Name: Uma plataforma Microfluidic de ultra alta taxa de transferência para o sequenciamento do genoma de célula única (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Aprenda a usar uma plataforma microfluidica de ultra alta taxa de transferência para sequenciamento do genoma de célula única. Este método preserva a heterogeneidade genômica encapsulando e marcando células individualmente.

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Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation através de um prémio de carreira (número de concessão DBI-1253293); o National Institutes of Health (NIH) (concessão números HG007233-01, 01-R01-EB019453, 1R21HG007233, DP2-AR068129-01, R01-HG008978); e defesa avançada projetos Agência vivendo fundições programa de pesquisa (contrato número HR0011-12-C-0065, N66001-12-C-4211, HR0011-12-C-0066).

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Patentes relativas a este fluxo de trabalho podem ser licenciado para Bio da missão, da qual Adam R. Abate é uma acionista.

O fluxo de trabalho do SiC-seq microfluidic produz dados de sequenciamento do genoma de célula única de milhares de células bacterianas. Códigos de barras Digitas emendados para os genomas de células encapsuladas microgel permitem a em silico deconvolução de dados NGS em grupos de leituras de código de barras, provenientes da mesma célula. Um experimento de controle com uma comunidade microbiana de composição conhecida é necessário para avaliar a pureza dos grupos de código de barras. Uma grande fração dos grupos de baixa pureza indica que a taxa de encapsulação de célula é muito alta ou que não há contaminação gota significativa ocorrendo durante as etapas de processamento microfluidic. De acordo com estatísticas de Poisson, o código de barras e células devem ser encapsuladas em uma proporção de alvo de 1 partícula para cada 10 gotas limitar a taxa de vários eventos de encapsulamento para menos de 5% de todas as gotas de não-vazio. Uma taxa de encapsulação superior isto aumenta as taxas de parelhas exponencialmente, para a verificação da relação de encapsulamento durante o processo de dropmaking é de importância crítica. Os usuários devem ser particularmente cautelosos com o encapsulamento de várias células em uma única microgel porque lê a partir de células diferentes, compartilhando a mesma sequência de código de barras não pode ser bioinformatically separado. No caso 1 celular recebe 2 códigos de barras diferentes, a pureza do grupo de código de barras é afetada, embora as métricas de abundância são distorcidas quando contando por sequência de código de barras.
Contaminação cruzada da gota também pode surgir devido às condições de fusão de qualidade inferior. Durante uma operação bem sucedida, o dispositivo de fusão microfluidic (Figura 5) botija pode emparelhar-se 1 gota de código de barras com 1 microgel e um volume de reagente PCR. Taxas de fluxo non-ideal irão resultar em uma gota de emparelhamento em rácios incorretos: 1 código de barras pode ser emparelhado com 2 microgels, por exemplo. Todos os caudais constantes do protocolo se destinam a ser estimativas e podem precisar ser ajustada dependendo ligeiras variações em tamanhos de geometria e da gota do dispositivo. Os usuários com acesso a câmeras com capacidade de gravação de alta velocidade (> 10.000 quadros/s) deve verificar se a fusão de gotículas correto no início e ao longo da operação microfluidic. Os usuários sem acesso a uma câmera de alta velocidade podem coletar um pequeno volume de saída mesclada e medir manualmente os tamanhos de gotículas sob um microscópio. O tamanho da gota deve ser uniforme: um excesso de códigos de barras não mesclados ou gotas microgel indica que as taxas de reinjeção devem ser reduzidas em conformidade.
Diversos gerais devem ser tomadas precauções ao manusear microgels e microdroplets para preservar a sua integridade. Microgels, embora mecanicamente robusto, deve ser suficientemente arrefecido antes da quebra e etapas para garantir a completa gelificação de lavagem. Microgels não-esférica são uma indicação de que a agarose não foi dado tempo suficiente para solidificar. Quando microgels de lavagem, gire as suspensões para baixo na velocidade necessária para evitar uma perda de produto. Agarose hidrogel tem um índice de refração estreita correspondência da água e pode ser difíceis de ver em um tubo22, então os usuários cuidadosamente devem identificar o limite de gel-líquido antes da aspiração. Gotículas de água em óleo são suscetíveis a coalescência pela acumulação de forças estáticas23 luvas de laboratório e tubulação. Por este motivo, recomendamos carregar as seringas de reinjeção de gotículas com as próprias mãos e tratar todas as linhas de reinjeção com uma arma antiestática antes da escorva da bomba. As gotas se consolidou grandes podem ser removidas girando lentamente as emulsões em uma seringa e aspirar manualmente as gotas maiores, que se acumulam perto do topo, devido à sua maior força de empuxo.
SiC-seq é a primeira tecnologia para demonstrar o sequenciamento do genoma de célula única de > 50.000 células bacterianas. Esta plataforma oferece vantagens significativas na taxa de transferência sobre as abordagens existentes e permite uma amostragem mais profunda das comunidades microbianas heterogêneas. Até à data, microfluidic tecnologias para o sequenciamento do genoma de célula única têm empregado microchambers9 e micropoços24 para isolamento de célula e amplificação, mas com a quantidade no intervalo de apenas dezenas a centenas de células. O fluxo de classificação de células únicas em wellplates5,6 não requer nenhuma instrumentação especializada microfluidic mas possui uma taxa de transferência baixa da mesma forma. Dado que as amostras de solo e água do ambiente comumente tem diversidades alfa de > 1.000 da espécie nível25,26, SiC-seq é altamente vantajosa em virtude de sua capacidade de experimentar um número muito maior de organismos. O fluxo de trabalho de SiC-seq é adaptável às entradas de célula de laboratório de cultura, o ambiente natural ou um hospedeiro vivo. Uma amostra de células só precisa estar em uma suspensão aquosa e livre de partículas grandes (> 10 µm) para ser apropriado para microfluidic encapsulamento. Por exemplo, o método tem sido anteriormente aplicado a uma amostra de água do mar usando uma série de lavagem e filtragem de etapas para pré-processar as células antes de encapsulamento17.
O protocolo de SiC-seq gera uma quantidade relativamente escassa de dados de sequenciamento de cada célula única e pode não ser adequado para todas as aplicações. Alguns algoritmos de Bioinformática como montagem do genoma de novo ou variante de nucleotídeo único (SNV) chamando exigem maiores profundidades de cobertura para trabalhar eficazmente. Em vez disso, grupos de código de barras podem ser agrupado em silico por taxonômica binning métodos27 para que os algoritmos podem ser aplicados em conjuntos maiores de leituras. A relativamente baixa eficiência global de código de barras do fluxo de trabalho SiC-seq também pode apresentar desafios em casos onde a disponibilidade do exemplo de entrada é baixa. SiC-seq baseia-se em uma etapa de encapsulamento de Poisson-distribuído o código de barras, pois cerca de 10% das células receber um código de barras molecular e são amplificados durante a etapa de preparação final da biblioteca. Enquanto isto é comparável a outros regimes de barcoding baseada em microdroplet10, os usuários que trabalham com amostras de células preciosas podem ter dificuldade em alcançar o rendimento adequado biblioteca de sequenciamento e talvez seja necessário aumentar o número de ciclos PCR na final etapa de amplificação. Outra solução potencial para usuários com conhecimentos microfluídicos é classificar gotículas de código de barras positivas após a etapa PCR digital, trazendo assim a eficiência global do código de barras para > 85%28.
Uma direção futura potencial para SiC-seq tecnologia é adaptar o fluxo de trabalho para uso com células de mamíferos, pavimentando o caminho para novos estudos clínicos de célula única. Como exemplo, uma análise da variação número cópia entre único câncer células maio ainda mais nossa compreensão do papel da heterogeneidade em câncer patologia2. Alternativamente, integrar SiC-seq com os métodos existentes para sondar e enriquecer as sequências de DNA de interesse29 permitiria o sequenciamento de célula única orientado de subpopulações ou raras linhagens de células. Com amostras ambientais, genes de dentro de uma via metabólica conhecida poderiam ser alvejados e analisados contextualmente, ao lado de vizinhos genes para identificar novas ilhas genômicas. De dentro de um ambiente do hospedeiro humano, amostras de bactérias patogênicas de baixo-título podem ser isoladas e sequenciado no nível de célula única para examinar mais de perto suas origens genotípicas de virulência.

O genoma serve como um modelo de identidade celular e função, que contém a totalidade de um organismo da codificação de potencial. Uma compreensão da biologia celular no nível do genoma pode explicar a diversidade fenotípica observada dentro de populações de células heterogêneas. Esta heterogeneidade é aparente em sistemas biológicos e tem grandes implicações para a saúde humana e doença. Por exemplo, variações de número cópia genética entre as células do tumor estão ligadas à evolução e propagação do câncer1,2. Em infecções bacterianas, Ilhas de patogenicidade presentes em uma pequena fração dos genomas podem ser transferidas horizontalmente em provocar a proliferação de bactérias resistentes a antibióticos3,4. Um desafio principal no estudo de genomas a nível de célula única é as baixas quantidades de DNA disponível, bem como a necessidade de analisar milhares de células para a completa diversidade de genótipos da amostra. Por estas razões, limitações no throughput experimental tem dificultado a eficácia dos estudos de célula única, resultados para as células mais abundantes de polarização. Técnicas de isolamento de célula única como fluxo classificação5,6, pinça óptica7, embedment em granel géis8e microfluídica9 são capazes de processar centenas de células para sequenciamento; no entanto, isso representa apenas uma pequena fração da maioria das amostras. Um método para o sequenciamento do genoma de célula única com substancialmente maior throughput permitiria mais profunda e mais completa caracterização das populações de células, assim, elucidar o papel da diversidade genotípica dentro dessas comunidades.
Gotícula microfluídica permite a manipulação da elevado-produção de células e reagentes biológicos dentro de milhões de reatores picoliter-escala. Até à data, microdroplet tecnologias têm sido usadas para estudar os padrões de expressão diferencial entre células de tecidos heterogêneos de11,10,12, profundamente sequenciar moléculas longo13,14 ,15e conduta imunoprecipitação de cromatina sequenciamento (ChiP-seq) análises em células únicas16. Com efeito, microdroplets são capazes de operações de elevado-throughput, compartimentadas, tornando-os passíveis de aplicações em genómica de célula única. O desenvolvimento desta tecnologia apresenta seus próprios desafios tecnológicos exclusivos, no entanto. Células devem ser lysed, purificadas e amplificadas com viés mínima, para populações de células uniformemente amostra. Além disso, ao contrário de polyadenylated transcrições de mRNA em células de mamíferos, não há nenhum motivo molecular comparável no genoma para facilitar a captura do ácido nucleico alvo. Por estas razões, o sequenciamento do genoma de célula única tem sido difícil de implementar em plataformas microdroplet.
Neste trabalho, nós fornecemos um protocolo detalhado de nossa abordagem anteriormente relatados monocelulares microfluidic capaz de sequenciamento de genomas de dezenas de milhares de células em uma única experiência de17. Com esta tecnologia, chamada SiC-seq, células bacterianas são encapsuladas em hidrogel mícron-escala e lysed individualmente, tagmented e fundiu-se com um microdroplet que contém um código de barras do oligonucleotide exclusivo, que é emendado no DNA genômico da célula através de um sobreposição de simples extensão cadeia da polimerase (PCR). O hidrogel serve como recipientes isolados em que DNA genômico de alto peso molecular é estericamente envolto, permitindo que as moléculas menores tais como detergentes e enzimas líticas para acessar e purificar DNA barcoding18antes de. Este protocolo processos > 50.000 células únicas em questão de horas, resultando em uma biblioteca de código de barras pronta para sequenciamento. Após o sequenciamento, as leituras são demultiplexed de acordo com sua sequência de célula única de código de barras, resultando em um conjunto de dados composto por milhões de leituras, cada um com um índice de celular.

<table><tbody><tr><td>Wafers de silício de 3", tipo P, grau de teste virgem</td><td>University Wafers</td><td>447</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 3025 fotorresistente</td><td>Microchem</td><td>17030192</td><td></td></tr><tr><td>Spin coater</td><td>Sistemas de revestimento especiais</td><td>G3P-8</td><td></td></tr><tr><td>Photomasks</td><td>CadArt Servcies</td><td>(custom)</td><td>Consulte os Arquivos Suplementares para designs de máscaras</td></tr><tr><td>Desenvolvedor PGMEA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>484431</tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>109827</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 kit de elastômero de silicone</td><td>Krayden</td><td>4019862</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de desgaseificação</td><td>Bel-Art</td><td>42025</td><td></td></tr><tr><td>punção de biópsia de 0,75 mm</td><td>World Precision Instruments</td><td>504529</td><td></td></tr><tr><td>lâminas de microscópio de vidro (75 mm x 50 mm)</td> <td>Corning</td><td>294775X50</td><td></td></tr><tr><td>Aquapel (tratamento de vidro hidrofóbico)</td><td>Pittsburgh Glass Works</td><td>47100</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de polietileno PE-2</td><td>Scientific Commodities</td><td>B31695-PE/2</td><td></td></tr><tr><td>Seringas de 1 mL</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>agulhas de calibre</td><td>27 BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de seringa</td><td>New Era Pump Systems</td><td>NE-501</td><td></td></tr><tr><td>Novec HFE-7500 óleo fluorado ( HFE)</td><td>3M</td><td>98-0212-2928-5</td><td></td></tr><tr><td>FC-40 óleo fluorado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9755</td><td></td></tr><tr><td>PEG-PFPE surfactante</td><td>Ran Biotechnologies</td><td>008-FluoroSurfactant</td><td></td></tr><tr><td>Aquecedor de ambiente</td><td>Lasko&nbsp;</td><td>CD09250&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Agarose, baixa temperatura de gelificação</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>a9414</td><td></td></tr><tr><td>TE (10X)</td> <td>Rockland</td><td>mb-007</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1X, pH 7,4</td><td>E & K Scientific Products</td><td>EK-65083</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep (gradiente de densidade médio)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>d1556</td><td></td></tr><tr><td>1H,1H,2H-Perfluoro-1-Octanol (PFO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>370533</td><td></td></tr><tr><td>Span 80 (monooleato de sorbitano)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>s6760</td><td></td></tr><tr><td>Hexano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>139386</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20 (polissorbato 20)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>p2287</td><td></td></tr><tr><td>Lisozima Tipo IV</td><td>MP Biomedicals</td><td>195303</td><td></td></tr><tr><td>Mutanolisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9901</td><td></td></tr><tr><td>Zymolyase (enzima lítica de levedura)</td> <td>Zymo Research</td><td>e1004</td><td></td></tr><tr><td>Lisostaphin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L7386</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl, pH 7,5, 1M</td><td>Invitrogen</td><td>15567-027</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Teknova</td><td>d9750</td><td></td></tr><tr><td>Lithium dodecyl sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9781</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>New England Biosciences</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, 200 Prova (100%)</td><td>Koptec</td><td>V1001</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green I (coloração de ácido nucleico)</td><td>Invitrogen</td><td>S7563</td><td></td></tr><tr><td>PEG 6k</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81260</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 (etoxilato de octilfenol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>t8787</td><td></td></tr><tr><td>Nextera DNA Library Prep Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-121-1030</td><td></td></tr><tr><td>Phusion Hot Start Flex Master Mix (High Fidelity Hot Start Master Mix)</td><td>New England Biosciences</td><td>m05365</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Multiplex PCR Master Mix (Taq Master Mix)</td><td>Applied Biosystems</td><td>4464263</td><td></td></tr><tr><td>Warmstart 2.0 Bst Polimerase (polimerase isotérmica)</td><td>New England Biosciences</td><td>m0538m</td><td></td></tr><tr><td>NT buffer do kit Nextera XT (tampão de neutralização)</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1024</td><td></td></tr><tr><td>Inversor fluorescente de cátodo frio</td><td>(personalizado)</td><td>(personalizado)</td><td></td></tr><tr><td>Fonte de alimentação CC</td><td>Mastech</td><td>HY1503D</td><td></td></tr><tr><td>Zerostat 3 pistola antiestática</td><td>Milty</td><td>5036694022153</td><td></td></tr><tr><td>porta-seringas de centrífuga impressas em 3D</td> <td>(personalizado)</td> <td>(personalizado) Consulte</td> <td>os arquivos suplementares para o arquivo de impressão 3D</td></tr><tr><td>Zymo DNA Clean & Concentrador-5</td><td>Zymo Research</td><td>D4003</td><td></td></tr></tbody></table>

uma plataforma microfluidic de ultra alta taxa de transferência para o sequenciamento do genoma de célula única

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

Tecnologias de sequenciamento sofreram uma mudança de paradigma de em massa de célula única resolução em resposta a um entendimento em evolução do papel da heterogeneidade celular em sistemas biológicos. No entanto, sequenciamento de célula única de grandes populações tem sido dificultado por limitações no processamento de genomas para sequenciamento. Neste trabalho, descrevemos um método de sequenciamento de genoma de célula única (SiC-seq) que usa gota microfluídica para isolar, amplificar e código de barras os genomas de células únicas. Encapsulamento de célula em microgels permite a purificação compartimentada e tagmentation do DNA, enquanto uma fusão microfluidic eficientemente pares cada genoma com um código de barras exclusivo do oligonucleotide de célula única, permitindo > 50.000 células únicas a ser sequenciado por execução. Os dados de sequenciamento é demultiplexed por código de barras, gerando grupos de leituras provenientes de células únicas. Como um método de alta produtividade e baixa-viés de sequenciamento de célula única, SiC-seq permitirá uma ampla gama de estudos genômicos dirigidos a populações de diversas células.

O fluxo de trabalho experimental de SiC-seq contém 3 dispositivos microfluídicos PDMS fabricados usando um procedimento de litografia macia (Figura 1). Um fluxo de co dropmaker (Figura 3A) gera 25 µm de gotículas digital de código de barras para a rotulagem de DNA genômico com um identificador exclusivo de célula única. Os oligonucleotides barcode consistem de uma sequência de degenerado bp 15 ladeado por alças PCR para a amplificação (tabela 2, BAR da primeira demão). Os códigos de barras são diluídos a uma concentração de femtomolar para alcançar o encapsulamento único-molécula, e todas as gotas recebem s de código de barras ou 0 ou 1. As gotículas contendo um código de barras são amplificadas, gerando muitas cópias de amplicons de dupla-hélice de código de barras. Uma mancha de ácido nucleico é usada para verificar a amplificação bem-sucedida e quantificar a taxa de encapsulamento dos fragmentos de código de barras (Figura 4B). Os microgels são geradas pela co fluxo uma suspensão de células bacterianas e um gel de agarose fundido com vazões iguais (Figura 2A). A agarose é preparada em duas vezes a concentração final desejada, como o processo de dropmaking de fluxo de co efetivamente dilui as soluções aquosas por um fator de 2. Como a agarose esfria, ela se solidifica em um diâmetro de 25 µm microgel ocupando o volume esférico de gota.
Uma série de etapas de lavagem e lise purifica o DNA genômico de alto peso molecular no microgels (Figura 2B). Depois de quebrar as emulsões, lavagens aquosas são realizadas em grandes volumes para diluir para rastreamento de solventes orgânicos, que podem inibir os tratamentos enzimáticos a jusante. Os microgels lavados são observados sob um microscópio para verificar a taxa de encapsulação de célula (Figura 4A). Um coquetel de enzimas com ampla atividade lítica é adicionado à suspensão microgel para digerir as paredes celulares de bactérias e micróbios eucariotas19. Um segundo tratamento com Proteinase K e detergente degrada as proteínas e solubiliza os restos celulares.
Tagmentation de DNA purificado é realizado em gotas para evitar contaminação potencial resultante da difusão de fragmentos de DNA de pequenas tagmented entre os microgels18. Um dispositivo de encapsulamento da gota (Figura 3B) compartimentaliza cada microgel com uma enzima de buffer e tagmentation, que simultaneamente fragmentos de DNA dupla-hélice enquanto também "marcação"-com um pré-carregado do oligonucleotide20. Os microgels são carregados para as gotas como partículas perto-embalado, conseguindo taxas de encapsulamento se aproximando 1 microgel para cada gota com poucas parelhas21 (Figura 4).
Na etapa final do fluxo de trabalho microfluidic (Figura 2), um dispositivo executa uma operação de fusão dupla combinação 1 gota de código de barras, 1 gota contendo microgel e a mistura de amplificação em um processo de duas etapas controladas. Primeiro, uma gota contendo o reagente PCR é emparelhada e fundiu-se com uma gota de código de barras na região mostrada em amarelo (Figura 5). Água salgados eletrodos no canal microfluidic produzem um gradiente de alto campo elétrico que desencadeia a fusão da gota. De forma semelhante, a primeira gota mesclada é emparelhada com um droplet microgel e fundiu-se uma segunda vez na região mostrada em vermelho. As gotículas são coletadas e térmica ciclada fora do chip em uma extensão de single-sobreposição (SOE) do PCR. As extremidades complementares sobreposição de código de barras e o DNA genômico de tagmented permitam fusão e amplificação exponencial das construções de código de barras somente corretamente.
Os dados de sequenciamento é primeiro filtrados por uma qualidade de leitura e analisados, em seguida, agrupando-se as leituras de acordo com sua sequência de código de barras de célula única 15-bp. Para um grupo de código de barras ser considerado válido, ele deve conter um número mínimo de leituras; Este limiarização limita a análise de células com uma quantidade útil de dados de sequenciamento e remove o código de barras do PCR-mutante "órfãos" do conjunto de dados. Neste exemplo executar, o mínimo é definido como 7,5 kbps por grupo (50 leituras de 150 bp cada). Um histograma dos Condes de código de barras contra o tamanho do grupo mostra que uma parcela significativa dos grupos de código de barras válido é um pouco acima do tamanho-limite (figura 6A).
Em um experimento de controle onde a composição da comunidade microbiana é conhecida, a pureza e abundância relativa métricas são usadas para avaliar a qualidade de um SiC-seq executar. Aqui, uma comunidade 10-célula sintética, consistindo de 3 bactérias Gram-negativas, 5 bactérias gram-positivas e 2 leveduras é analisada. A pureza de um grupo determinado de código de barras é definida como o número de leituras de mapeamento de genoma mais comuns no grupo dividido pelo número total de leituras do grupo. A grande maioria dos grupos de código de barras têm purezas maiores que 0,95 (Figura 6B). Abundância relativa dos tipos de célula é calculada contando o lê cru e contando os grupos de código de barras, onde os grupos são atribuídos um tipo de célula correspondente ao consenso de suas leituras de membro (Figura 6). A abundância de leituras e grupos de código de barras track em proporções aproximadamente iguais, indicando que as populações de células estão sendo amostradas tal que certas espécies não estão contidas no código de barras desproporcionalmente pequenos ou grandes grupos. Plotando a cobertura agregada de todos os grupos de código de barras de uma única espécie indica uma alta cobertura em todo o genoma inteiro, com poucos ou nenhum regiões de abandono (Figura 7). A uniformidade da cobertura pode ser verificada com uma distribuição de frequência dos valores normalizados de cobertura, com a maioria dos valores centrados em torno da média (Figura 7, de encastrar).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig1.jpg"> Figura 1 : Fabricação de dispositivos microfluídicos por fotolitografia. Mestre (A) moldes com uma altura de único recurso são fabricados pela spin, uma camada de fotorresiste SU-8 em um wafer de silício. O fotorresiste é então modelado com uma máscara fotolitográfica e luz UV, ligando o exposto SU-8. Finalmente, filmes SU-8 é dissolvida em um banho de desenvolvedor. O molde resultante é usado para converter PDMS que é ligado a uma lâmina de vidro para produzir o dispositivo microfluidic completa. (B) para um dispositivo de camada dupla, a fabricação da mesma forma começa com etapas de revestimento e exposição de rotação. Essas etapas são repetidas, em seguida, criar um dispositivo de duas camadas. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig2.jpg"> Figura 2: Visão geral do fluxo de trabalho SiC-seq. (A) A suspensão microbiana é co fluiu com agarose derretido em um dispositivo de dropmaker para encapsular células únicas em microgels. (B) os microgels estão sujeitos a uma série de lavagens para purificar o DNA genômico bacteriano. Líticas enzimas digerem as paredes celulares de bactérias gram-positivas e leveduras, e detergente solubiliza os restos celulares. Os microgels são re-encapsulados em gotas para o tagmentation reduzir a contaminação cruzada. (C) a fusão microfluidic combina um código de barras digital do PCR, um genoma de microgel tagmented e uma mistura de amplificação em uma taxa &gt; 1 kHz. Fora do chip SOE-PCR emendas a um código de barras único de célula única no genoma tagmented e seletivamente amplifica totalmente construções de código de barras. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig3.jpg"> Figura 3: Dispositivos microfluídicos para re-encapsulamento de dropmaking e microgel. (A), este painel mostra um fluxo de co dropmaker (25 µm de altura de recurso). Células e agarose fundido são introduzidos no aparelho com vazões iguais para produzir 25 µm gotas em uma junção de µm µm x 25 25. Para o dropmaking de código de barras digitais, a entrada da célula está conectada, e uma mistura PCR é introduzida na entrada de agarose. (B), este painel mostra um dispositivo de re-encapsulamento microgel (25 µm de altura de recurso). As microgels fluir para uma entrada em forma de funil para manter sua ordenação fechar-embalados e receber um volume de mistura de tagmentation antes do re-encapsulamento em um entroncamento de µm 25 µm x 30. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig4.jpg"> Figura 4 : Micrografias de gotículas e microgels. (A), este painel mostra lavada 25 µm microgels antes da lise enzimática. As bactérias são coradas fluorescentemente para a quantificação da taxa de encapsulação. Estatísticas de carregamento de Poisson ditam que as células devem ser encapsulados em uma taxa de 1 em cada 10 gotas ou menos para minimizar a frequência de eventos de múltiplo-encapsulamento. (B) este painel mostra uma imagem de microscopia de fluorescência de 25 µm de código de barras digital gotículas tratados com uma mancha de ácido nucleico. As gotículas contendo fragmentos amplificados barcode produzem um sinal forte fluorescência. (C) este painel mostra microgels re-encapsulado em gotas de 50 µm. A embalagem-perto do microgels permite taxas de encapsulamento se aproximando 1 gel por gota com poucas parelhas. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig5.jpg"> Figura 5 : Dispositivo de fusão dupla Microfluidic para código de barras do genoma de célula única. Uma operação de fusão de duas etapas de pares gotículas de código de barras com genomas de tagmented em uma alta produtividade. Primeiro, uma gota da mistura PCR é gerada e fundiu-se com uma gota de código de barras na região mostrada em amarelo usando eletrodos de água salgados. Em seguida, uma gota contendo um microgel é introduzida e fundiu-se uma segunda vez na região mostrada em vermelho. Entradas de óleo permitem um controle preciso do afastamento entre as gotas de reinjected. A câmara de reinjeção de código de barras e seu óleo espaçador são colocados na camada mais curta de 25 µm, sombreada em azul. Todas as outras características do dispositivo pertencem à camada mais espessa com 45 µm de altura total. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig6.jpg"> Figura 6 : Métricas de grupo de código de barras para uma comunidade microbiana sintética de 10 células. (A), este painel mostra a distribuição de código de barras de tamanhos de grupo. O número de grupos de um determinado tamanho diminui exponencialmente conforme o tamanho do grupo aumenta. Um limiar mínimo de 7,5 kbps por grupo limita a análise para grupos com uma quantidade suficiente de informações e remove a sequência de PCR-mutante "órfãos". (B), este painel mostra a distribuição do código de barras purezas do grupo. A grande maioria (&gt; 90%) dos grupos são de altíssima pureza (&gt; 95%). (C) este painel mostra a abundância relativa de 10 espécies calculado no nível de grupo de leitura e de código de barras. O 2 contagem métodos produzem resultados semelhantes, indicando que os tamanhos de grupo de código de barras são consistentes em toda a espécie. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig7.jpg"> Figura 7 : Agregar cobertura genômica de Bacillus subtilis grupos de código de barras. As leituras de todos os grupos de código de barras de mapeamento para a bactéria b. subtilis (N = 9.398) são agrupados e analisados em conjunto. Um mapa de cobertura circular ilustra a uniformidade da cobertura do SiC-seq diz: com regiões não observáveis desistente. Uma linha tracejada ao redor da circunferência indica a cobertura média (5,55 x). O histograma de inserção das frequências relativa cobertura mostra que a maioria das bases estão cobertas de profundidade perto da média de todo o genoma, representado pela linha tracejada. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig7large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Dispositivo</td>
			<td>1 altura de camada (µm)</td>
			<td>1ª camada Spin velocidade (rpm)</td>
			<td>Altura de camada 2 (µm)</td>
			<td>2ª camada Spin velocidade (rpm)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dropmaker de fluxo de co</td>
			<td>25</td>
			<td>4000</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
<tr>
<td>Re-encapsulante gel</td>
			<td>25</td>
			<td>4000</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fusão dupla</td>
			<td>25</td>
			<td>4000</td>
			<td>20</td>
			<td>5000</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: parâmetros de fabricação de dispositivo Microfluidic. Esta tabela mostra uma listagem dos dispositivos microfluídicos utilizados na SiC-seq fluxo de trabalho com suas velocidades necessárias para girar fotorresiste revestimento (com base nas especificações do fabricante para 3025 SU-8).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Rótulo</td>
			<td colspan="5">Sequência (5' &gt; 3')</td>
		</tr>
<tr>
<td>BAR</td>
			<td colspan="5">GCAGCTGGCGTAATAGCGAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGNNNNNNNNNNNNNNNTAAGCCAGCCCCGACACT</td>
		</tr>
<tr>
<td>DNA_BAR</td>
			<td colspan="5">CTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCCCACGAGACGTGTCGGGGCTGGCTTA</td>
		</tr>
<tr>
<td>P7_BAR</td>
			<td colspan="5">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCAGCTGGCGTAATAGCG</td>
		</tr>
<tr>
<td>P5_DNA</td>
			<td colspan="5">AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGTCGGCAGCGTC</td>
		</tr>
<tr>
<td>I7_READ</td>
			<td colspan="5">GCCCACGAGACGTGTCGGGGCTGGCTTA</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 2: Primer de sequências.
Arquivo suplementar 1: <a href="/files/ftp_upload/57598/Suppl_File_1-SiC-seq_device_masks.dwg" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Suplementar arquivo 2: <a href="/files/ftp_upload/57598/Suppl_File_2-centrifuge_syringe_holder_1mL.dwg" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Sequenciamento de célula única revela a heterogeneidade genotípica em sistemas biológicos, mas as tecnologias atuais não têm a produtividade necessária para a criação de perfil profundo de função e composição da Comunidade. Aqui, descrevemos um fluxo de trabalho microfluidic para sequenciamento > 50.000 monocelulares genomas de diversas populações de células.

Uma plataforma Microfluidic de ultra alta taxa de transferência para o sequenciamento do genoma de célula única

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...

O objetivo geral deste experimento é gerar dados de sequenciamento genômico com código de barras de dezenas de milhares de células únicas usando uma série de dispositivos microfluídicos. Este método alcança uma taxa de transferência de sequenciamento de célula única incomparável. Usamos microfluídica para encapsular, lisar e codificar células individualmente, preservando a heterogeneidade genômica subjacente, que é perdida no choque convencional em estudos de sequenciamento.A principal vantagem dessa técnica é que ela é de alto rendimento e capaz de produzir dados de uma única célula a partir de dezenas de milhares de células. Embora trabalhemos com micróbios nesta demonstração, o fluxo de trabalho pode ser adaptado para uso com diferentes tipos de células por meio de pequenas modificações nas dimensões do dispositivo microfluídico. Para iniciar o protocolo, prepare um mililitro de 3% de peso por volume de agarose de baixa temperatura de fusão em tampão 1X Tris-EDTA, ou TE.Mantenha a solução de agarose em um bloco de calor a 90 graus Celsius apenas até o carregamento da seringa. Ressuspenda as células em um mililitro de solução salina tamponada com fosfato, ou PBS, e gire as células. Aspire o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em um mililitro de 17% de volume a meio de gradiente de densidade de volume em PBS e mantenha as células congeladas até o carregamento da seringa.Em seguida, carregue uma seringa de três mililitros com óleo fluorado, ou HFE, contendo um surfactante PFPE-PEG de 2% em peso por peso. Encaixe-o com uma agulha de calibre 27 e coloque-o em uma bomba de seringa. Carregue a suspensão celular e a agarose derretida em seringas de um mililitro, ambas com agulhas de calibre 27, e coloque-as em bombas de seringa.Em seguida, coloque um aquecedor de ambiente no alto e posicione a superfície de aquecimento a 10 centímetros de distância da seringa. Certifique-se de que a temperatura medida na seringa é de aproximadamente 80 graus Celsius. Antes de inserir os tubos no dispositivo, prepare as bombas para remover o ar da linha.Conecte as agulhas da seringa às entradas do dispositivo microfluídico usando pedaços de tubo de polietileno ou PE. Conecte um pedaço de tubo à saída e coloque a extremidade livre em um tubo de coleta de 15 mililitros. Após a confecção, coloque o tubo de coleta a quatro graus Celsius por 30 minutos para garantir a gelificação completa da agarose.Remova a camada inferior de óleo do tubo de coleta usando uma seringa de três mililitros equipada com uma agulha de calibre 20, tomando cuidado para não perturbar a camada superior das gotículas de agarose. Adicione um mililitro de 10% de volume por volume de PFO em HFE para quebrar as gotas de agarose de sua camada de surfactante. Pipetar a solução para cima e para baixo durante um minuto para revestir completamente as emulsões, que devem ser homogéneas e isentas de grumos.Gire o tubo cônico a 2.000 vezes g por um minuto para coletar os microgéis de agarose. Aspire o sobrenadante PFO/HFE e certifique-se de que os microgéis estejam livres de sua camada de surfactante e estejam limpos. Depois de lavar os microgéis, verifique o encapsulamento celular nos microgéis sob um microscópio com uma ampliação de 400X, corando uma alíquota de 10 microlitros de géis com coloração de ácido nucleico 1X.Conecte a entrada de células de um dispositivo dropmaker de co-fluxo com um pequeno pedaço de solda de chumbo. Antes de inserir os tubos no dispositivo, prepare as bombas para remover o ar da linha. Conecte um pedaço de tubo à saída e coloque a extremidade livre em um tubo de PCR de 0,2 mililitro.Use as taxas de fluxo na tela para dropmaking. Colete as gotas nos tubos de PCR com aproximadamente 50 microlitros de gotas em cada tubo. Após a fabricação de gotas, remova cuidadosamente a camada inferior de óleo HFE das emulsões usando pontas de pipeta de carregamento de gel e substitua-a por óleo fluorado FC-40 contendo um surfactante PFPE-PEG de 5% em peso por peso.Em seguida, programe o ciclo térmico. Antes de inserir os tubos no dispositivo, prepare as bombas para remover o ar da linha. Conecte as seringas contendo HFE, mistura de marcação e microgéis às entradas do dispositivo microfluídico usando pedaços de tubo de PE.Conecte um pedaço de tubo à saída e coloque a extremidade livre em uma seringa vazia de um mililitro com o êmbolo puxado para a linha de um mililitro. Em seguida, verifique a taxa de encapsulamento do microgel sob um microscópio de luz com ampliação de 400X. Encaixe a seringa contendo as emulsões de marcação com uma agulha e incube-a na vertical em um bloco de calor ou forno por uma hora a 55 graus Celsius para fragmentar o DNA genômico.Prepare as gotículas de código de barras para a fusão substituindo a fração de óleo FC-40 por HFE 2% de peso por peso PFPE-PEG. Transfira cuidadosamente as gotas para uma seringa de um mililitro, encaixe-a com uma agulha e coloque-a em uma bomba de seringa. Carregue a seringa de gotículas de microgel incubada e etiquetada em uma bomba de seringa.Em seguida, conecte as três seringas de cloreto de sódio às duas entradas de eletrodo e à entrada de fosso único usando pedaços de tubo de PE. Antes de inserir os tubos no dispositivo, prepare as bombas para remover o ar da linha. Conecte as três seringas HFE montadas nas bombas às duas entradas de óleo espaçadoras e à entrada de óleo de gotejamento usando pedaços de tubo PE.Em seguida, dispare todos os tubos de reinjeção de gotículas com uma pistola antiestática antes de conectar o tubo às agulhas da seringa. Conecte a seringa de mistura de PCR, a seringa de gota de microgel e a seringa de gota de código de barras às suas respectivas entradas com tubo de PE. Conecte a agulha da seringa do eletrodo a um inversor fluorescente de cátodo frio usando um clipe jacaré.Defina a fonte de alimentação CC do inversor para dois volts. Execute o dispositivo de fusão dupla com as taxas de fluxo recomendadas. Colete as gotas em tubos de PCR com aproximadamente 50 microlitros de emulsão em cada tubo.Antes do ciclo térmico, remova cuidadosamente a camada inferior de óleo HFE das emulsões usando pontas de pipeta de carregamento de gel e substitua-as por óleo fluorado FC-40 contendo um surfactante PFPE-PEG de 5% por peso. Em seguida, programe o ciclo. Para recuperar o DNA das gotículas do ciclo térmico, agrupe as gotículas em um tubo de microcentrífuga e quebre as emulsões usando 20 microlitros de PFO.Vortex-los por 10 segundos para misturar. Gire o tubo. Remova cuidadosamente a camada aquosa superior do tubo usando uma pipeta e transfira-a para um novo tubo de microcentrífuga.Descarte a fase oleosa. Em seguida, prossiga para as etapas de preparação, sequenciamento e análise da biblioteca. Um histograma das contagens de código de barras versus o tamanho do grupo mostra que uma parte significativa dos grupos de código de barras válidos está logo acima dos pares de 7,5 kilobase por tamanho limite de grupo, o que exclui os órfãos mutados por PCR.A abundância relativa dos tipos de células de uma comunidade sintética de 10 células de três bactérias gram-negativas, cinco bactérias gram-positivas e duas leveduras foi calculada contando as leituras brutas e os grupos de código de barras. Um mapa de cobertura circular de leituras de B.subtilis de todos os grupos de códigos de barras ilustra a uniformidade das leituras de SiC-seq, sem regiões de abandono observáveis, onde a cobertura média foi de 5,55X. A uniformidade da cobertura foi verificada com uma distribuição de frequência dos valores de cobertura normalizados.Ao tentar este procedimento, é importante manter uma taxa de encapsulamento de cerca de um código de barras ou célula para cada 10 gotículas. Isso limita a probabilidade de um evento de encapsulamento duplo, que pode contorcer os dados de célula única. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como configurar e operar os dispositivos microfluídicos usados para gerar dados de sequenciamento de célula única.Uma vez dominada, essa técnica pode ser executada em oito horas ou duas quatro horas por dia.

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Bioengineering

Bioengenharia

Aqui nós descrevemos um otimizado multiplex da transcriptase reversa PCR quantitativo protocolo (qRT-PCR) em combinação com uma plataforma microfluídica como ferramenta de triagem de custo e tempo efetivo de alto rendimento para microRNA (miRNA) níveis de expressão, especialmente quando se trabalha com quantidades limitadas de amostra.

Profiling MicroRNA de Alto Rendimento: Multiplex Optimized qRT-PCR em Escala nanolitros no IFCS Fluidigm dinâmico ArrayTM

Apresenta-se um método de microfluidos para a expressão de arrays de proteínas. O dispositivo consiste de milhares de câmaras de reacção controladas por válvulas de micro-mecânicos. O dispositivo micro é acoplado a uma biblioteca de genes microarray-impresso. Estes genes são transcritos e traduzidos em seguida, on-chip, resultando numa matriz de proteína pronta para o uso experimental.

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Nós desenvolvemos uma cultura de células automatizado e uma plataforma de interrogação para experiências de estimulação de células micro-escala. A plataforma oferece um controle simples, versátil e preciso para cultivar e estimular pequenas populações de células e recuperar lisados ​​para análises moleculares. A plataforma é bem adequado para os estudos que utilizam células preciosos e / ou reagentes.

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Neste artigo apresentamos um chip microfluídico para análise única célula. Ele permite a quantificação de proteínas intracelulares, enzimas, co-factores, e os segundos mensageiros, por meio de ensaios fluorescentes ou imunoensaios.

Um chip microfluídico para a Versátil Análise Química de células individuais

Este protocolo descreve uma arquitetura de sistema para realizar separações automatizadas de partículas de pequeno volume (0,15–1,5 ml) usando um dispositivo microfluídico e discute métodos para otimizar o desempenho e a operação do dispositivo acustofluídico.

Uma plataforma microfluídica para processamento de precisão de pequeno volume de amostra e respectiva utilização para Tamanho partículas biológicas separadas com um microdispositivos Acústico

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar e cultivar células únicas com uma plataforma microfluídica, que utiliza um novo conceito de design de micropoços para permitir o isolamento de célula única de alta eficiência e cultura clonal de longo prazo.

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O sequenciamento de nanopore é uma nova tecnologia que permite o sequenciamento econômico em locais remotos e configurações pobres em recursos. Aqui, nós apresentamos um protocolo para arranjar em seqüência dos mRNAs do sangue inteiro que é compatível com tais circunstâncias.

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Descreve-se o processo de fabricação de um dispositivo microfluídico baseado em PDMS, multicamada, que permite a realização de reações in vitro de transcrição e tradução (IVTT) durante períodos prolongados. Além disso, uma visão geral abrangente do hardware e software necessários para automatizar e manter essas reações para durações prolongadas é fornecida.

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Apresentamos um sistema microfluido para estudos de alto rendimento em máquinas de vida complexas, que consiste em 1500 unidades culturais, uma matriz de bombas peristálticas aprimoradas e um módulo de mistura no local. O chip microfluido permite a análise das condições microambientais altamente complexas e dinâmicas in vivo.

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As células tumorais circulantes (CTCs) são críticas para o estudo da progressão e metástase do câncer. Este artigo apresenta um protocolo integrado de alto rendimento para enriquecimento de CTC e sequenciamento de CTC única, melhorando a eficiência de captura e a pureza da CTC, reduzindo os custos de contaminação e sequenciamento, avançando assim na pesquisa de oncologia de precisão e aplicações clínicas.

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