Name: Microscopia ótica quantitativa: Measurement of Cellular Biofísica Características com um microscópio óptico padrão (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-07T14:45:00.000+00:00
Duration: 14 min 9 s
Description: Aprenda a quantificar massa, volume e densidade celular usando microscopia ótica padrão com imagens de campo claro e contraste de interferência diferencial. Esta técnica não invasiva permite analisar células vivas sem fixação ou coloração.

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Este trabalho foi financiado por subvenções dos Institutos Nacionais de Saúde (U54CA143906 a KGP, OJTM e R01HL101972 para OJTM) e uma Fundação de Pesquisa de Oregon Medical Cedo Clínica Investigator Award (KGP). OJTM é um Investigador Fundada American Heart Association (13EIA12630000). Agradecemos ao Dr. Eric Anderson, do Instituto do Câncer Knight para preparação de amostras de células utilizadas neste trabalho.

1. Microscópio Especificações Para a realização de imagens na forma correta o microscópio deve ter as seguintes especificações: <ol><li> Possuir tanto contraste de interferência diferencial (DIC) e de campo claro (BF) de contraste. </li><li> Já movimento do eixo z controlados por computador. </li><li> Possui uma paragem de abertura ajustável para variar a abertura numérica da lente de condensador. Uma abertura com uma regra graduada ou leitura eletrônica é necessária para saber o valor da abertura numérica. A abertura numérica que varia de 0,1 para NIQPM até 0.9 (ou superior) para HTDIC. </li><li> O microscópio deve ter um filtro de cor estreita faixa a ser utilizado para brilhante imagem de campo. Este filtro é necessário para corrigir o incremento de refração, uma facture dependente do comprimento de onda utilizado para converter fase de densidade de massa para NIQP. </li></ol> 2. Contraste de interferência diferencial (DIC) Aquisição Z-stack <ol><li> Abra o software de um Slidebookª criar um novo slide para a coleta de imagem. </li><li> Em seguida, abra a janela Focus. Na seção Conjunto de Filtros, selecione DIC. Na guia Escopo, na seção do condensador, ajuste o controle deslizante de abertura para o mais distante posição correta (aberto todo o caminho). Isto proporciona uma iluminação elevada abertura numérica e de corte aumenta óptica da amostra. </li><li> Concentre-se na amostra usando uma objetiva DIC. Ajuste a intensidade da lâmpada de halogéneo até que a amostra é facilmente visível. Para garantir que a câmera não está sendo saturado, selecione a aba Camera na Janela Foco e verifique se o histograma de intensidades de pixel está dentro da faixa dinâmica da câmera. </li><li> Abra a janela de Captura de Imagem. Na seção Tipo de captura, marque a caixa 3D. Na seção de captura 3D, selecione o intervalo em torno do centro e voltar para o local atual </strong&gt; caixas e especificar o intervalo Z-direção, número de aviões e tamanho do passo. O intervalo Z-direção deve incorporar toda a amostra. </li><li> Na seção Conjunto de Filtros da janela de Captura de Imagem, marque a caixa DIC e especifique o tempo de exposição. Na seção Informações da Imagem, o nome da imagem (opcional), e selecione Iniciar para iniciar a imagem. </li></ol> 3. Campo Bright (BF) Aquisição Z-stack <ol><li> Uma vez que o microscópio foi concluída a coleta do Z-stack da amostra DIC, abra a janela de foco e selecione Abrir na seção Set Filter. Ajuste a barra deslizante de abertura para o mais distante posição esquerda (fechado todo o caminho) para fornecer iluminação baixa NA. </li><li> Mude o filtro microscópio de luz caminho para verde. Ajustar a intensidade de luz de halogéneo, até a amostra é visível. Certifique-se de que não há saturação da câmera selecionando o <strong&gt; guia Câmera na Janela Foco e verificar se o histograma de intensidades de pixel está dentro da faixa especificada. </li><li> Abra a janela de Captura de Imagem. As configurações de captura 3D a partir da aquisição Z-stack DIC será exibida. </li><li> Na seção Conjunto de Filtros da janela de Captura de Imagem, marque a caixa aberta e especifique o tempo de exposição. Na seção Informações da Imagem, o nome da imagem (opcional), e selecione Iniciar para iniciar a aquisição de imagens Z-stack. </li></ol> 4. Exportando Z-stack Images <ol><li> Abra uma captura Z-stack. Alterar a vista para 100%. Ajustar o histograma dos valores de pixel a serem exibidas entre 0 e o valor de pixel máximo da câmara (4,095 para 12 câmaras de bits, 65.535 para 16 bits.). </li><li> Selecione Exibir&gt; Export&gt; Série TIFF. Isto irá exportar o Z-stack como uma série de imagens TIFF(Um para cada plano Z). Salve a série TIFF em uma pasta separada com um nome que tem um sublinhado no final (ou seja, &quot;DIC Stack 1_&quot;). Repita este procedimento com cada Z-stack DIC ou BF. </li></ol> 5. Desconto Medidas <ol><li> Abra o programa HTDIC MATLAB intitulado &quot;JoVE_HTDIC_v1.m&quot;. </li><li> Nos termos do artigo 0 do programa HTDIC, atualize a variável diretório dependências. Copie e cole o diretório que contém o hilbert_transform_dic.m e arquivos sobel_edge_detect.m do explorador (PC) entre as aspas simples seguinte &quot;dependencies_directory =&quot;. ExecuteSection 0 do programa JoVE_HTDIC_v1.m. </li><li> Na Seção 1, atualize o &quot;images_directory&quot;. Mais uma vez, copie e cole o diretório que contém as imagens através de foco na forma tif. Entre as aspas simples. Só correr SEÇÃO 1 VEZ. </li><li> Alinhamento e rotação de imagens para Hilbert transformar Run Seção 2 do código. A caixa de diálogo intitulada &quot;Definir parâmetros HTDIC&quot; irá aparecer. Cinco numbers são exigido do usuário: o número de plano focal onde a imagem DIC da amostra está em foco, resolução lateral (mm / pixel na imagem), a resolução axial (isto é 0,1 para aquisição de imagem em 0,1 mM passos axiais), o ângulo da imagem DIC rotação necessária para realizar a transformada de Hilbert, os valores típicos são de 45 e -135. Por fim, entram na região de tamanho interesse, este parâmetro define o comprimento de um lado de uma caixa, que em seguida aparecem - valor típico é de 400. Clique em OK. </li><li> Uma imagem do plano focal DIC especificada pelo número de plano focal irá aparecer com uma caixa azul. Posicione a caixa sobre a característica de interesse, por exemplo, uma célula. A caixa não precisa ser quadrado. Uma vez que a caixa foi posicionada sobre a região desejada, clique duas vezes dentro da caixa. </li><li> Outra figura aparecerá agora: esta figura contém uma imagem recortada e rodado da região de interesse selecionada na etapa anterior. O contraste da imagem deve ser talcaracterísticas que escuras aparecem na esquerda, enquanto características brilhantes aparecem na direita. Arraste a caixa azul sobre a região de interesse, reformular, se necessário. </li><li> Seção 3 gera uma máscara para o cubo z pilha. Existem dois tipos de máscaras disponíveis: uma máscara retangular para criar um retângulo ao redor da célula e uma ferramenta à mão livre para delinear a célula de interesse com a mão. </li><li> Para gerar uma máscara retangular, linha 167 e descomente comentário linha 170 (comentário de uma linha para fora, colocando um &quot;%&quot; no início da linha). Executar Seção 3 do programa. Clique na imagem e arraste o mouse para começar a definir a máscara retangular. Dê um clique duplo na caixa de aceitá-lo. </li><li> Para gerar uma máscara desenhada à mão, o comentário linha 167 e linha 170 descomente e executar Seção 3. Clique e tirar a máscara desejada com o mouse. Dê um duplo clique sobre a máscara para aceitá-la. </li><li> Seção Execute 4to construir o Hilbert transformado pilha de DIC e os correspondentes imagem Pilha da área de interesse DIC.A máscara construída na Seção 3 serão aplicadas ao Hilbert transformar pilha DIC ea pilha DIC regular quando &quot;maskon&quot; está definido para 1 na linha 179. Definição &quot;maskon&quot; para 0 irá construir pilhas de imagens sem aplicar a máscara. </li><li> Execute Seção 5 para otimizar a segmentação das imagens seccionais xz transversais da região de interesse. Figura 500, produzido pelo programa, é exibida com três tipos diferentes de contraste. O sucesso do algoritmo para encontrar os limites da célula é dependente de uma combinação de a máscara usado e o valor de &quot;limiar&quot;, na linha 229 de programa. Comece com um valor de 0,5. Ajuste o valor de limiar e execute novamente esta seção do programa até o delineamento adequado é alcançado em uma das colunas. </li><li> Se o delineamento foi o melhor na coluna 1, use a Seção 6 para determinar o volume usando uma imagem segmentação DIC. Se a coluna 2 deu os melhores resultados, execute Seção 7 para determinar o volume da célula a partir de imagens DIC Hilbert-transformada. Se a coluna 3 gave os melhores resultados, executar Section 8 para determinar o volume usando Fourier filtrada imagens DIC Hilbert-transformada. </li><li> O volume medido da amostra, relatado em mM cúbico (fl) é apresentado no título da Figura 600, 700, ou 800 produzido pelo programa, dependendo de qual a medição de volume é escolhido. </li></ol> 6. Medidas de Massa <ol><li> Abra o programa NIQPM MATLAB intitulado &quot;JoVE_NIQPM_v1.m&quot;. </li><li> Nos termos do artigo 0 do programa NIQPM, atualizar o local de três diretórios necessários para executar o programa. Estes são o &quot;dependencies_directory,&quot; o &quot;brightfield_directory,&quot; e o &quot;dic_directory.&quot; </li><li> Em seguida, execute Seção 1. Esta seção do código gera um campo brilhante imagem Cubo do campo cheio de todo o conjunto de imagens. Só correr SEÇÃO 1 VEZ. </li><li> Em seguida, execute Seção 2. A caixa de diálogo intitulada &quot;Definir parâmetros NIQPM&quot; irá aparecer. Quatro números são exigido do usuário: o número de plano focal onde a imagem de campo claro daamostra está em foco, resolução lateral (mm / pixel na imagem), a resolução axial (isto é 0,1 para a aquisição de imagem em 0,1 mM passos axiais), e a região de tamanho interesse, este parâmetro define o comprimento de um lado de um caixa que vai aparecer posteriormente - um valor típico é 200. Clique em OK. </li><li> Uma imagem do plano focal de campo claro especificada pelo número de plano focal irá aparecer com uma caixa azul. <ol><li> Se a imagem não está em foco, clique duas vezes na caixa azul e reprise Seção 2, certifique-se de ajustar o número de plano focal na caixa de diálogo. </li><li> Se a imagem está em foco, arraste a caixa azul ao redor da imagem e redimensioná-lo, selecionando os nós da caixa e arrastando-os quando necessário. Posicione a caixa em torno da característica de interesse, por exemplo, uma célula. A caixa não precisa ser quadrado. Clique duas vezes dentro da caixa para aceitá-la. </li></ol></li><li> Em seguida, executar o ponto 3 para a construção de uma pilha de imagens de campo brilhante foi colhido para a região de emjuro. </li><li> Para gerar a imagem DIC pseudo mapa de fase, e as comparações com a imagem DIC verdadeira imagem e campo claro, correr Seção 4. </li><li> Com o pseudo DIC e imagens verdadeiras DIC tão semelhantes quanto possível, o mapa de densidade de massa, a massa total, e um histograma da densidade celular pode ser determinada através da execução secção 5a ou 5b. Seção 5a realiza detecção boarder automatizada do campo - otimizar &quot;limite&quot; na linha 300 - valores típicos variam entre 0,1-1. Execute novamente nesta seção, conforme necessário para otimizar o valor do limite. Seção 5b realiza a determinação da massa, etc depois que o usuário define a célula de interesse. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm interesses financeiros no trabalho apresentado.

Em geral, NIQPM é uma técnica de difração limitada validado no caminho comprimentos ópticos que vão ,25-44,7. Validação foi realizada em n = 1,596 esferas de poliestireno que variam em diâmetro 0,11-9,8 mM suspenso em Fluoromount G (dados não mostrados). As células possuem comprimentos de caminho óptico que variam de cerca de 0-7. Ao medir a distribuição da densidade de uma amostra pode-se achar que a imagem do pseudo DIC parece bem, enquanto o mapa de densidade possui indesejados contribuiç...

O uso de microscopia óptica é agora onipresente na investigação de organismos celulares. Devido ao seu baixo de absorção e de espalhamento fraco propriedades endógenas mais visível do espectro óptico, as células não afetam fortemente a amplitude de ondas ópticas atravessando-los e, assim, aparecer semitransparente quando fotografada com microscópios de campo brilhante padrão. Amostras celulares, no entanto, diminuir ondas ópticas viajam através deles de uma forma que é linearmente relacionada com a quantidade de densidade de massa local em uma determinada região do espaço através do qual a luz viaja. A utilização desse intervalo de tempo heterogêneo ou perfil &quot;fase&quot; de ondas ópticas transmitidos através espécimes microscópicas foi descrita pela primeira vez em 1935 por Frits Zernike 1 e experimentalmente realizado por Zernikein 1942 2. Zernike foi agraciado com o prêmio Nobel em 1953 por essa conquista. Zeiss comercializado esta modalidade em 1945 3. Em 1955, Smith e NomarskGostaria de apresentar o seu trabalho inicial sobre o uso de 4 e 5 de teoria de interferência diferencial contraste (DIC) de microscopia, uma modalidade que utiliza o gradiente espacial de fase como um mecanismo de contraste. DIC foi comercializado por Zeiss em 1965in estreita colaboração com Nomarski 6. Em 1981, dois laboratórios demonstraram a primeira célula viva imagens DIC registada com a incorporação de câmaras de vídeo para o trem óptica do microscópio DIC 7, 8. A era das imagens de células vivas nasceu. Desde essa altura, a execução de ambos de contraste de fase e DIC em microscópios comerciais tem sido largamente inalterada. Estes métodos são utilizados principalmente por biólogos para produzir imagens de células para fins qualitativos: o monitoramento da morfologia, rastreamento de estruturas subcelulares e investigações de dinâmica da membrana 9. Estas técnicas são qualitativa na sua configuração de &quot;off-the-shelf&quot; tanto como fase e DIImagens c são funções arbitrárias da intensidade da fonte de luz, as configurações óptica iluminação, e ganho da câmera CCD, gama e configurações de exposição. Uma pequena legião de físicos e engenheiros ópticos tem se esforçado para fazer exames de imagem comerciais quantitativa. Entre os primeiros esforços foram duas cartas à natureza em 1952 e 1953, em que o médico que virou biofísico Robert Barer demonstrado o uso de microscopia de fase para determinar a massa seca celular das células estimando mudanças de fase através destes tipos de células utilizando um microscópio de fase disponível comercialmente 10, 11. O campo tem desenvolvido uma infinidade de técnicas ao longo dos anos seguintes com base em torno de três mecanismos básicos de contraste sem rótulo: microscopia de fase 10,11, microscopia DIC 12-17, 18-22 e brilhante campo para determinar óptico caminho de comprimento, fase em massa densidade, índice de refração, e volume celular. No Parállel, uma grande coleção de instrumentos ópticos personalizados também têm sido desenvolvidos desde os anos 1950, e fizeram de longo alcance medições ópticas que vão desde aplicações em crescimento do parasita 23, para documentar o ciclo celular 24 para investigar a dinâmica da membrana das células vermelhas do sangue 25. Em particular, nos últimos dez anos tem visto uma riqueza de microscopia quantitativa sem rótulo na forma de microscopia de fase difração de 26, microscopia tomográfica fase 27, microscopia holográfica digital 28, sensível microscopia de coerência óptica fase 29, microscopia de interferência de luz espacial 30, Hilbert fase microscopia 31, e microscopia de fase quantitativa 32. Apesar de seus sucessos coletivos, estes instrumentos não tenham sido divulgadas ao maior campo de pesquisadores biológicos, devido, principalmente, à sua instrumentação complexa e requisitos computacionais. Aqui nós describe o uso de um microscópio óptico padrão para realizar medidas quantitativas de massa, volume e densidade em amostras celulares através de uma combinação de campo claro e imagens DIC. Duas abordagens principais são apresentados: microscopia de fase quantitativa noninterferometric (NIQPM), para realizar medições de massa total de células e distribuição da densidade subcelular, e Hilbert transformar microscopia de contraste de interferência diferencial (HTDIC), para determinar o volume. As principais vantagens do NIQPM e HTDIC estava em sua acessibilidade tecnológica. As condições de imagem necessários para a sua realização bem sucedida estão dentro do âmbito do funcionamento normal da maioria dos microscópios disponíveis comercialmente. Além disso, os algoritmos de pós-processamento são estáveis, rápido e robusto - tendo sido implementado em MATLAB usando transformada de Fourier rápida algoritmos (FFT) com base, sempre que possível. NIQPM é um método para reconstruir fase e a densidade de massa integrada axialmente de celespécimes intracelular de imagens de campo claro. Soma desta densidade de massa integrada axialmente ao longo da área da amostra dá o teor de matéria seca total da amostra. O protocolo NIQPM baseia-se nas bases experimentais definidas por Paganin Nugent e 18, 19 - em que foi demonstrado que o perfil de fase de uma célula pode ser reconstruído a partir das imagens da amostra através do foco de campo brilhante - e o trabalho teórico de Frank , Altmeyer e Wernicke 20 - na resolução dos modelos de ondas paraxiais de forma eficiente com base em FFT. A ligação da fase com a densidade de massa seca é baseado no trabalho por Barer 10, 11 e Popescu 33. Informações volumétrica podem ser obtidas a partir de imagens por meio de DIC-focagem sob condições de iluminação elevados de NA que permitem o corte óptico da amostra ao longo do eixo óptico. Hilbert transformar processamento nas pilhas de imagens DIC aumenta muitoalgoritmos de detecção de borda para a localização das fronteiras de amostras em três dimensões, separando os valores de cinzento da intensidade espécime das do fundo. Isto origina trabalho com Arinson et al. Embora 34 foram introduzidos os dois métodos de filtragem de Fourier para aumentar o contraste e um método de detecção de borda à base de Sobel para análise volumétrica automatizada de amostra. Temos também validado HTDIC anteriormente em esferas de poliestireno que variam em tamanho desde o limite de difração de até 20 m de diâmetro 36. Embora ambos NIQPM e HTDIC são tecnologicamente acessíveis devido ao seu desenvolvimento em microscópios comerciais, os métodos são fundamentalmente limitada pela configuração das próprias microscópios de hardware. As limitações primárias de estas técnicas são duas vertentes: z-stack tempo de aquisição lenta em âmbitos comerciais, devido à tradução de todo o estágio da amostra ao invés de apenas a lente objetiva, Limita actualmente a investigação de fenómenos mais rápidos do que cerca de um quadro / minuto, e, por outro, os efeitos de difracção de restringir a utilidade de NIQPM e HTDIC para objectos que variam em tamanho desde 0,2 até 10 e 20 um de diâmetro, respectivamente. Assim, a amostra e sua dinâmica de tempo associados de interesse deve atender determinado tamanho e restrições temporais para permitir a utilização destes métodos em instrumentos típicos &quot;off-the-shelf&quot;. Empolgante, a maioria das amostras celulares fixos são prontamente investigadas com estes métodos. Uma visão geral do NIQPM e protocolos HTDIC são apresentados na Figura 1. Na Figura 2 ilustramos imagem ideal e de qualidade inferior por meio de foco em condições de baixa e alta iluminação NA tanto para campo claro e imagens DIC. Figuras 3 e 4 demonstram a dependência de parâmetros do algoritmo NIQPM destacando implementações bem sucedidas e mal sucedidas. <strong&gt; A Figura 5 ilustra os passos envolvidos no algoritmo de processamento de imagem HTDIC e demonstra a aplicação óptima do algoritmo para determinar o volume celular.

<table><tbody><tr><td>Microscópio Zeiss Axio Imager 2</td><td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Alemanha</td><td>Microscópio Axio Imager D2</td><td></td></tr><tr><td>Filtro verde (&lambda; = 540 &plusmn; 25 nm)</td><td>Chroma Technology Corp., Bellows Falls, Vermont</td><td>D540/25x</td><td>Filtro verde</td></tr><tr><td>Software SlideBook 5.5</td><td>Intelligent Imaging Innovations, Denver, Colorado</td><td></td><td>Software de aquisição de imagem</td></tr><tr><td>Poliestireno microesferas</td><td>Bangs Laboratory, Inc., Fishers, IN</td><td>PS06N</td><td>Esferas de poliestireno</td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech, Birmingham, Alabama</td><td>0100-01</td><td>Mídia de montagem</td></tr></tbody></table>

microscopia ótica quantitativa: measurement of cellular biofísica características com um microscópio óptico padrão

Quantitative Optical Microscopy: Measurement of Cellular Biophysical Features with a Standard Optical Microscope

Descreve-se o uso de um microscópio ótico padrão para realizar medidas quantitativas de massa, volume e densidade em amostras celulares através de uma combinação de campo brilhante e diferencial interferência imagens de contraste. Duas abordagens principais são apresentados: microscopia de fase quantitativa noninterferometric (NIQPM), para realizar medições de massa total de células e distribuição da densidade subcelular, e Hilbert transformar microscopia de contraste de interferência diferencial (HTDIC) para determinar volume. NIQPM baseia-se um modelo simplificado de propagação da onda, denominado aproximação paraxial, com três suposições: baixa abertura numérica (NA) de iluminação, a dispersão fraca, e fraca absorção de luz pela amostra. Felizmente, as amostras celulares não coradas satisfazer estes pressupostos e baixa iluminação NA é facilmente alcançada em microscópios comerciais. HTDIC é usado para obter informações volumétrica a partir de imagens através de foco DIC sob alta ilumin NAcondições ation. Iluminação elevada NA permite melhor corte da amostra ao longo do eixo óptico. Transformada de Hilbert da transformação na imagem DIC empilha aumenta muito algoritmos de detecção de borda para a localização das fronteiras de amostras em três dimensões, separando os valores de cinzento da intensidade espécime das do fundo. As principais vantagens do NIQPM e HTDIC estava em sua acessibilidade tecnológica utilizando microscópios &quot;off-the-shelf&quot;. Existem duas limitações básicas destes métodos: z-stack tempo de aquisição lenta em âmbitos comerciais ab-roga atualmente a investigação dos fenômenos mais rápido do que um frame / minuto, e em segundo lugar, os efeitos de difração de restringir a utilidade da NIQPM e HTDIC a objetos de 0,2 até 10 (NIQPM) e 20 (HTDIC) um de diâmetro, respectivamente. Assim, os espécimes e o seu tempo associado dinâmica de interesse deve satisfazer certos restrições de tamanho e temporais, para permitir o uso de tais métodos. Empolgante, a cellula mais fixor espécimes são prontamente investigadas com estes métodos.

Iluminação amostra correta durante a aquisição de imagem através de foco é fundamental para o sucesso da implementação do NIQPM um ​​nd algoritmos HTDIC. Na Figura 2 ilustramos baixa e alta iluminação NA sob tanto DIC e brilhante contraste campo para uma esfera de poliestireno ea linha de células de adenocarcinoma colorretal humano SW620. Figuras 2A, 2C, 2I e 2K demonstrar imagem ideal para NIQPM. Figuras 2F, 2H, 2N, e 2P demonstrar ima...

Descrevemos o uso de um microscópio óptico padrão para realizar medições quantitativas de massa, volume e densidade celular por meio de uma combinação de imagens de contraste de campo claro e interferência diferencial.

Microscopia ótica quantitativa: Measurement of Cellular Biofísica Características com um microscópio óptico padrão

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a ...

O objetivo geral deste procedimento é quantificar características físicas básicas de espécimes celulares, incluindo massa e volume, utilizando um microscópio óptico padrão e processamento de imagem. Isso é realizado primeiramente montando espécimes celulares cultivados em lamínulas de vidro sobre lâminas de microscopia. Em seguida, são obtidas imagens de campo claro e de contraste de interferência diferencial com foco variado.Em seguida, cada pilha Z de imagens é inserida em programas separados de processamento de imagens no MATLAB, que extraem os dados físicos. Em última análise, as propriedades físicas básicas das amostras celulares são obtidas por meio de medidas de intensidade ao longo do foco, utilizando contraste de campo claro e microscopia de contraste de interferência diferencial. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a microscopia de fluorescência, é que as amostras celulares não precisam ser fixadas, permeabilizadas ou coradas.Este método pode ajudar a responder perguntas-chave no campo da biologia celular, como como a densidade subcelular é organizada durante o ciclo celular ou entre diferentes populações celulares que contribuem para um estado de doença. Usando um microscópio com capacidades de contraste de interferência diferencial (DIC) e campo claro, além de especificações adicionais conforme descrito no protocolo, comece abrindo o software de slide book e criando um novo slide para a coleta de imagens. Em seguida, abra a janela de foco e, na seção de conjunto de filtros, selecione DIC. Na guia do microscópio, na seção do condensador, ajuste a barra deslizante da abertura para a posição mais à direita. Isso fornece iluminação com alta abertura numérica e melhora o seccionamento óptico do espécime.Após capturar uma pilha DIC da amostra, abra a janela de foco e selecione abrir. Na seção conjunto de filtros, ajuste a barra deslizante de abertura até a posição mais à esquerda, fechada completamente, para fornecer iluminação com baixa abertura numérica (NA). Após o ajuste da intensidade do sinal, abra a janela de captura de imagem.As configurações de captura 3D da aquisição do empilhamento DICZ serão exibidas na seção de conjunto de filtros da janela de captura de imagem. Marque a caixa de seleção e especifique o tempo de exposição. Na seção de informações da imagem, nomeie a imagem e selecione iniciar para começar a aquisição da imagem Zack.Em seguida, exporte as pilhas Z de acordo com o protocolo descrito para realizar as medições de volume posteriormente no programa MATLAB H-T-D-I-C intitulado JoVE HT DCO V one M. Na seção zero, atualize a variável do diretório de dependências copiando e colando o diretório que contém os arquivos hilbert. Transform DM e sobel edge Detect M do explorador. Entre as aspas simples após a expressão dependencies directory equals, execute a seção zero do programa joco HT DCO V one M.Na seção um, atualize o diretório de imagens copiando e colando o diretório que contém as imagens com foco através do formato dot TIF. Entre aspas simples, execute esta seção apenas uma vez para alinhar e rotacionar as imagens. Para a transformada de Hilbert, execute a seção dois do código. Uma caixa de diálogo intitulada Definir parâmetros HT DIC aparecerá.Em seguida, insira o número do plano focal em que a imagem DIC da amostra está em foco, a resolução lateral, a resolução axial, o ângulo de rotação da imagem DIC necessário para realizar a transformada de Hilbert e, por último, o tamanho da região de interesse. Depois, clique em OK. Uma imagem do plano focal DIC especificado pelo número do plano focal aparecerá com uma caixa azul.Posicione a caixa sobre a estrutura de interesse, como uma célula. Uma vez que a caixa tenha sido posicionada sobre a região desejada, clique duas vezes dentro da B. O contraste da imagem deve ser tal que estruturas escuras apareçam à esquerda, enquanto estruturas claras apareçam à direita. Arraste a caixa azul sobre a região de interesse e redimensione conforme necessário.Em seguida, na seção três, para gerar uma máscara retangular, descomente a linha 1 6 7 e comente a linha 1 7 0. Execute a seção três do programa clicando na imagem e arrastando o mouse para começar a definir a máscara retangular. Em seguida, clique duas vezes na caixa para aceitá-la. Para gerar uma máscara desenhada à mão, comente a linha 1 6 7 e descomente a linha 1 7 0 antes de executar a seção três. Clicando e desenhando a máscara desejada com o mouse, clique duas vezes sobre a máscara para aceitá-la. Após executar a Seção quatro, execute a seção cinco para construir pilhas de imagens transformadas de Hilbert conforme o protocolo descrito no texto.Para otimizar a segmentação de imagem das imagens de corte transversal xz da região de interesse. A Figura 500 gerada pelo programa aparece exibindo três tipos diferentes de contraste. O sucesso do algoritmo em encontrar as bordas da célula depende de uma combinação da máscara utilizada e do valor do limiar na linha 2, 2, 9 do programa; comece com um valor de 0,5 e ajuste o valor do limiar e execute novamente esta seção do programa até que o contorno adequado seja obtido em uma das colunas.Se o contorno foi melhor na coluna um, na segmentação DIC, use a seção seis para determinar o volume. Se a coluna dois apresentou os melhores resultados, execute a seção sete para determinar o volume celular a partir da transformada de Hilbert em imagens DIC. Se a coluna três apresentou os melhores resultados, use a imagem DIC de transformada de Hilbert pré-filtrada ao executar a seção oito para determinar o volume para medições de massa no programa NIQ PM MATLAB intitulado JO VCO NI qpm V1 M na seção zero. Atualize a localização dos três diretórios: dependências, BRIGHTFIELD e diretório DIC. Após executar a seção um, execute a seção dois na caixa de diálogo intitulada definir parâmetros N-I-Q-P-M e insira o número do plano focal onde a imagem em campo claro da amostra está em foco, a resolução lateral, a resolução axial e o tamanho da região de interesse.Em seguida, clique em OK. Uma imagem do plano focal de campo claro especificado pelo número do plano focal aparecerá com uma caixa azul. Após ajustar o foco, se necessário, repetindo a seção dois, arraste a caixa pela imagem, selecione os nós da caixa e arraste para redimensioná-la antes de clicar duas vezes dentro da caixa para aceitá-la.Uma vez que uma pilha de imagens de campo claro tenha sido construída executando a seção três, execute a seção quatro para gerar o mapa de fase, imagens pseudo DIC e comparações com as imagens de campo claro e a imagem DIC real. Quando as imagens pseudo DIC e DIC real forem tão semelhantes quanto possível, execute a seção cinco A ou cinco B, que permite ao usuário delinear a célula para gerar o mapa de densidade de massa, a massa total e o histograma da densidade celular corrigido. A iluminação da amostra durante a aquisição de imagens por foco é crítica para a implementação bem-sucedida dos algoritmos N-I-Q-P-M e H-T-D-I-C. Esta figura ilustra a iluminação com baixa e alta NA sob contraste DIC e campo claro para uma esfera de poliestireno e a linhagem celular de adenocarcinoma colorretal humano SW seis 20.Estes painéis demonstram a imagem ideal para N-I-Q-P-M e estes exibem a imagem ideal para DIC de HT. Estas imagens demonstram a dependência dos parâmetros do algoritmo NIQ PM, destacando implementações bem-sucedidas e mal-sucedidas. Aqui exploramos o perfil de fase de uma esfera de poliestireno com diâmetro de 4,8 micrômetros.O perfil esperado é conhecido teoricamente e pode, portanto, ser comparado diretamente à reconstrução PM NIQ. Estes painéis apresentam a melhor reconstrução obtível para os efeitos de difração da esfera; entretanto, nas bordas da esfera e no interior, esses efeitos impedem uma reconstrução estável em todos os pontos da esfera. A região central da esfera pode ser capturada com N-I-Q-P-M com um erro percentual de um a 5%, conforme visto no painel L, em espécimes celulares cujas propriedades de fase não são conhecidas.Um a priori pode ser reconstruído usando o PMM NIQ em conjunto com um procedimento para comparar uma imagem pseudo DIC a uma imagem DIC real. O N-I-Q-P-M possui um parâmetro livre: o plano na pilha de imagens do campo direito no qual o cálculo é centrado.Este plano focal central deve ser ajustado até que as imagens de DIC pseudo e de DIC verdadeiro pareçam o mais semelhantes possível. São apresentadas aqui uma imagem de DIC pseudo desfocada, uma imagem de DIC pseudo ideal e a imagem de DIC correspondente da célula obtida com uma abertura numérica de iluminação de 0,9. Curiosamente, o melhor mapa de fase e a imagem de DIC pseudo correspondente nem sempre correspondem a uma imagem de campo claro em foco, como mostrado nestes painéis.Por fim, são apresentados aqui os passos envolvidos no algoritmo de processamento de imagem H-T-D-I-C a partir de imagens DIC em foco sob iluminação com NA igual a 0,9; a transformada de Hilbert é realizada para remover o relevo de base das imagens DIC. Isso acarreta um certo borramento ao longo do eixo óptico, que pode ser eliminado por meio de filtragem passa-alta. Essas imagens finais são facilmente segmentadas para determinar a área em cada plano transversal do espécime, permitindo inferir o volume celular total.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar a iluminação correta para imagem de campo claro ou contraste diferencial após a execução deste procedimento. Outros métodos, como microscopia de fluorescência, podem ser realizados para responder perguntas adicionais utilizando a colocalização da força do piso com mapas de densidade do espécime.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

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