A H7N9 foram usados para gerar variantes mutantes de escape. O mapeamento do mutante de escape revelou que muitos dos anticorpos reconheceram resíduos críticos em locais distintos no AH viral. Cada resíduo, indicado em vermelho, representa a localização dos aminoácidos críticos necessários para a ligação eficiente de um anticorpo monoclonal, enquanto a maioria dos anticorpos HI-positivos escapou de resíduos mutantes próximos a locais antigênicos relatados anteriormente do H7HA. Os anticorpos HI-negativos geraram mutantes de escape com mutações pontuais na região de estoque.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser aplicada para elucidar os determinantes estruturais da proteção contra outros patógenos. Essa técnica não se limita apenas a gerar variantes de escape de anticorpos monoclonais, mas também contra compostos antivirais. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como elucidar o epítopo de ligação de anticorpos monoclonais gerando variantes de escape in vitro.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de ser cauteloso ao trabalhar com vírus e usar equipamentos de proteção individual adequados.