Name: Visualização de Cortex organização e dinâmica em microorganismos, utilizando microscopia de fluorescência Total Internal Reflection (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-01T12:03:00.000+00:00
Duration: 14 min 14 s
Description: Aprenda a usar microscopia TIRF para visualizar dinâmica de proteínas no córtex celular de microrganismos com paredes celulares. Esta técnica oferece alta resolução temporal e contraste superior para estudos de biologia celular microbiana.

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Este trabalho foi financiado pela Sociedade Max Planck.

<ol><li>Axelrod, D., Thompson, N. L., Burghardt, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+internal+inflection+fluorescent+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Total internal inflection fluorescent microscopy.</a> J. Microsc. 129, 19-28 (1983).</li>
<li>Axelrod, D., Omann, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Combinatorial microscopy.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 944-952 (2006).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+imaging+of+surface+fluorescence+with+very+high+aperture+microscope+objectives%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Selective imaging of surface fluorescence with very high aperture microscope objectives.</a> J. Biomed. Opt. 6, 6-13 (2001).</li>
<li>Dominguez-Escobar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processive+movement+of+MreB-associated+cell+wall+biosynthetic+complexes+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Processive movement of MreB-associated cell wall biosynthetic complexes in bacteria.</a> Science. 333, 225-228 (2011).</li>
<li>Sparkes, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bleach+it%2C+switch+it%2C+bounce+it%2C+pull+it%3A+using+lasers+to+reveal+plant+cell+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Bleach it, switch it, bounce it, pull it: using lasers to reveal plant cell dynamics.</a> J. Exp. Bot. 62, 1-7 (2011).</li>
<li>Uchida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+synthesis+and+absolute+configuration+of+avenolide%2C+extracellular+factor+in+Streptomyces+avermitilis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Antibiot.+%28Tokyo%29%22%5BJournal%5D)">Total synthesis and absolute configuration of avenolide, extracellular factor in Streptomyces avermitilis.</a> J. Antibiot. (Tokyo). , (2011).</li>
<li>Yu, H., Wedlich-Soldner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+actin+dynamics%3A+Generating+randomness+by+formin%28g%29+and+moving%5BTitle%5D)+AND+%22Bioarchitecture%22%5BJournal%5D)">Cortical actin dynamics: Generating randomness by formin(g) and moving.</a> Bioarchitecture. 1, 165-168 (2011).</li>
<li>Yu, J. H., Crevenna, A. H., Bettenbuhl, M., Freisinger, T., Wedlich-Soldner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+actin+dynamics+driven+by+formins+and+myosin+V%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Cortical actin dynamics driven by formins and myosin V.</a> J. Cell. Sci. 124, 1533-1541 (2011).</li>
<li>Berchtold, D., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TORC2+plasma+membrane+localization+is+essential+for+cell+viability+and+restricted+to+a+distinct+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">TORC2 plasma membrane localization is essential for cell viability and restricted to a distinct domain.</a> Mol. Biol. Cell. 20, 1565-1575 (2009).</li>
<li>Vizcay-Barrena, G., Webb, S. E., Martin-Fernandez, M. L., Wilson, Z. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+and+single-molecule+imaging+of+plant+fluorescent+proteins+using+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+%28TIRFM%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Subcellular and single-molecule imaging of plant fluorescent proteins using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM).</a> J. Exp. Bot. 62, 5419-5428 (2011).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Microscopia TIRF é a técnica de escolha para as proteínas de imagem periféricos. A profundidade de penetração de baixo do campo evanescente minimiza de fora do foco de luz, o que leva a um sinal muito bom para relação de ruído e permite que a aquisição de dados com altas taxas de quadros de imagem, ou de proteínas muito fracamente expressas. A combinação de alto contraste e altas taxas de quadros faz TIRF microscopia uma ferramenta perfeita para imagens espaço-temporais dinâmica de proteínas corticalmente localizadas. C...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome da ferramenta / reagente </td><td> Tipo </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Orbital Shaker </td><td> Ferramenta </td><td> UniEquip </td><td> UNITWIST 3-D ROCKER SHAKER </td></tr><tr><td> Microscópio TIRF </td><td> Até </td><td></td><td> Configuração personalizada </td></tr><tr><td> Recipiente de vidro </td><td> Ferramenta </td><td> VITLAB </td><td> 340-232880353 </td></tr><tr><td> Suporte de coloração Cerâmica </td><td> Ferramenta </td><td> Thomas Sci. </td><td> 8542E40 </td></tr><tr><td> Concanavalina A </td><td> Reagente </td><td> Sigma </td><td> L7647 </td></tr><tr><td> Lamelas # 1 (18 x 18 mm) </td><td> Microscópio </td><td> Menzel Glaser </td><td> BB018018A1 </td></tr><tr><td> Lâminas de Microscopia </td><td> Microscópio </td><td> Menzel Glaser </td><td> AA00000102E </td></tr><tr><td> Óleo de imersão </td><td> Microscópio </td><td> Zeiss </td><td> Immersol 518F </td></tr><tr><td> Agarose </td><td> Reagente </td><td> Invitrogen </td><td> 16500-500 </td></tr><tr><td> FluoSpheres </td><td> Reagente </td><td> Invitrogen </td><td> F8795 </td></tr></tbody></table>

visualização de cortex organização e dinâmica em microorganismos, utilizando microscopia de fluorescência total internal reflection

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Microscopia TIRF emergiu como uma tecnologia de imagem poderosa para estudar espácio-temporais dinâmica de moléculas fluorescentes in vitro e em células vivas 1. O fenómeno óptico de reflexão interna total ocorre quando a luz passa de um meio com elevado índice de refracção em um meio com baixo índice de refracção com um ângulo maior do que um ângulo característica crítica (isto é, mais perto de ser paralelo com o limite). Embora toda a luz é reflectida de volta sob tais condições, uma onda evanescente é criado que se propaga através e ao longo do limite, que decai exponencialmente com a distância, e só penetra áreas de amostra que são 100-200 nm perto da interface 2. Além de proporcionar resolução axial superior, a excitação reduzida de fora do foco fluoróforos cria um sinal muito alta para relações de ruído e minimiza os efeitos prejudiciais da fotodegradação 2,3. Sendo uma técnica de campo amplo, TIRF também permite que imagem mais rápido acquisition do que a maioria de digitalização baseados em configurações confocal. À primeira vista, a profundidade de penetração baixa de TIRF parece ser incompatível com a imagem de células bacterianas e fúngicas, que são muitas vezes cercados por paredes celulares espessas. Pelo contrário, verificou-se que as paredes celulares de levedura e células bacterianas realmente melhorar a usabilidade do TIRF e aumentar a gama de estruturas observáveis ​​4-8. Muitos processos celulares podem ser acessados ​​diretamente pelo TIRF em pequenos microorganismos unicelulares, que muitas vezes oferecem poderosas técnicas de manipulação genética. Isso nos permite executar em experimentos de bioquímica in vivo, onde cinética de interações protéicas e atividades podem ser avaliados diretamente em células vivas. Descrevemos aqui os passos individuais necessárias para obter imagens de alta qualidade para TIRF Saccharomyces cerevisiae ou células de Bacillus subtilis. Ressalte-se vários problemas que podem Affect visualização TIRF de sondas fluorescentes em células e ilustram o procedimento com vários exemplos de aplicação. Por fim, demonstramos como as imagens TIRF pode ser melhorada usando técnicas de restauração de imagem estabelecidos.

Total reflexão interna de fluorescência microscopia (TIRF) é uma abordagem poderosa para observar as estruturas perto da superfície da célula em alto contraste e resolução temporal. Demonstramos como TIRF pode ser empregue para estudar a dinâmica de proteína no córtex de parede celular fechados células bacterianas e fúngicas.

Visualização de Cortex organização e dinâmica em microorganismos, utilizando microscopia de fluorescência Total Internal Reflection

A microscopia TIRF emergiu como uma poderosa tecnologia de imagem para estudar a dinâmica espaço-temporal de moléculas fluorescentes in vitro e em células vivas1. ...

O objetivo geral deste procedimento é obter imagens de alta qualidade, por fluorescência, reflexão total interna ou turf, de microrganismos com parede celular. Isso é realizado primeiramente preparando lamínulas e células. O segundo passo é alinhar com precisão a configuração do microscópio para obter qualidade ótima de imagem.Em seguida, são escolhidos os incidentes corretos, ângulos e condições de imagem para a aquisição de imagens ou vídeos. O passo final é o processamento pós-aquisição das imagens obtidas. Em última análise, a microscopia turf é utilizada para estudar a dinâmica da localização proteica no córtex celular.A principal vantagem desta técnica em comparação com metais excessivos, como microscopia convencional ou confocal, é que o contraste da imagem em microscopia é muito alto, permitindo tempos rápidos e baixa intensidade luminosa. Assim, este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de pesquisa de membranas, como os mecanismos de segregação lateral de proteínas ou a mobilidade de proteínas de membrana. Lâminas de cobertura para microscopia turf devem ser limpas de partículas de poeira antes do uso.Como o fundo é sensível a sinais de fundo prove

visualization-cortex-organization-dynamics-microorganisms-using-total

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Aqui demonstramos os protocolos para a realização de uma única molécula de microscopia de fluorescência em células vivas de bactérias para habilitar funcionais complexos moleculares a serem detectados, rastreados e quantificados.

Visualizando Único complexos moleculares In Vivo Usando microscopia de fluorescência avançada

Este vídeo descreve o TIRF, uma técnica baseada em microscopia de reflexão interna total para visualizar a dinâmica de polimerização de actina e microtúbulos. O método permite a imagem de alta resolução da dinâmica de acoplamento de actina e microtúbulos em tempo real, o que é essencial para a compreensão das diafonias celulares.

Microscopia TIRF para visualizar a dinâmica de acoplamento de actina e microtúbulos

Fonte: Daniele, F., et. al TIRFM e sondas GFP sensíveis ao pH para avaliar a dinâmica da vesícula do neurotransmissor em células de neuroblastoma SH-SY5Y: imagem celular e análise de dados. J. Vis. Exp. (2015). Este vídeo demonstra a imagem de células de neuroblastoma humano usando um microscópio de fluorescência de reflexão interna total (TIRF) para visualizar vesículas sinápticas marcadas com fluoróforo. As células são focadas primeiro no modo de epifluorescência. Os ajustes são então feitos...

Imagem celular usando microscopia de fluorescência de reflexão interna total

Fonte: Winkle, C. C., et al. Utilizando metodologias combinadas para definir o papel da entrega da membrana plasmática durante a ramificação do axônio e a morfogênese neuronal. J. Vis. Exp. (2016)Este vídeo demonstra a microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRF) para visualizar eventos exocíticos em neurônios corticais. Um marcador de proteína fluorescente verde (GFP) sensível ao pH fluoresce após a fusão da vesícula, com excitação seletiva de TIRF capturando exocitose...

Microscopia de Fluorescência de Reflexão Interna Total para Visualização de Eventos Exocíticos 

Para investigar as velocidades de fluxo e a direcionalidade da actina filamentosa na sinapse imunológica das células T, a imagem de super-resolução de células vivas é combinada com fluorescência de reflexão interna total e quantificada com espectroscopia de correlação de imagem espaço-temporal.

Cortical actina Fluxo nas células T quantificada pela correlação espacial e temporal Imagem Espectroscopia de iluminação estruturada Microscopia Dados

Um microscópio avançado que permitem rápida e de alta resolução de imagem de ambos, a membrana plasmática isolada e o volume intracelular circundante, será apresentado. A integração de giro do disco e total microscopia de fluorescência de reflexão interna em uma configuração permite experiências de imagens ao vivo em taxas de aquisição elevado até 3.5 s por pilha de imagem.

Visualizando a formação de adesão em células por meio de avançados girando a reflexão interna Total disco microscopia de fluorescência

Este protocolo é um guia para a implementação de microscopia de reflexão de interferência em um microscópio de fluorescência padrão para imagens sem rótulo, de alto contraste e alta velocidade de microtúbulos usando ensaios de superfícies in vitro.

Implementação de microscopia de reflexão de interferência para imagens sem rótulo e alta velocidade de microtúbulos

Aqui, um ensaio de reconstituição in vitro baseado em microscopia TIRF é apresentado para quantificar e comparar simultaneamente a dinâmica de duas populações de microtúbulos. Um método é descrito para visualizar simultaneamente a atividade coletiva de múltiplas proteínas associadas a microtúbulos em feixes de microtúbulos interligados e microtúbulos únicos.

Visualização Simultânea da Dinâmica dos Microtúbulos Cruzados e Únicos In Vitro pela Microscopia TIRF

Apresentamos um protocolo para a implementação de microscopia de reflexão de interferência e microscopia de reflexão interna-fluorescência para a imagem simultânea de microtúbulos dinâmicos e proteínas fluorescentes rotuladas como microtubulas.

Reflexão de Interferência Simultânea e Microscopia de Fluorescência De Reflexão Interna Total para Microtúbulos Dinâmicos de Imagem e Proteínas Associadas

Este protocolo é um guia para visualizar actina dinâmica e microtúbulos usando um ensaio de microscopia de fluorescência interna total in vitro (TIRF).

Visualizando a dinâmica de acoplamento de actina e microtúbula in vitro por microscopia de fluorescência interna total (TIRF)

Aprenda a usar microscopia TIRF para visualizar dinâmica de proteínas no córtex celular de microrganismos com paredes celulares. Esta técnica oferece alta resolução temporal e contraste superior para estudos de biologia celular microbiana.

Visualização de Cortex organização e dinâmica em microorganismos, utilizando microscopia de fluorescência Total Internal Reflection (Vídeo) | JoVE Journal

Visualização de Cortex organização e dinâmica em microorganismos, utilizando microscopia de fluorescência Total Internal Reflection

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