Uma plataforma Microfluidic de ultra alta taxa de transferência para o sequenciamento do genoma de célula única

O objetivo geral deste experimento é gerar dados de sequenciamento genômico com código de barras de dezenas de milhares de células únicas usando uma série de dispositivos microfluídicos. Este método alcança uma taxa de transferência de sequenciamento de célula única incomparável. Usamos microfluídica para encapsular, lisar e codificar células individualmente, preservando a heterogeneidade genômica subjacente, que é perdida no choque convencional em estudos de sequenciamento.

A principal vantagem dessa técnica é que ela é de alto rendimento e capaz de produzir dados de uma única célula a partir de dezenas de milhares de células. Embora trabalhemos com micróbios nesta demonstração, o fluxo de trabalho pode ser adaptado para uso com diferentes tipos de células por meio de pequenas modificações nas dimensões do dispositivo microfluídico. Para iniciar o protocolo, prepare um mililitro de 3% de peso por volume de agarose de baixa temperatura de fusão em tampão 1X Tris-EDTA, ou TE.

Mantenha a solução de agarose em um bloco de calor a 90 graus Celsius apenas até o carregamento da seringa. Ressuspenda as células em um mililitro de solução salina tamponada com fosfato, ou PBS, e gire as células. Aspire o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em um mililitro de 17% de volume a meio de gradiente de densidade de volume em PBS e mantenha as células congeladas até o carregamento da seringa.

Em seguida, carregue uma seringa de três mililitros com óleo fluorado, ou HFE, contendo um surfactante PFPE-PEG de 2% em peso por peso. Encaixe-o com uma agulha de calibre 27 e coloque-o em uma bomba de seringa. Carregue a suspensão celular e a agarose derretida em seringas de um mililitro, ambas com agulhas de calibre 27, e coloque-as em bombas de seringa.

Em seguida, coloque um aquecedor de ambiente no alto e posicione a superfície de aquecimento a 10 centímetros de distância da seringa. Certifique-se de que a temperatura medida na seringa é de aproximadamente 80 graus Celsius. Antes de inserir os tubos no dispositivo, prepare as bombas para remover o ar da linha.

Conecte as agulhas da seringa às entradas do dispositivo microfluídico usando pedaços de tubo de polietileno ou PE. Conecte um pedaço de tubo à saída e coloque a extremidade livre em um tubo de coleta de 15 mililitros. Após a confecção, coloque o tubo de coleta a quatro graus Celsius por 30 minutos para garantir a gelificação completa da agarose.

Remova a camada inferior de óleo do tubo de coleta usando uma seringa de três mililitros equipada com uma agulha de calibre 20, tomando cuidado para não perturbar a camada superior das gotículas de agarose. Adicione um mililitro de 10% de volume por volume de PFO em HFE para quebrar as gotas de agarose de sua camada de surfactante. Pipetar a solução para cima e para baixo durante um minuto para revestir completamente as emulsões, que devem ser homogéneas e isentas de grumos.

Gire o tubo cônico a 2.000 vezes g por um minuto para coletar os microgéis de agarose. Aspire o sobrenadante PFO/HFE e certifique-se de que os microgéis estejam livres de sua camada de surfactante e estejam limpos. Depois de lavar os microgéis, verifique o encapsulamento celular nos microgéis sob um microscópio com uma ampliação de 400X, corando uma alíquota de 10 microlitros de géis com coloração de ácido nucleico 1X.

Conecte a entrada de células de um dispositivo dropmaker de co-fluxo com um pequeno pedaço de solda de chumbo. Antes de inserir os tubos no dispositivo, prepare as bombas para remover o ar da linha. Conecte um pedaço de tubo à saída e coloque a extremidade livre em um tubo de PCR de 0,2 mililitro.

Use as taxas de fluxo na tela para dropmaking. Colete as gotas nos tubos de PCR com aproximadamente 50 microlitros de gotas em cada tubo. Após a fabricação de gotas, remova cuidadosamente a camada inferior de óleo HFE das emulsões usando pontas de pipeta de carregamento de gel e substitua-a por óleo fluorado FC-40 contendo um surfactante PFPE-PEG de 5% em peso por peso.

Em seguida, programe o ciclo térmico. Antes de inserir os tubos no dispositivo, prepare as bombas para remover o ar da linha. Conecte as seringas contendo HFE, mistura de marcação e microgéis às entradas do dispositivo microfluídico usando pedaços de tubo de PE.

Conecte um pedaço de tubo à saída e coloque a extremidade livre em uma seringa vazia de um mililitro com o êmbolo puxado para a linha de um mililitro. Em seguida, verifique a taxa de encapsulamento do microgel sob um microscópio de luz com ampliação de 400X. Encaixe a seringa contendo as emulsões de marcação com uma agulha e incube-a na vertical em um bloco de calor ou forno por uma hora a 55 graus Celsius para fragmentar o DNA genômico.

Prepare as gotículas de código de barras para a fusão substituindo a fração de óleo FC-40 por HFE 2% de peso por peso PFPE-PEG. Transfira cuidadosamente as gotas para uma seringa de um mililitro, encaixe-a com uma agulha e coloque-a em uma bomba de seringa. Carregue a seringa de gotículas de microgel incubada e etiquetada em uma bomba de seringa.

Em seguida, conecte as três seringas de cloreto de sódio às duas entradas de eletrodo e à entrada de fosso único usando pedaços de tubo de PE. Antes de inserir os tubos no dispositivo, prepare as bombas para remover o ar da linha. Conecte as três seringas HFE montadas nas bombas às duas entradas de óleo espaçadoras e à entrada de óleo de gotejamento usando pedaços de tubo PE.

Em seguida, dispare todos os tubos de reinjeção de gotículas com uma pistola antiestática antes de conectar o tubo às agulhas da seringa. Conecte a seringa de mistura de PCR, a seringa de gota de microgel e a seringa de gota de código de barras às suas respectivas entradas com tubo de PE. Conecte a agulha da seringa do eletrodo a um inversor fluorescente de cátodo frio usando um clipe jacaré.

Defina a fonte de alimentação CC do inversor para dois volts. Execute o dispositivo de fusão dupla com as taxas de fluxo recomendadas. Colete as gotas em tubos de PCR com aproximadamente 50 microlitros de emulsão em cada tubo.

Antes do ciclo térmico, remova cuidadosamente a camada inferior de óleo HFE das emulsões usando pontas de pipeta de carregamento de gel e substitua-as por óleo fluorado FC-40 contendo um surfactante PFPE-PEG de 5% por peso. Em seguida, programe o ciclo. Para recuperar o DNA das gotículas do ciclo térmico, agrupe as gotículas em um tubo de microcentrífuga e quebre as emulsões usando 20 microlitros de PFO.

Vortex-los por 10 segundos para misturar. Gire o tubo. Remova cuidadosamente a camada aquosa superior do tubo usando uma pipeta e transfira-a para um novo tubo de microcentrífuga.

Descarte a fase oleosa. Em seguida, prossiga para as etapas de preparação, sequenciamento e análise da biblioteca. Um histograma das contagens de código de barras versus o tamanho do grupo mostra que uma parte significativa dos grupos de código de barras válidos está logo acima dos pares de 7,5 kilobase por tamanho limite de grupo, o que exclui os órfãos mutados por PCR.

A abundância relativa dos tipos de células de uma comunidade sintética de 10 células de três bactérias gram-negativas, cinco bactérias gram-positivas e duas leveduras foi calculada contando as leituras brutas e os grupos de código de barras. Um mapa de cobertura circular de leituras de B.subtilis de todos os grupos de códigos de barras ilustra a uniformidade das leituras de SiC-seq, sem regiões de abandono observáveis, onde a cobertura média foi de 5,55X. A uniformidade da cobertura foi verificada com uma distribuição de frequência dos valores de cobertura normalizados.

Ao tentar este procedimento, é importante manter uma taxa de encapsulamento de cerca de um código de barras ou célula para cada 10 gotículas. Isso limita a probabilidade de um evento de encapsulamento duplo, que pode contorcer os dados de célula única. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como configurar e operar os dispositivos microfluídicos usados para gerar dados de sequenciamento de célula única.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser executada em oito horas ou duas quatro horas por dia.