Visualização de Cortex organização e dinâmica em microorganismos, utilizando microscopia de fluorescência Total Internal Reflection

O objetivo geral deste procedimento é obter imagens de alta qualidade, por fluorescência, reflexão total interna ou turf, de microrganismos com parede celular. Isso é realizado primeiramente preparando lamínulas e células. O segundo passo é alinhar com precisão a configuração do microscópio para obter qualidade ótima de imagem.

Em seguida, são escolhidos os incidentes corretos, ângulos e condições de imagem para a aquisição de imagens ou vídeos. O passo final é o processamento pós-aquisição das imagens obtidas. Em última análise, a microscopia turf é utilizada para estudar a dinâmica da localização proteica no córtex celular.

A principal vantagem desta técnica em comparação com metais excessivos, como microscopia convencional ou confocal, é que o contraste da imagem em microscopia é muito alto, permitindo tempos rápidos e baixa intensidade luminosa. Assim, este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de pesquisa de membranas, como os mecanismos de segregação lateral de proteínas ou a mobilidade de proteínas de membrana. Lâminas de cobertura para microscopia turf devem ser limpas de partículas de poeira antes do uso.

Como o fundo é sensível a sinais de fundo provenientes de poeira em uma lamínula suja, é necessário utilizar uma lamínula limpa com menos ruído de fundo para iniciar o procedimento de limpeza das lamínulas. Use pinças para colocar as lamínulas em um suporte cerâmico com tampa.

Em seguida, preencha um recipiente de vidro com hidróxido de sódio um molar. Esse hidróxido de sódio pode ser reutilizado várias vezes. Coloque o suporte de cerâmica contendo as lamínulas no hidróxido de sódio e incube as lamínulas por duas horas sob rotação lenta contínua.

Não incubar por mais de oito horas, pois isso tornará as lamínulas opacas após duas horas; lave as lamínulas com água destilada duas vezes, por cinco minutos cada vez, sob rotação lenta e contínua; armazene as lamínulas limpas no suporte de cerâmica coberto com etanol a 100%. Para preparar células de bacillus subtilis para microscopia de turfa, dilua até uma DO600 de 0,01 a 0,05 em cinco mililitros de meio de crescimento apropriado e cultive até a fase exponencial. Prepare 1,25% de aros em meio sintético dissolvendo o pó de aros em um tubo plástico de 1,5 mililitro a 95 graus Celsius e, em seguida, armazene em um bloco de aquecimento a 72 graus Celsius.

Adicione uma pequena gota de aros ao centro de uma lâmina e, com uma segunda lâmina, pressione os aros formando um coxim plano após pelo menos dois minutos; separe cuidadosamente as lâminas. Centrifugue 500 microlitros de células de bacillus subtlest em uma microcentrífuga a 12.000 RPM durante um minuto. Descarte o sobrenadante e re-suspenda o pellet em 50 microlitros de meio.

Adicione duas a quatro microlitros de células ao centro do suporte aros. Em seguida, use pinças para remover um lamínula limpo do recipiente contendo etanol e seque-o com ar pressurizado. Coloque cuidadosamente o lamínula sobre a amostra.

Deixe as células sedimentarem por pelo menos dois minutos antes da microscopia. Para imagens de longo prazo, selar as bordas do coverslip com a mistura aquecida de vaselina, lanolina e parafina ou Val app. Para preparar as células de Saccharomyces visi para microscopia turf, dilua uma pré-cultura e cultive em meio apropriado por pelo menos cinco horas.

Na fase exponencial, retire uma lamínula do recipiente contendo etanol e seque-a com ar comprimido utilizando uma pipeta Pasteur. Adicione cinco microlitros de conval ou de uma solução de con A sobre a lamínula e seque com ar comprimido. A con A liga-se aos carboidratos da parede celular da levedura e imobiliza as células de levedura.

Em seguida, transfira 4,5 microlitros de uma suspensão de células de levedura para um lado do con, uma lamínula revestida. Coloque cuidadosamente a lamínula com a face do espécime voltada para baixo sobre uma lâmina de microscópio, começando por uma borda e deixando que as gotas escorram lentamente. Isso evitará a formação de bolhas de ar.

Deixe as células sedimentarem por pelo menos dois minutos antes da microscopia; selar as bordas do lamínula com vala para imagens de longo prazo. Todos os experimentos mostrados neste vídeo são realizados em uma configuração personalizada de TRAF com base em uma platina IMEX totalmente automatizada, com um objetivo Olympus 100 x 1,45 NA. As fontes de luz utilizadas são diodos de 75 miliwatts, laser de estado sólido bombeado ou DPSS nos comprimentos de onda de 488 nanômetros e 561 nanômetros.

Ângulos Turf e fluorescência. A recuperação após fotobranqueamento ou a posição FRAP pode ser ajustada instantaneamente por meio de dois galvanômetros. Um terceiro galvanômetro é usado para alternar entre epi, fluorescência, FRAP e TURF.

Os galvanômetros, que são controlados diretamente pelo software de aquisição em tempo real, permitem a medição simples da cinética de localização de objetos rastreados em imagens de grama, coletadas com uma câmera EM CCD e uma lente de ampliação dois x na frente da câmera. A aquisição também é controlada pelo software de aquisição em tempo real. Antes de trabalhar com o laser, coloque óculos de proteção para laser, projete o laser no teto no modo grama e calibre a posição de zero grau de modo que o laser esteja em linha reta.

Com o objetivo, foque o ponto do laser ao tamanho mínimo após o ajuste ideal, o perfil do laser deve formar um ponto bem definido com uma forma aproximadamente redonda. Realize a calibração antes de cada sessão. Para obter qualidade ótima de imagem, o alinhamento do microscópio turf é essencial para o sucesso deste procedimento.

A incidência correta, os ângulos e os parâmetros para a aquisição de imagens devem ser cuidadosamente ajustados para obter qualidade ótima de imagem. Para iniciar a aquisição de imagens, identifique a posição das células utilizando iluminação em campo claro. LEDs vermelhos são particularmente adequados, pois não induzem danos fototóxicos significativos.

Alterne para iluminação a laser e selecione os lasers e combinações de filtros apropriados para excitar os fluoróforos de escolha, certificando-se de que o ângulo do feixe seja subcrítico. Caso contrário, os sinais provenientes de proteínas de fusão GFP não serão detectados. Localize a seção superior da célula, que é o lado da célula voltado para a lamínula.

Aumente gradualmente o ângulo de incidência do feixe de laser até que os sinais desapareçam e, em seguida, diminua lentamente o ângulo até o ponto em que a fluorescência na superfície celular reaparece. Ajuste novamente o foco Z para obter a posição ideal na superfície. Ângulos de incidência aceitáveis não criam um halo desfocado na borda da célula, conforme ilustrado neste exemplo da proteína de levedura.

PMA com GFP imagens obtidas com ângulos de incidência decrescentes, de cima à esquerda para baixo à direita. As imagens mostram uma perda súbita do sinal no ângulo crítico e uma diminuição progressiva da informação estrutural e da relação sinal-ruído; ajuste as intensidades do laser e o ganho da câmera para maximizar a faixa dinâmica. Tipicamente, câmeras E-M-C-C-D são ideais para detectar sinais muito baixos com altas relações sinal-ruído.

A microscopia de campo escuro é muito sensível a pequenas variações de altura. Diferenças na lamínula resultam em apenas algumas células podendo ser visualizadas ao mesmo tempo. Esta imagem de uma suspensão densa de microesferas fluorescentes é um exemplo de um campo de visão irregular, no qual apenas uma parte do campo de visão está em foco.

Portanto, para células pequenas, a região de aquisição pode frequentemente ser reduzida a uma sub-região contendo o objeto de escolha. Em experimentos turf de dupla cor, a sobreposição de fluoróforos deve ser minimizada para pares R-F-P-G-F-P. Utilize filtros de emissão separados, pois o RFP é fracamente excitado pela luz de 488 nanômetros.

Um fluxo de trabalho típico para evitar vazamento de sinal e imagens com dupla coloração é mostrado aqui. Após a aquisição das imagens das células com conjuntos separados de filtros, as imagens são separadas e alinhadas utilizando microesferas fluorescentes antes de serem fundidas. Para análise, um parâmetro crítico que influencia a qualidade da imagem é o alinhamento do laser e a objetiva limpa. Após alinhar o laser e focar na posição Z utilizada para a aquisição da imagem, remova a amostra e limpe toda a imersão de óleo da objetiva.

O óleo residual causará difração da luz a laser e manchas no perfil do feixe. A microscopia turf pode ser utilizada para visualizar a distribuição de homólogos da actina e enzimas da parede celular em células bacterianas. Neste resultado representativo, células de bacillus subtiles expressando fusões GFP do homólogo de actina MBL ou da transpeptidase PBPH foram analisadas por microscopia turf e por fluorescência epifluorescente convencional.

As imagens aqui representam projeções médias de uma série temporal para indicar a área coberta pelos remendos móveis de MBL. Monitorização com diferentes modos de imagem. O contorno azul na imagem sobreposta indica o limite celular visualizado a partir de uma imagem de campo claro.

A transpeptidase PBPH expressa semanalmente localiza-se em manchas corticais que são dificilmente visíveis por fluorescência epiluminescente, mas podem ser claramente distinguidas por turf. A penetração reduzida pode ser melhor observada no sinal P-B-P-H-G-F-P na SEPTA indicada pelas setas, que aparece como linhas na fluorescência epiluminescente, mas como pontos em turf. Este próximo conjunto de imagens mostra uma comparação entre a fluorescência epiluminescente e a iluminação turf do componente do complexo TOR, bit 61 em Saccharomyces visi.

Esta proteína é expressa fracamente e forma pequenos remendos corticais com apenas algumas cópias da proteína por remendo. Na fluorescência epi, apenas alguns remendos são visíveis acima do fundo intenso, enquanto que os remendos podem ser visualizados com uma relação sinal-ruído muito boa em turf. Melhoria adicional do contraste da imagem pode ser obtida por meio de várias etapas de processamento de imagem, como subtração de imagens suavizadas por Gaussiana ou mediana, enquanto a subtração do fundo local remove o ruído e realça estruturas de alta intensidade.

Isso geralmente ocorre à custa da perda de estruturas finas e da amplificação exagerada de regiões de alta intensidade. Como indicado pela seta, um procedimento superior é a desconvolução 2D, que pode ser realizada com pacotes de software gratuitos ou comerciais. O aumento do contraste após a desconvolução é ilustrado por este filme em lapso de tempo de GFP RAs dois, que mostra alternadamente imagens brutas e imagens de estacas desconvoluídas.

Como a GFP RAs dois é uma proteína de movimentação rápida, tempos de aquisição rápidos são importantes para resolver seu comportamento dinâmico. O processamento de imagens é especialmente importante para análises de colocalização, conforme ilustrado neste filme duplo em cores com lapso de tempo de proteínas de levedura, FET 3G FP e PMA um RFP.

Os primeiros 10 quadros representam imagens brutas e os quadros restantes são imagens desdobradas. Para tornar a análise possível, é fundamental maximizar o contraste e realçar as imagens brutas desfocadas. Turf e frap oferecem uma combinação poderosa para estudar a dinâmica de proteínas corticais. O uso dessa técnica em células B mais sutis expressando G-F-P-M-B-L descartou o treadmilling como o mecanismo responsável pela motilidade observada em manchas contendo MBL.

O gráfico de chm do remendo móvel e o perfil de intensidade ao longo do gráfico de chm indicado pela linha tracejada são mostrados de maneira semelhante ao turf FRAP da membrana plasmática de levedura. Um TPAs PMA um revelou os rearranjos lentos das proteínas da membrana plasmática de levedura, que se distribuem em domínios semelhantes a redes cobrindo toda a superfície celular após seu desenvolvimento. Esta técnica abriu caminho para pesquisas na área da biologia celular de bactérias para explorar o mecanismo de síntese da parede celular em BA subtilis.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como adquirir imagens de microorganismos em campo como leveduras e bactérias, e de como esta técnica pode auxiliar no estudo das propriedades dinâmicas de proteínas corticais.