Divisão celular dos mamíferos em matrizes 3D através de microscopia de reflexão Confocal quantitativa

Este protocolo eficientemente estuda divisão de células de mamíferos em matrizes de colágeno 3D, integrando a sincronização da divisão celular, monitoramento de eventos de divisão em matrizes 3D usando a técnica de imagem live-célula, microscopia de reflexão confocal tempo-resolvido e análise quantitativa de imagem.

O objetivo geral deste procedimento é estudar a divisão celular de mamíferos e as interações da matriz celular em um ambiente 3D fisiologicamente relevante. A principal vantagem desta técnica é que ela fornece uma abordagem eficiente e geral para estudar a divisão celular de mamíferos e as interações da matriz celular. Este método pode ajudar a responder a questões-chave em biologia celular, como a base molecular do desenvolvimento do tecido normal e da doença.

Um dia antes da transfecção, coloque cinco milhões de células T HEK-293 em uma placa de cultura de células de 100 mililitros em 10 mililitros de meio de cultura de células normal. Incube essas células a 37 graus Celsius por 24 horas em uma incubadora umidificada com 5% de dióxido de carbono. No dia seguinte, pouco antes de iniciar as transfecções, remova um frasco do reagente de transfecção de quatro graus Celsius e deixe-o fora para atingir a temperatura ambiente.

Então, para começar, adicione um mililitro de meio de soro reduzido a um tubo de microcentrífuga estéril. Para isso, adicione quantidades especificadas de plasmídeos de vetores lentivirais usados para transfecção e misture por pipetagem. Incube o tubo em temperatura ambiente por cinco minutos.

Após cinco minutos, adicione 48 microlitros do reagente de transfecção neste tubo e misture delicadamente pipetando. Em seguida, incube essa mistura em temperatura ambiente por pelo menos 15 minutos. Quando a incubação estiver concluída, remova a placa com células T HEK-293 da incubadora.

Adicione a mistura de reagentes de transfecção de DNA preparada gota a gota nas células e gire suavemente a placa para garantir uma distribuição uniforme na placa. Coloque a placa de volta na incubadora. Aproximadamente seis horas após a transfecção, remova a placa e aspire o meio.

Adicione 10 mililitros de meio de cultura fresco e transfira a placa de volta para a incubadora. Em vários momentos, 24, 48 e 72 horas após a transfecção, colha o meio de cultura contendo as partículas lentivirais em tubos separados. Em seguida, filtre o meio de cultura colhido através de um filtro estéril de 0,45 mícron para remover os detritos celulares.

Substituir por meio de cultura fresco após cada colheita. O filtrado contendo as partículas lentivirais pode ser usado para transdução imediatamente ou pode ser armazenado a 80 graus Celsius negativos. Células de carcinoma de mama humano MDA-MB-231 em uma placa de cultura de 35 milímetros em meio de cultura normal.

Incube essas células a 37 graus Celsius por 24 horas em uma incubadora umidificada com 5% de dióxido de carbono. No dia seguinte, aspirar o meio de cultura da placa e adicionar um mililitro das partículas lentivirais juntamente com um mililitro de meio de cultura fresco. Incube as células na incubadora por cerca de 16 horas.

Após a incubação com partículas virais estar completa, remova a placa para aspirar o meio. Em seguida, adicione dois mililitros de meio fresco e transfira de volta para a incubadora por 24 a 72 horas. Verifique a expressão de H2B-mCherry nessas células transduzidas usando um microscópio de epifluorescência.

Para iniciar os experimentos de sincronização, primeiro coloque células MDA-MB-231 expressando H2B-mCherry em 50 a 60% de confluência em uma placa de 24 poços. Incube a cultura a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 24 horas. No dia seguinte, substitua o meio de cultura por 0,5 mililitros de meio contendo dois milimolares de timidina.

Deixe a placa na incubadora por 24 horas. Quando a incubação estiver completa, lave as células três vezes com PBS para liberá-las do tratamento com timidina. Em seguida, deixe as células em 0,5 mililitros de meio de cultura normal por cinco horas na incubadora.

Depois disso, para bloquear essas células na mitose, adicione Nocodazol ao meio de cultura. Deixe as células na incubadora por 12 horas. Após a conclusão do tratamento com Nocodazol, retire a placa e, usando um agitador orbital, agite as células por 45 segundos a um minuto para liberar as células mitóticas.

Em seguida, transferir o meio que contém as células mitóticas extraídas para um novo tubo de centrifugação. Em seguida, adicione 0,5 mililitros de meio fresco a cada poço. Depois, repita a agitação e a extração das células mais duas vezes.

Agrupe o meio total coletado e centrifugue-o para peletar as células mitóticas. Após a centrifugação, ressuspenda o pellet celular em 0,25 mililitros de meio de cultura de células frescas. Usando um hemocitômetro, conte o número de células.

No início desta etapa, prepare 50 mililitros de solução 10x DMEM e esterilize por filtro. Em seguida, determine os volumes de todos os componentes que serão usados para fazer a matriz de colágeno 3D, conforme especificado no protocolo de texto. Pré-resfrie todos esses componentes no gelo para retardar a gelificação do colágeno.

Agora, a um tubo de centrífuga pré-resfriado de 1,5 mililitro, adicione o número necessário de células em meio e depois 10x DMEM, FBS, água deionizada, colágeno e, finalmente, hidróxido de sódio. Misture cuidadosamente usando uma pipeta de um mililitro. Assim que a solução estiver bem misturada, adicione 500 microlitros da mistura em cada poço da placa de 24 poços.

Coloque a placa de 24 poços em uma incubadora de 37 graus Celsius. Após 30 minutos, retire a placa e adicione 500 microlitros de meio de cultura pré-aquecido por cima do gel. Antes da imagem, ligue as unidades de células vivas dos microscópios de contraste de fase e confocais.

Para capturar células em divisão, coloque a placa de 24 poços contendo as células incorporadas nas matrizes de colágeno na unidade de células vivas do microscópio de fluorescência. Usando a objetiva 10X, encontre a parte inferior da placa e mova-a para cima até que o microscópio se concentre a cerca de 500 micrômetros da parte inferior da placa. Mova o palco para encontrar células em diferentes estágios de mitose e selecione várias posições para imagens.

Configure o experimento de lapso de tempo com intervalos de dois minutos. Em seguida, para obter imagens da rede de colágeno, configure o microscópio confocal para capturar apenas a luz refletida do laser de 488 nanômetros. Em seguida, coloque a placa contendo células em matrizes de colágeno na unidade de células vivas deste microscópio.

Encontre a parte inferior da placa e mova a lente objetiva para cima até que ela se concentre a cerca de 100 micrômetros da parte inferior da placa. Mova o palco para encontrar células e selecione várias posições para a geração de imagens. Configure o experimento de lapso de tempo com intervalos de cinco minutos.

Imagens fluorescentes de uma célula em divisão H2B-mCherry expressando MDA-MB-231 embutida na matriz de colágeno são mostradas aqui. Diferentes fases da mitose são prontamente observadas conforme o esperado. A distribuição das fibras colágenas no branco visualizado simultaneamente usando microscopia de reflexão confocal muda muito pouco durante o curso da mitose.

A fase G2-M sincronizada com células e embutida em uma matriz de colágeno completa a divisão celular nas primeiras duas horas, enquanto as células assíncronas de controle se dividem aleatoriamente. A quantificação da distribuição das fibras colágenas durante as fases interfásica e mitótica sugere que a deformação da matriz é mínima durante a divisão celular e maior nas células interfásicas. Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em sete dias, desde a geração da linhagem celular estável até a análise da divisão celular de vídeo em uma matriz 3D.

Depois de assistir a este vídeo, você espera ter uma boa compreensão de como sincronizar e monitorar a divisão celular de mamíferos em matrizes 3D usando imagens de células vivas e como determinar a deformação da matriz usando microscopia de reflexão confocal e técnicas de análise de imagem quantitativa.