Visualização de Cortex organização e dinâmica em microorganismos, utilizando microscopia de fluorescência Total Internal Reflection

O objetivo geral deste procedimento é adquirir imagens de alta qualidade, reflexão interna total, fluorescência ou relva de microrganismos portadores de parede celular. Isso é feito preparando primeiro as lamínulas e as células. O segundo passo é alinhar com precisão a configuração do microscópio para obter a melhor qualidade de imagem.

Em seguida, os incidentes, ângulos e condições de imagem corretos são escolhidos para aquisição de imagens ou filmes. A etapa final é o processamento pós-imagem das imagens adquiridas. Em última análise, a microscopia de grama é usada para estudar a dinâmica da localização de proteínas no córtex celular.

A principal vantagem desta técnica sobre metais excedentes como convencional ou confocal para microscopia, é que o contraste da imagem na microscopia é muito alto, permitindo tempos rápidos e pouca luz. Como tal, Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da pesquisa de membranas, como os mecanismos de segregação lateral de proteínas ou a mobilidade das proteínas de membrana. As lamínulas para microscopia de grama devem ser limpas de partículas de poeira antes do uso.

Uma vez que a grama é sensível a sinais de fundo decorrentes de poeira em uma lamínula suja. Uma lamínula limpa com menos fundo é necessária para iniciar o procedimento de limpeza das lamínulas. Use uma pinça para colocar as lamínulas em um suporte de cerâmica com tampa.

Em seguida, encha um recipiente de vidro com um hidróxido de sódio molar. Este hidróxido de sódio pode ser reutilizado várias vezes. Coloque o suporte cerâmico contendo as lamínulas no hidróxido de sódio e incube as lamínulas por duas horas sob rotação lenta e contínua.

Não incube por mais de oito horas, pois isso criará lamínulas opacas após duas horas, lave as lamínulas com água destilada duas vezes por cinco minutos de cada vez sob rotação contínua lenta, armazene as lamínulas limpas no suporte de cerâmica coberto com 100% de etanol. Para preparar as células mais sutis do bacilo para microscopia de grama, diluir para um OD 600 de 0,01 a 0,05 em cinco mililitros de meios de crescimento apropriados e crescer até a fase exponencial. Prepare 1,25% de aros em meio sintético, dissolva o pó de aros em um tubo de plástico de 1,5 mililitro a 95 graus Celsius e armazene em um bloco de aquecimento a 72 graus Celsius.

Adicione uma pequena gota de aros ao meio de um slide e com um segundo slide, pressione o aros em uma almofada plana após pelo menos dois minutos, separe cuidadosamente os slides. Gire 500 microlitros de células mais sutis do bacilo em uma microcentrífuga a 12.000 RPM por um minuto. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em meio de 50 microlitros.

Adicione dois a quatro microlitros de células ao centro da almofada aros. Em seguida, use uma pinça para remover uma lamínula limpa do recipiente cheio de etanol e seque-o com ar pressurizado. Coloque cuidadosamente a lamínula sobre a amostra.

Deixe as células assentarem por pelo menos dois minutos antes da microscopia. Para imagens de longo prazo, sele as bordas da lamínula com a mistura aquecida de vaselina, lanolina e parafina ou Val app. Para preparar células de Saccharomyces visi para microscopia de grama, diluir uma pré-cultura e crescer em meios apropriados por pelo menos cinco horas.

Para a fase exponencial, pegue uma lamínula do recipiente cheio de etanol e seque-a com ar pressurizado com uma pipeta espalhada. Cinco microlitros, conval e um ou com uma solução na tampa. Deslize e seque com ar pressurizado con A liga-se aos carboidratos da parede celular da levedura e imobiliza as células da levedura.

Em seguida, transfira 4,5 microlitros de uma suspensão de células de levedura para um lado do engodo, uma lamínula revestida. Coloque cuidadosamente a lamínula com a amostra voltada para baixo em uma lâmina de microscópio, começando com uma borda e deixando cair lentamente. Isso evitará a formação de bolhas de ar.

Deixe as células assentarem por pelo menos dois minutos antes da microscopia, sele as bordas da lamínula com o aplicativo val para imagens de longo prazo. Todos os experimentos mostrados neste vídeo são realizados em uma configuração de grama personalizada com base em um suporte IMEX totalmente automatizado com uma objetiva Olympus 100 x 1,45 NA. As fontes de luz utilizadas são diodo de 75 miliwatts, lasers de estado sólido bombeado ou DPSS a 488 nanômetros e 561 nanômetros.

Ângulos de relva e fluorescência. A recuperação após o fotobranqueamento ou a posição da fraternidade pode ser ajustada instantaneamente através de dois galvanômetros. Um terceiro galvanômetro é usado para alternar entre epi, fluorescência, frap e grama.

Os galvanômetros, que são controlados diretamente pelo software de aquisição ao vivo, permitem a medição simples da cinética de localização para objetos traçados em imagens de relva são coletados com uma câmera EM CCD e uma lente de ampliação de dois x na frente da câmera. A aquisição também é controlada pelo software de aquisição ao vivo. Antes de trabalhar com o laser, coloque óculos de segurança para laser, projete o laser no teto no modo gramado e calibre a posição de zero grau de forma que o laser fique em linha reta.

Com a objetiva, focalize o ponto do laser em um tamanho mínimo após o ajuste ideal, o perfil do laser deve formar um ponto bem definido com uma forma aproximadamente redonda. Execute a calibração antes de cada sessão. Para obter a melhor qualidade de imagem, o alinhamento do microscópio de relva é fundamental para o sucesso deste procedimento.

A incidência, os ângulos e os parâmetros corretos para aquisição de imagem devem ser cuidadosamente ajustados para obter a qualidade ideal da imagem. Para iniciar a aquisição da imagem, identifique a posição das células usando a iluminação de campo claro. Os LEDs vermelhos são particularmente bons, pois não induzem danos fotográficos significativos.

Mude para iluminação a laser e selecione lasers apropriados e combinações de filtros para excitar os fluoróforos de sua escolha, certifique-se de que o ângulo do gramado seja subcrítico. Caso contrário, os sinais decorrentes das proteínas de fusão GFP não serão detectados. Encontre a seção superior da célula, que é o lado da célula voltado para a lamínula.

Aumente gradualmente o ângulo de incidência do feixe de laser até que os sinais desapareçam e, em seguida, diminua lentamente o ângulo até o ponto em que a fluorescência na superfície da célula reapareça. Ajuste o foco Z novamente para obter a posição ideal na superfície. Ângulos de grama aceitáveis não criam halo borrado na borda da célula, conforme ilustrado por este exemplo de proteína de levedura.

PMA uma GFP imageada com ângulos de incidência decrescentes do canto superior esquerdo para o canto inferior direito. As imagens mostram uma perda repentina de sinal no ângulo crítico e diminuição progressiva nas informações estruturais e na relação sinal-ruído, ajustam as intensidades do laser e o ganho da câmera para maximizar a faixa dinâmica. Normalmente, as câmeras EMCD são ideais para detectar sinais muito baixos em altas taxas de sinal para ruído.

A microscopia de relva é muito sensível a pequenas alturas. Diferenças da lamínula resultando em apenas algumas células que podem ser visualizadas ao mesmo tempo. Esta imagem de uma densa suspensão de esferas fluorescentes é um exemplo de um campo de visão irregular onde apenas parte do campo de visão está em foco.

Portanto, para células pequenas, a região de aquisição pode ser reduzida a uma sub-região contendo o objeto de escolha. Para experimentos de grama de cor dupla, o sangramento de fluoróforos deve ser minimizado para pares RFP. Use filtros de emissão separados, pois a RFP é excitada semanalmente por luz de 488 nanômetros.

Um fluxo de trabalho típico para evitar sangramento e imagens em duas cores é mostrado aqui. Depois de obter imagens das células com conjuntos de filtros separados, as imagens são devolvidas e alinhadas usando esferas fluorescentes antes de serem mescladas Para análise, um parâmetro crítico que influencia a qualidade da imagem é o alinhamento a laser e uma objetiva limpa. Depois de alinhar o laser e focar na posição Z usada para a imagem do gramado, remova a amostra e limpe a objetiva de todo o óleo.

O óleo residual levará à difração da luz do laser e manchas no perfil do feixe. A microscopia de turf pode ser usada para visualizar a distribuição de homólogos de actina e enzimas da parede celular em células bacterianas. Neste resultado representativo, células sutis de bacilo expressando fusões GFP da actina hoog MBL ou da transpeptidase PBPH foram visualizadas por turf e epifluorescência regular.

As imagens aqui representam projeções médias de uma série temporal para indicar a área coberta por móvel. Patches MBL monitorados com diferentes modos de imagem. O contorno azul na imagem de sobreposição indica o limite da célula visualizado a partir de uma imagem de campo claro.

A transpeptidase PBPH expressa semanalmente localiza-se em manchas corticais que dificilmente são visíveis por epifluorescência, mas podem ser claramente distinguidas por grama. A penetração reduzida pode ser melhor observada para o sinal P-B-P-H-G-F-P no SEPTA indicado pelas setas, que aparece como linhas na epifluorescência, mas como pontos na grama. Este próximo conjunto de imagens mostra uma comparação entre a epifluorescência e a iluminação de relva do componente complexo TOR, bit 61 em Saccharomyces visi.

Esta proteína é expressa semanalmente e forma pequenas manchas corticais com apenas algumas cópias de proteínas por mancha. Na epifluorescência, apenas algumas manchas são visíveis acima do fundo forte, enquanto as manchas podem ser visualizadas com uma relação sinal-ruído muito boa no gramado. Melhorias adicionais no contraste da imagem podem ser obtidas por meio de várias etapas de processamento de imagem, como subtração de imagens gaussianas ou medianas desfocadas, enquanto a subtração de fundo local remove o ruído e aumenta a nitidez das estruturas de alta intensidade.

Isso geralmente tem o preço de uma perda de estruturas finas e amplificação exagerada de regiões de alta intensidade. Conforme indicado pela seta, um procedimento superior é a deconvolução 2D, que pode ser realizada com pacotes de software gratuitos ou disponíveis comercialmente. O aumento do contraste após a deconvolução é ilustrado por este filme de lapso de tempo dos GFP RAs dois que mostra imagens alternadas de grama bruta e devolvida.

Como a GFP RAs dois é uma proteína de movimento rápido, tempos de aquisição rápidos são importantes para resolver. Seu comportamento dinâmico. O processamento de imagens é especialmente importante para análises de colocalização, conforme ilustrado neste filme colorido duplo de lapso de tempo de proteínas de levedura, FET 3G FP e PMA one RFP.

Os primeiros 10 quadros representam imagens brutas e os quadros restantes são imagens descentralizadas Para tornar a análise possível, é fundamental maximizar o contraste e aumentar a nitidez das imagens brutas borradas. Turf e frap oferecem uma combinação poderosa para estudar a dinâmica das proteínas corticais. O uso desta técnica em células B mais sutis expressando G-F-P-M-B-L descartou a esteira como o mecanismo para a motilidade observada de manchas contendo MBL.

O gráfico chm do patch móvel e o perfil de intensidade ao longo do gráfico chm indicado pela linha pontilhada são mostrados de maneira semelhante à membrana plasmática da levedura. Um TPAs PMA revelou os rearranjos lentos das proteínas da membrana plasmática da levedura, que se distribuem em domínios semelhantes a redes que cobrem toda a superfície celular após seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisas no campo da biologia celular de bactérias para explorar o mecanismo de síntese da parede celular em BA subtilis.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como adquirir imagens de microorganismos como leveduras e bactérias, e como essa técnica pode ajudar no estudo das propriedades dinâmicas das proteínas corticais.