Microscopia ótica quantitativa: Measurement of Cellular Biofísica Características com um microscópio óptico padrão

O objetivo geral deste procedimento é quantificar características físicas básicas de espécimes celulares, incluindo massa e volume, utilizando um microscópio óptico padrão e processamento de imagem. Isso é realizado primeiramente montando espécimes celulares cultivados em lamínulas de vidro sobre lâminas de microscopia. Em seguida, são obtidas imagens de campo claro e de contraste de interferência diferencial com foco variado.

Em seguida, cada pilha Z de imagens é inserida em programas separados de processamento de imagens no MATLAB, que extraem os dados físicos. Em última análise, as propriedades físicas básicas das amostras celulares são obtidas por meio de medidas de intensidade ao longo do foco, utilizando contraste de campo claro e microscopia de contraste de interferência diferencial. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a microscopia de fluorescência, é que as amostras celulares não precisam ser fixadas, permeabilizadas ou coradas.

Este método pode ajudar a responder perguntas-chave no campo da biologia celular, como como a densidade subcelular é organizada durante o ciclo celular ou entre diferentes populações celulares que contribuem para um estado de doença. Usando um microscópio com capacidades de contraste de interferência diferencial (DIC) e campo claro, além de especificações adicionais conforme descrito no protocolo, comece abrindo o software de slide book e criando um novo slide para a coleta de imagens. Em seguida, abra a janela de foco e, na seção de conjunto de filtros, selecione DIC. Na guia do microscópio, na seção do condensador, ajuste a barra deslizante da abertura para a posição mais à direita. Isso fornece iluminação com alta abertura numérica e melhora o seccionamento óptico do espécime.

Após capturar uma pilha DIC da amostra, abra a janela de foco e selecione abrir. Na seção conjunto de filtros, ajuste a barra deslizante de abertura até a posição mais à esquerda, fechada completamente, para fornecer iluminação com baixa abertura numérica (NA). Após o ajuste da intensidade do sinal, abra a janela de captura de imagem.

As configurações de captura 3D da aquisição do empilhamento DICZ serão exibidas na seção de conjunto de filtros da janela de captura de imagem. Marque a caixa de seleção e especifique o tempo de exposição. Na seção de informações da imagem, nomeie a imagem e selecione iniciar para começar a aquisição da imagem Zack.

Em seguida, exporte as pilhas Z de acordo com o protocolo descrito para realizar as medições de volume posteriormente no programa MATLAB H-T-D-I-C intitulado JoVE HT DCO V one M. Na seção zero, atualize a variável do diretório de dependências copiando e colando o diretório que contém os arquivos hilbert. Transform DM e sobel edge Detect M do explorador. Entre as aspas simples após a expressão dependencies directory equals, execute a seção zero do programa joco HT DCO V one M.

Na seção um, atualize o diretório de imagens copiando e colando o diretório que contém as imagens com foco através do formato dot TIF. Entre aspas simples, execute esta seção apenas uma vez para alinhar e rotacionar as imagens. Para a transformada de Hilbert, execute a seção dois do código. Uma caixa de diálogo intitulada Definir parâmetros HT DIC aparecerá.

Em seguida, insira o número do plano focal em que a imagem DIC da amostra está em foco, a resolução lateral, a resolução axial, o ângulo de rotação da imagem DIC necessário para realizar a transformada de Hilbert e, por último, o tamanho da região de interesse. Depois, clique em OK. Uma imagem do plano focal DIC especificado pelo número do plano focal aparecerá com uma caixa azul.

Posicione a caixa sobre a estrutura de interesse, como uma célula. Uma vez que a caixa tenha sido posicionada sobre a região desejada, clique duas vezes dentro da B. O contraste da imagem deve ser tal que estruturas escuras apareçam à esquerda, enquanto estruturas claras apareçam à direita. Arraste a caixa azul sobre a região de interesse e redimensione conforme necessário.

Em seguida, na seção três, para gerar uma máscara retangular, descomente a linha 1 6 7 e comente a linha 1 7 0. Execute a seção três do programa clicando na imagem e arrastando o mouse para começar a definir a máscara retangular. Em seguida, clique duas vezes na caixa para aceitá-la. Para gerar uma máscara desenhada à mão, comente a linha 1 6 7 e descomente a linha 1 7 0 antes de executar a seção três. Clicando e desenhando a máscara desejada com o mouse, clique duas vezes sobre a máscara para aceitá-la. Após executar a Seção quatro, execute a seção cinco para construir pilhas de imagens transformadas de Hilbert conforme o protocolo descrito no texto.

Para otimizar a segmentação de imagem das imagens de corte transversal xz da região de interesse. A Figura 500 gerada pelo programa aparece exibindo três tipos diferentes de contraste. O sucesso do algoritmo em encontrar as bordas da célula depende de uma combinação da máscara utilizada e do valor do limiar na linha 2, 2, 9 do programa; comece com um valor de 0,5 e ajuste o valor do limiar e execute novamente esta seção do programa até que o contorno adequado seja obtido em uma das colunas.

Se o contorno foi melhor na coluna um, na segmentação DIC, use a seção seis para determinar o volume. Se a coluna dois apresentou os melhores resultados, execute a seção sete para determinar o volume celular a partir da transformada de Hilbert em imagens DIC. Se a coluna três apresentou os melhores resultados, use a imagem DIC de transformada de Hilbert pré-filtrada ao executar a seção oito para determinar o volume para medições de massa no programa NIQ PM MATLAB intitulado JO VCO NI qpm V1 M na seção zero. Atualize a localização dos três diretórios: dependências, BRIGHTFIELD e diretório DIC. Após executar a seção um, execute a seção dois na caixa de diálogo intitulada definir parâmetros N-I-Q-P-M e insira o número do plano focal onde a imagem em campo claro da amostra está em foco, a resolução lateral, a resolução axial e o tamanho da região de interesse.

Em seguida, clique em OK. Uma imagem do plano focal de campo claro especificado pelo número do plano focal aparecerá com uma caixa azul. Após ajustar o foco, se necessário, repetindo a seção dois, arraste a caixa pela imagem, selecione os nós da caixa e arraste para redimensioná-la antes de clicar duas vezes dentro da caixa para aceitá-la.

Uma vez que uma pilha de imagens de campo claro tenha sido construída executando a seção três, execute a seção quatro para gerar o mapa de fase, imagens pseudo DIC e comparações com as imagens de campo claro e a imagem DIC real. Quando as imagens pseudo DIC e DIC real forem tão semelhantes quanto possível, execute a seção cinco A ou cinco B, que permite ao usuário delinear a célula para gerar o mapa de densidade de massa, a massa total e o histograma da densidade celular corrigido. A iluminação da amostra durante a aquisição de imagens por foco é crítica para a implementação bem-sucedida dos algoritmos N-I-Q-P-M e H-T-D-I-C. Esta figura ilustra a iluminação com baixa e alta NA sob contraste DIC e campo claro para uma esfera de poliestireno e a linhagem celular de adenocarcinoma colorretal humano SW seis 20.

Estes painéis demonstram a imagem ideal para N-I-Q-P-M e estes exibem a imagem ideal para DIC de HT. Estas imagens demonstram a dependência dos parâmetros do algoritmo NIQ PM, destacando implementações bem-sucedidas e mal-sucedidas. Aqui exploramos o perfil de fase de uma esfera de poliestireno com diâmetro de 4,8 micrômetros.

O perfil esperado é conhecido teoricamente e pode, portanto, ser comparado diretamente à reconstrução PM NIQ. Estes painéis apresentam a melhor reconstrução obtível para os efeitos de difração da esfera; entretanto, nas bordas da esfera e no interior, esses efeitos impedem uma reconstrução estável em todos os pontos da esfera. A região central da esfera pode ser capturada com N-I-Q-P-M com um erro percentual de um a 5%, conforme visto no painel L, em espécimes celulares cujas propriedades de fase não são conhecidas.

Um a priori pode ser reconstruído usando o PMM NIQ em conjunto com um procedimento para comparar uma imagem pseudo DIC a uma imagem DIC real. O N-I-Q-P-M possui um parâmetro livre: o plano na pilha de imagens do campo direito no qual o cálculo é centrado.

Este plano focal central deve ser ajustado até que as imagens de DIC pseudo e de DIC verdadeiro pareçam o mais semelhantes possível. São apresentadas aqui uma imagem de DIC pseudo desfocada, uma imagem de DIC pseudo ideal e a imagem de DIC correspondente da célula obtida com uma abertura numérica de iluminação de 0,9. Curiosamente, o melhor mapa de fase e a imagem de DIC pseudo correspondente nem sempre correspondem a uma imagem de campo claro em foco, como mostrado nestes painéis.

Por fim, são apresentados aqui os passos envolvidos no algoritmo de processamento de imagem H-T-D-I-C a partir de imagens DIC em foco sob iluminação com NA igual a 0,9; a transformada de Hilbert é realizada para remover o relevo de base das imagens DIC. Isso acarreta um certo borramento ao longo do eixo óptico, que pode ser eliminado por meio de filtragem passa-alta. Essas imagens finais são facilmente segmentadas para determinar a área em cada plano transversal do espécime, permitindo inferir o volume celular total.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar a iluminação correta para imagem de campo claro ou contraste diferencial após a execução deste procedimento. Outros métodos, como microscopia de fluorescência, podem ser realizados para responder perguntas adicionais utilizando a colocalização da força do piso com mapas de densidade do espécime.